细胞周期分析重要知识.

细胞周期生物学基础细胞的生成依赖于细胞的分裂而产生两个子代细胞的过程。

在分裂过程最需要复制并传递给子代细胞的是细胞核，因为它包含了细胞的遗传信息载体-DNA。

在绝大多数情况下，一个生物体的每个细胞都含有相等的DNA物质和相同成份的染色体。

因此，细胞在分裂前必须复制DNA这样它的子代细胞就能够拥有与父代相同的DNA含量。

细胞由DNA含量增加至分裂，再由它的子代继续复制并分裂，这个过程称之为细胞周期。

在细胞周期中最具特征性的阶段是在分裂前的DNA含量增加并达到2倍量的时候，并在此时细胞开始分裂其自身-有丝分裂期。

细胞周期中这两个循环步骤通常以一字母来表示：S期（合成期）和M期（有丝分裂期）。

当细胞周期中的S期和M期被定义后，我们可观察到在有丝分裂完成后和DNA合成刚开始之时有短暂的停顿或间隙，同样的停顿或间隙存在于DNA合成期后和有丝分裂开始之时。

这两个间隙我们将之命名为G1和G2期。

这样整个细胞周期可划分为G1 →S →G2 →M →G1，如下图所示：图1显示了细胞周期中个环节在流式细胞仪上分析时的图谱特征当细胞没有进入分裂过程时（我们机体中的绝大部分细胞），它们处于细胞周期的G1期的位置上。

因此G1细胞在数量上绝对是居各期细胞之首并在流式图谱上形成最高的信号峰。

在G1期细胞中有一群细胞特别安静并且没有进入细胞循环的任何生物学特征，我们称这些细胞为G0期细胞。

一些发生在G1和G2期细胞内的生物过程现还不完全明了。

处于G1期的细胞已开始为分裂前的DNA的复制和细胞成长准备许多RNA和蛋白分子。

处于G2期的细胞则会修复在DNA复制过程发生的错误并识别出在M期时将DNA平均等分的切割位置。

细胞循环中这些阶段的长度因细胞种类的不同而不同。

典型细胞循环中各期的发展时间为：G1期12小时，S期6小时，G2期4小时及M期0.5小时。

分析和流式细胞术细胞周期分析流式细胞最初的应用之一便是检测细胞的DNA含量，它可快速将细胞循环中的其它阶段与有丝分裂期区别开来。

这些检测是基于对细胞内DNA以化学定量方式的染色（染料着色数量直接与细胞内DNA含量相关）。

有相当多的对DNA有高亲合力的染料可用于此应用。

而不同的染料与DNA分子结合的位点不同。

现用得最多的两种DNA结合染料是蓝光激发的碘化匹啶（PI）（或偶尔也有用EB）和紫外激发的DAPI和Hoechst染料33342和33258。

PI染料是一种插入性的与双链DNA和RNA（当要特异地检测DNA时，经常使用RNAse去除RNA）结合，而DAPI和Hoechst染料仅与DNA的螺旋结构的亚级凹槽结合并与RNA完全没有任何结合。

Hoechst 33342是现唯一令人满意的能对活细胞DNA 时行染色的染料。

其他一些染料在染色前需要破坏细胞膜，故经常使用去污剂或低渗溶液处理或溶剂进行固定（酒精）。

*注意：使用溶剂进行固定（如酒精）经常会引起细胞聚集，详情见分析细胞聚集。

当运用DNA结合荧光染料后，可观察到一个有特征的图谱，那就是由各种细胞组成的一个细胞周期分布图。

当二倍体细胞被化学定量式DNA染料着色后并在流式细胞仪上分析，会观察到一个很“窄”荧光峰。

它将出现在以荧光强度为X轴、细胞数量为Y轴的坐标上。

因为种种原因G1期细胞具有相同的DNA含量，理论上G1期细胞的DNA含量荧光强度应当一致，并在直方图上的一个通道上出现信号（如图2.2A中，在直方图上出现一条G1期细胞的荧光直线）。

图2.2分别显示了一个理想状态中一台完美的流式细胞仪无偏差检测的直方图（A）和实际分析得到的呈高斯分布的直方图（B）。

在B图中，使用Dean 和Jett 多项式S期分析模型进行分析识别出的G1、G2和S期细胞分布。

如果流式细胞仪十分完美且DNA染料的特异性绝对专一，这种情况将会发生。

而在实际中，流式细胞仪本身存在着许多变异性，此外DNA染料的着色也存在生物学的变异。

因此，检测得出的G1期细胞的荧光分布正常的是呈高斯曲线分布。

这种“钟”型分布与检测的变异相关（图2.2B）。

检测中的变异越大，高斯曲线的宽度越宽。

有一个名为“变异系数”（CV）的指标用于描述峰的宽度。

CV是一种规格化的标准差，定义为CV=100*标准差/平均值。

相类似，G2和M期细胞它们拥有两部的正常G1期细胞的DNA含量，从而在直方图上形成一个两倍于G1信号峰D.I.2.0的高斯峰（见图2.2）。

实际上，G2/G1的比值常小于2.0，可能是因为G2期细胞的DNA-蛋白（染色质）聚集得更紧密或更浓缩。

从而DNA染料着色时与DNA位点的结合能力被削弱。

最常见的G2/G1的比值是1.97。

在理论上的完美流式细胞仪上检测时，S期细胞将分布自所有G1期细胞直方图右侧并一至延伸到所有G2期细胞直方图的左侧。

因为细胞一旦开始进入S期便会开始合成DNA，并紧帖着G1期细胞开始向外延伸。

而后DNA含量不断增加直至完成S期阶段进入G2期。

不幸的是，实际中的直方图分布并不是如此简单，这是因为G1、G2期的DNA峰分布并直线，而是有宽度的高斯分布，而S期分布则更宽。

所形成的结果是早期S期细胞与G1期细胞相互叠加，而后期S期细胞与G2期细胞相互叠加。

区分这些叠加细胞而计算出正确的G1、S和G2期细胞是以下章节讨论的内容。

二倍与异倍体细胞的DNA含量正如前面介绍的那样，机体所有的G1期细胞，极少例外，都具有相同的DNA含量和染色质结构。

在哺乳动物中，每个染色体具有两条构成。

这在细胞遗传学者认为是具有“双重DNA含量”（根据实际观察到的染色体数量）的细胞，并且定义了“2N”来描述它们（N是指单个染色数量，单倍染色体的DNA含量）。

而流式细胞仪通常也有相关的术语来描述：“DNA指数（D.I.）1.0”来指代这些G1期细胞的DNA含量。

具有其他DNA含量的细胞并意味着一定是属于异常，如以上介绍的S期和G2细胞和仅有单倍染色体生殖细胞，及一些在体内具有四倍DNA含量（D.I.2.0）的细胞（其他例外情况，如存在少数多核细胞）。

所有这些细胞的DNA都具有“整倍”关系，它们之间的差别都是以完整的染色体组为单位的，而这些染色体组中的各染色体都拥有其自身的完整性。

任何DNA含量异常的细胞其染色体组首先发生的异变或致少染色体的结构发生了改变，这们将这些细胞称为“异倍”DNA含量（针对于整倍体之言）。

因为整个细胞或细胞核DNA流式细胞仪无法确切检测出染色体数量，流式细胞仪无法确定哪些是DNA指数为1.0的正常细胞，所以要使用已知样本来事先定义二倍体细胞。

同样的，当细胞的DNA指数为2.0时我们称之为G2期细胞，或四倍体细胞或一个拥有异常DNA 含量的异倍体细胞。

在流式细胞仪进行检测时，它的位置事先也要精确地进行定义。

流式细胞仪通过观察DNA指数为非1.0整倍的细胞而能检测出染色体的变化，但这些细胞的染色体的结构和数量必须发生了改变。

因为名词“异倍体”实际是指通过染色体来确认的，当我们通过流式细胞仪检测DNA含量来发现它们时，要以“DNA-异倍体”来形容它们。

DNA异倍体细胞通常，但非绝对，与恶性组织有关系。

但一些例外情况必须注意，如一些良性肿瘤（如内分泌腺肿瘤）和恶变前的上皮细胞。

当一个恶性肿瘤通过流式细胞仪DNA-异倍体峰检测出来时，直方图分析时会发现在肿瘤中异倍体细胞与二倍体细胞相互混合。

二倍体细胞包括淋巴细胞、内皮细胞、纤维原细胞和一些基质成份，它们经常在样本中占一定的数量。

肿瘤和基质细胞都会有部分细胞正在进行细胞循环过程，经历着G1 →S →G2 →M期（基质细胞的S和G2期细胞数量通常比恶性细胞的要少得多），所以此时得到的DNA直方图通常是由两个细胞循环相互叠加构成的，但MultiCycle和ModFit都有专门的模型对它们进行分析。

细胞周期分析和DNA含量直方图DNA直方图要求数学方法来进行分析目的是精确地识别出被覆盖的G1、S和G2期细胞的分布；这些分析方法已经历了过去二十多年的发展与完善。

从DNA含量直方图中提炼出细胞周期图的方法也从简单的图形识别发展到更为复杂的曲线拟合。

所有简单分析方法都是基于G1和G2期细胞与S期之间叠加很少，G1和G2期细胞数量与直方图上检测到的G1、G2期数量接近的假设。

有两种具体计算方法。

第一种是通过计算G1期曲线的左半部分和G2期曲线的右半部分，然后翻倍后得出G1、G2期细胞，而剩余部分便是S期细胞。

第二种方法是只利用最中间的S期细胞分布，并向左侧G1期平均荧光强度和右侧G2期平均强度延伸而计算出S期细胞。

而左、右侧剩余部分便分别是G1和G2期细胞。

这些方法仅在只有一个细胞循环周期的直方图上才能得出比较准的结果。

以上两种方法都假设G1和G2峰是左右对称的（实际上不同组织染色后并不形成这种对称峰）并且两峰的中间点能够被精确地识别出来。

然而由于G1和G2峰与S期峰总是相互叠加的，所以这些峰的平均值往往并不在它们的最高点上，特别是G2峰。

如果存在第二个细胞周期时，两种周期的细胞相互叠加从而使这种分析方式变得很不可靠。

此外，在这种简单的图形分析方法通常不对细胞碎片和细胞聚集建立模型进行排除。

更具柔性和精确的细胞周期分析方法是基于用数学方法构造出的DNA含量分布图，然后使用曲线拟合方法将这些模型与数据进行匹配。

建立得最好的模型是由Dean和Jett在1974年通过预言细胞周期直方图是呈高斯分布的理论而建立的。

相互叠加的G1、G2峰和S峰可用高斯曲线重新被描述出来。

在最初的提议中，增宽的S期分布是由一个光滑的二次幂抛物线方程来描述的（抛物线的一个部分，y = a + bx + cx2）。

这个模型可以被简化为一次幂曲线（一个增宽的梯型，如以一条直线方程，y = a + bx）或零度斜线（一个增宽的矩型，直线模型，y = a）来拟合。

当直方图的质量与理想中相差太大时，特别是G1或G2峰不呈高斯曲线分布时（底部增宽，倾斜或存在肩峰），简化模型可减少引起G1、S、G2峰叠加的影响。

正如下面章节将要讨论的那样，这种情况经常出现在临床样本中。

在这种情况下，建意使用保守的零次幂或一次幂来拟后S期，除非对直方图的质量高度可靠可选用二次幂。

有些实验驱动形成的S期（通常是培养细胞）分布将会更复杂些，一些可选的分析模型可运用于这些分布。

最为适合的模型是将S期切割成一系列的高斯曲线，然后计算这些曲线的和。

在这个模型中，每个高斯曲线都可达到任意高度。

因此S期可被完全地描述出来，故此模型适用于一些复杂的S期图型。

以上这些模型的优点也是在实践中的主要缺点。

相当灵活的描述S期峰型时会将任何人为造成的假数据也描述出来，并且还会增加近G1、G2期端的S期区域模糊性。

一个比较折中的解决办法是由Fox (1980)提出的，他在Dean和Jett的多项式S期模型中再增加了一个高斯曲线。