影响农杆菌介导的小麦遗传转化条件的研究
16143666_农杆菌侵染条件对玉米单倍体遗传转化的影响
利用转基因技术对农作物性状进行改良是目前转基因技术在农业上的重要应用，该技术可以突破物种间的遗传障碍、跨越物种间的不亲和性、丰富作物的基因资源，从而达到改良农作物性状的目的[1]。
转基因玉米是全球种植面积较大、商业化较早的转基因作物之一，其遗传转化一直备受人们关注[2~8]。
到目前为止，虽然对农杆菌介导玉米的遗传转化有很多报道，但大多以幼胚等二倍体为受体材料，且转基因植株需经若干代的自交筛选才能得到纯合的转基因植株，育种程序复杂。
随着单倍体和转基因技术的成熟，国内外开始了以单倍体为受体的转基因研究，并且在小麦[9]、水稻[10]、烟草[11]和亚麻[12]等植物上得到了成功应用。
玉米的胚芽鞘[13]和茎尖组织[14]等单倍体受体也已经实现了基因转化，但由于植株生长势弱，移栽不易存活，因而未能成为主流的转基因受体。
陈琦[15]利用玉米单倍体幼胚和成熟胚为受体材料进行转基因研究，开拓了单倍体转基因的新方向。
玉米单倍体的遗传转化是一个复杂过程，受到多种因素的影响。
侵染条件的优化对提高其转化效率具有重要作用。
通过继代可以让愈伤组织长时间保持胚性，而胚性愈伤组织是进行侵染的先决条件。
截至目前，该方面的报道内容多集中于如何高频率地诱导愈伤组织，而对于继代条件的研究很少。
菌株选择是影响转化效率的关键。
农杆菌菌株的侵染力在不同玉米基因型之间存在很大差异，因而，不同的玉米自交系对应存在着最为敏感的农杆菌菌株[16]。
权瑞党等[17]和庄志扬等[18]认为，高浓度的农杆菌有利于玉米细胞转化，但菌液浓度过高会导致转化率降低。
侵染时间过短，农杆菌未吸附或吸附的农杆菌少，会导致转化赵爱菊，陈希勇，高增玉，王江浩*（河北省作物遗传育种实验室，河北省农林科学院粮油作物研究所，河北石家庄050035）摘要：以玉米诱导系HHI69诱导玉米自交系获得的单倍体愈伤组织为受体材料，GUS 基因为报告基因，采用农杆菌介导法进行遗传转化，对影响转化效率的侵染条件进行了研究。
生物学中的植物遗传转化与基因编辑技术
生物学中的植物遗传转化与基因编辑技术植物遗传转化与基因编辑技术在生物学中的应用植物遗传转化与基因编辑技术是生物学领域中的重要研究方向，它们可以用于改良植物品种、提高农作物产量和抵抗力、开发新型植物药物等。
一、植物遗传转化技术的原理和方法植物遗传转化是指将外源基因或DNA片段导入植物细胞，并使其稳定地遗传给后代。
常见的植物遗传转化方法包括农杆菌介导的遗传转化、基因枪法和凯南法等。
1. 农杆菌介导的遗传转化农杆菌介导的遗传转化是最常用的植物遗传转化方法之一。
该方法利用土壤中广泛存在的植物病原性农杆菌将外源基因导入目标植物细胞。
首先，将外源基因插入农杆菌质粒的T-DNA区域，然后将农杆菌通过注射或浸泡等方式导入植物细胞。
在遗传转化后，利用选择标记基因或报告基因进行筛选和检测。
2. 基因枪法基因枪法是将DNA载体以高速射击的方式直接导入植物细胞。
将外源基因负载在金粒等微粒表面，然后使用高压氦气或火药等加速器将其射入植物细胞。
在转化后，通过培养基中的选择性筛选剂来筛选转化的细胞。
3. 凯南法凯南法是一种基于物理和化学手段的遗传转化方法。
通过利用聚乙烯醇（PEG）或电击等方法，使DNA能够与植物细胞质融合，然后通过培养和筛选等步骤来获得转化的植物细胞。
二、基因编辑技术在植物遗传改良中的应用基因编辑技术是指通过精确地修改植物基因组中的特定位置，实现遗传改良的方法。
常见的基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALENs和ZFNs等。
1. CRISPR-Cas9系统CRISPR-Cas9系统是一种高效、快速和精确的基因编辑技术。
它利用CRISPR RNA（crRNA）和转录单元RNA（tracrRNA）组成的复合物与Cas9蛋白结合，以形成靶向特定基因序列的复合物。
在植物中，CRISPR-Cas9系统被广泛应用于基因敲除、基因敲入和基因修饰等方面。
通过将CRISPR-Cas9系统导入植物细胞，可以实现对植物基因组的精确编辑。
2021届江苏省苏锡常镇四市高三下学期3月调研考试(一模考试)理科综合生物试卷及答案
2021届江苏省苏锡常镇四市高三下学期3月调研考试（一模考试）理科综合生物试卷★祝考试顺利★(含答案)本试卷满分为100分，考试时间为75分钟一、单项选择题：共14题，每题2分，共计28分。
每题只有一个选项最符合题意。
1.下列关于元素和化合物的叙述，错误的是A.DNA和ATP中的氮元素都存在于碱基中B.人体血浆中含有的糖包括葡萄糖、果糖和半乳糖等C.碳链是淀粉、脂肪、蛋白质等有机物的基本骨架D.构成血红蛋白的某些氨基酸中含有硫、铁等元素2.研究发现一类称做“分子伴侣”的蛋白质可识别正在合成的多肽或部分折叠的多肽，并通过改变自身空间结构与多肽的某些部位相结合，从而帮助这些多肽折叠、组装或转运，其本身不参与组成最终产物并可循环发挥作用。
下列叙述正确的是A.乳酸菌内“分子伴侣”发挥作用的场所可能在内质网上B.“分子伴侣”介导加工的直链八肽化合物中至少含有9个氧原子和8个氮原子C.“分子伴侣”的空间结构一旦发生改变，则不可逆转D.变性后的“分子伴侣”不能与双缩脲试剂发生作用产生紫色反应3.我国科学家将酿酒酵母的16条染色体去除冗余的重复基因信息和结构，重新设计为1条染色体，并将这条染色体移植到去核的酿酒酵母细胞中，发现细胞仍然能存活，这是国际上首次获得的人工创建的具有单条染色体的酵母细胞。
下列叙述正确的是A.酿酒酵母不会发生细胞分化和基因选择性表达B.设计该条染色体时需要使用限制性核酸内切酶和逆转录酶C.设计该条染色体时可能需采用基因编辑技术敲除15个着丝粒D.该酵母在呼吸作用时释放的能量只有少部分转化为热能4.大多数离子泵是一种具有ATP水解酶活性的载体蛋白，它在跨膜运输物质时离不开ATP的水解。
下列叙述错误的是A.ATP可以为细胞中绝大多数生命活动直接提供能量B.物质通过该类离子泵跨膜运输的方式属于主动运输C.动物一氧化碳中毒会降低离子泵跨膜运输离子的速率D.Na+-K+泵使大量Na+内流从而产生动作电位5.酶是重要的生物催化剂。
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥一、实验目的1.了解浸花法(floral tip)转化的机理；2.掌握拟南芥浸花法(floral tip)转化的技术二、实验原理拟南芥的花序大量产生时，将其在含有转化辅助剂silwet和蔗糖的农杆菌溶液中浸泡20秒，3-4周后对转化植株收种子。
在含有合适抗生素的平板上对种子进行筛选，能够健康生长的幼苗为转基因植株。
三、实验材料及仪器材料：生殖期的拟南芥植株，含目的基因质粒的农杆菌(PCAMIBIA 3301-ZEP)，无菌滤纸仪器设备：超净工作台，恒温摇床，培养箱，台式高速离心机，涡旋仪，抽滤器，高压灭菌锅，电子天平，酸度计，培养室用具：微量移液器，金属药匙，牙科手术钩或细菌涂布器，100 ml无菌三角瓶，直径9 cm 培养，200 ml及1ml tip枪头，枪形镊四、实验步骤1)当野生型株系的拟南芥植株生长了个月左右。
将其主薹剪掉，待其次生薹长出，浸染前剪掉植株上的果荚和已经完全开放的花；2)将农杆菌菌液扩大培养接入到250 ml含有50 μg/ml的Kan和Rif的YEP的液体培养基中:3)将装有250 ml YEP液体培养基的500 ml三角瓶置于28℃ 200 rpm下振荡培养24 h;4)分批次将250 ml YEP液体培养基装在50 ml离心管中多次离心，每次7500 rpm离心5 min,直到把所有的农杆菌都聚集在管底；5)用5%的蔗糖溶液。
其中加了0.02%-0.05% (VV)的silwet L-77来重新悬浮聚集在管底的农杆菌，直到把浓度稀释到OD600为1.5左右即可；6)把蔗糖溶液重悬的农杆菌菌液放入50 ml 离心管中，将花盆倒转过来，将花序浸入农杆菌中20 s，轻轻转动和晃动植物，保证腋芽生长的花都能浸到液体溶液中，取出后能看见植物上有一层水膜，轻轻晃动植物3-5 s抖掉过多的液体(花在液体中浸泡时间过长有所伤害)。
7)浸染过得植株放置在塑料盆中并用一个高的遮光的袋子遮住植株以保持其湿度,并将盆置于弱光或黑暗的条件下一天；8）将其遮光袋拿去，移到智能气候室培养，并定期补浇营养液，直到角果成熟收获种。
农杆菌介导的番茄遗传转化体系建立
农杆菌介导的番茄遗传转化体系建立摘要：农杆菌介导的遗传转化受基因型、转化受体、菌液浓度和侵染时间、预培养、筛选剂、转化体的筛选和鉴定等多方面因素的影响。
本文旨在通过分析侵染时间、预培养、共培养、筛选压等因素对农杆菌介导的番茄遗传转化的影响，建立理想的番茄遗传转化体系。
关键字：农杆菌；遗传转化；转基因植株；番茄农杆菌介导的遗传转化是目前应用最广泛的遗传转化方法。
影响农杆菌介导的番茄遗传转化因素主要有：（1）基因型：转化频率与植物基因型具有很大关系，即使在转化频率比较高的植物中（如马铃薯、烟草、拟南芥等）也有很大的基因型依赖性。
这主要是由于不同基因型对农杆菌的敏感程度不同而引起的（梁美霞等，2004）。
张赛群（1999）研究发现不同品种间转化频率有很大差别，实验中品种A57的转化率高达11.70%，而A10的转化率仅为1.10%。
（2）转化受体：转化受体通常来自于植物的原生质体及外植体组织。
外植体组织包括子叶柄、子叶、下胚轴、茎段等。
Plastira等（1997）与欧阳波等（2002）报道番茄下胚轴是良好的转化受体,试验中采用番茄下胚轴作为外源基因的转化受体，表现出一些优势，如：下胚轴的再生比子叶要快，转化后再生芽的出现一般比子叶要早一两周。
而王慧中等（1995）用番茄下胚轴和子叶进行遗传转化时发现，子叶的转化率比下胚轴高，子叶的转化率为35.24%，下胚轴为33.67%。
（3）菌液浓度和侵染时间：菌液浓度和侵染时间是影响转化效率的重要因素之一。
对不同植物的外植体而言，菌液浓度也有一定差异。
对于农杆菌敏感的植物，因其易产生过敏反应而导致外植体切口处褐化，因此宜采用较低的OD值和较短的浸泡时间。
如果外植体在菌液中浸泡时间太长，常因农杆菌毒害缺氧而软腐，同时外植体在培养过程中也容易产生农杆菌污染；而若浸泡时间太短则因尚未接种到伤口面，不能转化。
关于侵染时间，不同的学者采用不同的侵染时间，从30 s到 30 min都有，这可能是因为品种间存在差异。
农杆菌转化原理及技术
农杆菌侵染过程
❖ 损伤的植物细胞产生植物酚类作为农杆菌的侵染信号;
❖ 这些化学诱导物透过农杆菌的细胞膜,活化virA和 virG 基因,再诱导Vir区的其他基因;
❖ Vir基因的活化,作用于T-DNA的加工及T-DNA的转移; ❖ T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上; ❖ T-DNA在植物细胞中表达产生冠瘿碱及植物激素; ❖ 农杆菌Ti质粒上有专一性的冠瘿碱分解酶基因(ocs),该基
❖ 5.愈伤组织的筛选
❖ 将愈伤转移至选择培养基筛选抗性愈伤，每两周转 接1次。
抗性愈伤
非抗性愈伤
❖ 6.抗性愈伤组织的继代与植株的再生
❖ 每两周将愈伤转移至新选择培养基上，约需三周即 可见瘤状鲜黄色抗性愈伤从褐化干瘪的愈伤中长出。 待愈伤长大后挑选抗性愈伤的一部分转移至分化培 养基上。2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼芽， 随后根也长出。将幼苗移至生根培养基上，每培养 瓶1个克隆。待幼苗生根长成后，移出培养瓶，洗 净根上的培养基后，移至温室盆栽。
❖ 1.诱导培养基：NB+2,4-D2 mg·L-1 ；pH 5.8-5.9。 ❖ 2.预培养培养基：NB+2,4-D2 mg·L-1 ；pH 5.8-5.9。 ❖ 3.共培养培养基：NB+2,4-D2 mg·L-1 +AS100 µM·L-1 ；pH 5.2。 ❖ 4.选择培养基：NB+2,4-D 2mg·L-1 + 羧苄青霉素 250mg·L-1 + Hyg
+ cytokinin
This procedure is easy for dicotyledone plants
(legumes etc)
Agrobacterium tum efaciens
农杆菌介导法
农杆菌介导法实验九植物遗传转化——农杆菌介导法⼀、⽬的了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化⽔稻的技术⼆、原理根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能⼒。
下列因⼦与转化过程有关：1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA)T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的⼀段DNA序列。
T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作⽤元件。
不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。
置于该边界内的任何外源基因均可被转化。
LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能⼒丧失，这时⼏乎完全没有T-DNA的转移。
LB（－链）5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’RB（＋链）5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵⼦转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。
其中蛋⽩VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强⼦；VirD2在T-DNA底链起内切酶作⽤造成切刻，并与T－链5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA 结合蛋⽩，有2个NLS。
该操纵⼦的表达顺序如下：vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋⽩→VirA被植物创伤信号分⼦激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。
3. 农杆菌染⾊体基因组相关基因：chv A、chv B（农杆菌运动、附着）、chv D、chv E（编码单糖结合蛋⽩、趋化性）、pscA、att、cel（合成纤维素丝，附着）。
遗传转化的方法和技术
遗传转化的方法和技术常见的遗传转化方法和技术包括农杆菌介导法、基因枪转化法和聚乙二醇-介导法等。
其中，农杆菌介导法是植物基因转化中使用最普遍的一种方法。
其Ti质粒具有将DNA整合到植物染色体上，并使之与植物内源基因同步表达的能力。
农杆菌介导法的具体步骤如下：1. Ti质粒的构建：利用农杆菌进行遗传转化前，必须对Ti质粒进行改造。
改造的目的有以下几点：去除T-DNA区的激素基因，因为激素基因的产物会导致转化细胞激素水平的不平衡而引起细胞的无限分裂，阻碍正常植株的再生。
保留T-DNA区的左右边界，尤其是左边界，以保证T-DNA的正常转化。
在去除的T-DNA区，增加至少一个可以在植物体内表达的选择基因，以使转化细胞易于被检测出来。
在T-DNA区外加一个可以克隆外源目的基因的多聚接口。
在T-DNA区外加一个抗菌素基因标记质粒，该基因只能在细菌中表达，而不能在植物中表达。
2. 外源基因的转化：除Ti质粒外，发根农杆菌的Ri质粒也已成为植物基因工程载体家庭中的新成员。
发根农杆菌感染植物伤口，向目的植物转入Ri质粒中的T-DNA，经一段时间后被感染的植物会在不定的部位生出发状根。
发状根没有向地性，可在无激素的培养基上培养生长，生长迅速并产生许多分枝，其增长速度一个月可增殖数倍到数百倍。
发根农杆菌对植物的这种作用主要依赖于其菌体中的Ri质粒。
例如通过发状根培养来生产只有在高度的根趋向分化细胞中才能产生的有用次生代谢物质等。
3. 外源基因的转化：一般而言，农杆菌只感染双子叶植物；但利用Ti质粒作载体已将外源基因导入了水稻、玉米、吊兰、石刁柏、香蕉等某些单子叶植物中。
农杆菌介导的遗传转化技术简单，易于掌握，对植物受体要求不严，绝大多数双子叶植物和少数单子叶植物的组织或器官均可，且转化频率较高，转化周期较短，是目前应用最广的一种植物遗传转化方法。
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研究报告 贺杰等：影响农杆菌介导的小麦遗传转化条件的研究 影响农杆菌介导的小麦遗传转化条件的研究 贺杰 ， 王伟 ， 胡海燕 ， 赵俊杰 ， 校现周。 （１．河南科技学院，河南新乡４５３００３；２．中国热带农业科学院橡胶研究所，海南儋州５７１７３７）
摘要：利用小麦成熟胚愈伤组织的高效再生体系，对影响农杆菌介导的小麦遗传转化条件：预培养时间、共培养时间、抗 生素（Ｋａｎ）筛选压、头抱霉素浓度、茵液浓度和侵染时间等进行了研究。最后确立的转化条件为：预培养时间为１～２ ｄ， 共培养时间为３ ｄ，Ｋａｎ筛选压为１００ ｍｇ／Ｌ，头孢霉素所用浓度５００ ｍｇ／Ｌ，当菌液浓度ＯＤ６００＝０．６浸染４５ ｍｉｎ。并对得到 的再生植株进行了ＰＣＲ检测，初步证实了目的基因转到了小麦基因组中。 关键词：小麦；农杆菌；遗传转化 中图分类号：Ｓ５１２．１ 文献标志码：Ａ 文章编号： １００１－４７０５（２０１０）０５－０００５－０４
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｗｈｅａｔ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
ＨＥ Ｊｉｅ ，ＷＡＮＧ Ｗｅｉ ，ＨＵ Ｈａｉ．ｙａｎ ，ＺＨＡＯ Ｊｕｎ－ｊｉｅ ，ＸＩＡＯ Ｘｉａｎ－ｚｈｏｕ （１．Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｈｅ’ｎａｎ ４５３００３，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｄａｎｚｈｏｕ Ｈａｉ’ｎａｎ ５７１７３７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ｗｈｅａｔ，ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｕｓｉｎｇ ａｎｄ ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ— ｕｍ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．Ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｓｕｃｈ ａｓ ｐｒｅ—ｃｕｌｔｕｒｅｄ，ＣＯ—ｃｕｌｔｉ— ｖａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ，Ｃｅｆ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗａｓ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ：ａｆｔｅｒ ｐｒｅ—ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｏｒ １ ｔｏ ２ ｄａｙｓ，ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｄｉｐｐｅｄ ｉｎｔｏ ａｎ ａ ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ＯＤ６００ ０．６ ｆｏｒ １５ ｍｉｎ，ｔｈｅｎ ＣＯ—ｃｕｌｔｉｖａ— ｔｉｏｎ ｆｏｒ ３ ｄａｙｓ，ｔｈｅ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｅｄｉａ ｗｉｔｈ １００ ｍｇ／Ｌ Ｋｍ ａｎｄ ５００ ｍｇ／Ｌ Ｃｅｆ．Ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｂｅｎｅｆｉｔｅｄ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｔｏ ｗｈｅａｔ ｇｅｎｏｍｅ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｗｈｅａｔ；ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ；ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
小麦作为世界上重要的粮食作物，其进行基因工 程改良一直倍受关注。自１９９３年Ｃｈａｎ ＴＭ…利用农 杆菌转化水稻获得转基因植株以来，农杆菌介导的转 化方法在禾本科作物上的研究迅速展开，玉米和水稻 已经建立相对完善的转化体系 Ｊ，直到１９９７年， Ｃｈｅｎｇ Ｍ等 才报道了利用农杆菌介导法获得ｇｕｓ（ ． 葡萄糖苷酸酶）基因的转基因植株。随后，农杆菌介 导小麦遗传转化在许多实验室取得了成功。Ｘｉａ ＧＭ 等 １９９９年获得农杆菌介导的ｎｐｔⅡ基因的小麦当代 转化植株。本试验是在小麦成熟胚组织培养研究的基 础上，以小麦成熟胚愈伤组织为受体，对农杆菌介导的
收稿日期：２０１０—０１一ｌ１ 基金项目：河南科技学院重点科研项目资助基金（５０５０）；河南省科技厅 科技攻关项目（２００７２１０００８）。 作者简介：贺杰（１９７８一），女，河南周口人；硕士，主要从事植物分子 生物学方面的研究；Ｅ—ｍａｉｌ：ｈｅｊｉｅｌ９０＠１２６．ｃｏｍ。 小麦遗传转化的主要因子，如外植体预培养时间、共培 养时间、抗生素（Ｋａｎ）筛选压、头抱霉素浓度、接种菌 液浓度和侵染时间等进行优化，以提高小麦遗传转化 效率，为小麦的基因工程遗传改良育种奠定基础。 １材料与方法 １．１材料 供试小麦品种为矮抗５８，由河南科技学院小麦育 种中心提供。 １．２菌株和质粒 农杆菌菌株为ＬＢＡ ４４０４，为双元表达载体ｐＡＧＴ （含有ＰＳＡＧ—ｉｐｔ嵌合基因），由华南热带农业大学张治 礼博士提供，以Ｋａｎ抗性基因作为抗性筛选基因。 １．３培养基 诱导培养基：ＭＳ＋２，４－Ｄ（４．０ ｍｇ／Ｌ）＋３％ ｓｕｃｒｏｓｅ＋０．８％ａｇａｒ．
．５． 第２９卷第５期２０１０年５月 种子（Ｓｅｅｄ） Ｖｏ１．２９ Ｎｏ．５ Ｍａｙ．２０１０ 继代培养基：ＭＳ＋２，４一Ｄ（２．０ ｍｇ／Ｌ）＋６－ＢＡ（１．０ ｍｇ／Ｌ）＋ＡＢＡ（０．３ ｍｇ／Ｌ）＋３％ｓｕｃｒｏｓｅ＋０．８％ａｇａｒ． 预培养培养基：ＭＳ＋２，４一Ｄ（２ ｍｇ／Ｌ）＋３％ ｓｕｃｒｏｓｅ＋０．８％ａｇａｒ＋ＡＳ（１００／ｘｍｏｌ／Ｌ）． 共培养培养基：ＭＳ＋２，４一Ｄ（２ ｍｇ／Ｌ）＋３％ ｓｕｃｒｏｓｅ＋０．６％ａｇａｒ＋５００ ｍｇ／Ｌ Ｃｅｆ＋５０ ｍｇ／Ｌ Ｋａｎ． 分化培养基：ＭＳ＋ＫＴ（１ ｍｇ／Ｌ）＋３％ｓｕｃｒｏｓｅ＋ ０．６％ａｇａｒ＋５００ ｍｇ／Ｌ Ｃｅｆ＋５０ ｍｇ／Ｌ Ｋａｎ． 生根培养基：１／２ ＭＳ＋ＮＡＡ（０．３ ｍｇ／Ｌ）＋３％ ｓｕｃｒｏｓｅ＋０．７％ａｇａｒ＋５００ ｍｇ／Ｌ Ｃｅｆ＋５０ ｍｇ／Ｌ Ｋａｎ． １．４外植体的转化 选取胚性好的较松散的小麦愈伤组织，夹碎成约 ３ ｍｍ大小的小块，于上述菌液中浸泡，并不停振荡。 ５ ｍｉｎ后弃去菌液，用滤纸将愈伤组织吸干后置于共培 养基上，２５℃避光培养３ ｄ。然后脱菌１ ｈ，无菌水冲洗 ３次，吸干，接种于相应的培养基上。 试验设置不同的抗生素（Ｋｍ）浓度（０、５０、１００、 １５０、２００ ｍ＃Ｌ），预培养时间（０、１、２、３ ｄ），共培养时间 （０、１、２、３、４ ｄ），观察这些转化条件对小麦愈伤组织遗 传转化的影响。 １．５外源基因的检测 用ＣＴＡＢ法 提取再生抗性植株的基因组ＤＮＡ， 碱裂解法 提取质粒ＤＮＡ。以再生植株ＤＮＡ、非转化 再生植株ＤＮＡ和质粒ＤＮＡ（阳性对照）为模板，进行 ＰＣＲ扩增反应。 根据ＩＰＴ基因序列所设计的特异引物： 引物１：５ 一ｇｃ ｇｇａ ｔｅｅ ａｔｇ ｇａｔ ｃｔｃ ｃｇｔ ｃｔａ ａｔｔ ｔｔｃｇ一３ 引物２：５ 一ｇｃ ｇａｇ ｃｔｃ ｔｔａ ｃａｔ ｔｃｃ ｇａａ ｅｇｇ ａｔｇ ａｃｃ一３ ＰＣＲ反应程序为：９４ ｑｃ预变性５ ｒａｉｎ；９４ ｏＣ变性 ３０ Ｓ；５５ ｏＣ退火３０ Ｓ；７２℃延伸２．５ ｍｉｎ；３０个循环；７２ ℃再延伸１０ ｍｉｎ。
２结果与分析 ２．１预培养时间对转化的影响 试验研究了不同预培养时间对农杆菌转化的影 响，发现预培养１—２ ｄ较有利于转化（表１）。转化产 生的抗性愈伤率比较高，达到７．５％～８．５％，比没有 进行预培养的对照组（Ｏ ｄ）产生抗性愈伤数高得多，而 随着预培养时间的增加，产生的抗性愈伤率反而下降， 从表１可看出，预培养３ ｄ时抗性愈伤率已下降至 １．５％。预培养可以淘汰生命力弱的外植体促使外植 体尽早适应组织培养环境而进入萌动状态，在一定程 度上提高转化率。但预培养时间过长则会使外植体细 胞的形成潜伏芽，反而使转化率降低而假阳性率增高。 ・６・ 表１预培养时间对转化的影响 堡生鲞 接种愈伤组织数 ２００ 产生抗性愈伤率（％） ２．５ １ ２ ３ ４ ５ ２ｏｏ ２ｏｏ ２ｏｏ ２ｏｏ ２０ｏ ８．５ ７．５ １．５ ０ Ｏ ２．２共培养时间对转化的影响 不同的共培养时间对转化率的影响见图１。由图 １可知，愈伤组织与农杆菌共培养３ ｄ，再培养４０ ｄ所 得到的抗性愈伤率较高。而共培养３ ｄ后，随着共培 养时间的增加，抗性愈伤反而下降。因为农杆菌在愈 伤组织表面过度繁殖，难以抑制，最终全部死亡。本试 验结果表明，适宜的共培养时间为３ ｄ。 ＾ 芑 锁 图１ 共培养时间对转化的影响 ２．３卡那霉素浓度的确定 为了明确对卡那霉素的敏感性，确定适宜的筛选 浓度，观察各浓度对愈伤组织生长状况的影响（表２）。 由表２可知，随着Ｋａｎ浓度的不断增高，愈伤组织不定 芽诱导率逐渐降低，高浓度的卡那霉素会使愈伤组织 的生长受到抑制，影响转化；而浓度低又会增加假阳性 的几率。当Ｋａｎ浓度为１００ ｍｇ／Ｌ时基本能抑制其不 定芽的分化。因此Ｋａｎ筛选浓度为１００ ｍｇ／Ｌ。 表２愈伤组织对卡那霉素的敏感性测定 堕 垄 ！ 接种愈伤组织数 ９０ ９０ ９０ ９０ ９０ ９０ 生 丝墅垡壑 ２ １ ： 丝： ： ！：！ ２．４头抱霉素（Ｃｅｆ）对小麦愈伤再生的影响 从图２可看出，头抱霉素（Ｃｅｆ）对小麦愈伤组织再 生的影响作用不大，但是，随着Ｃｅｆ浓度的升高，其愈 伤组织褐化，生长缓慢，再生率低。所以，在小麦愈伤 组织转化中，Ｃｅｆ的浓度在可以有效地抑制农杆菌的 基础上尽量采用一个比较低的值。待可见农杆菌菌 落，用无菌水多次洗涤愈伤组织，再用含５００—７５０ ｍｇ／Ｌ Ｃｅｆ的无菌水充分振荡洗涤。洗后将愈伤组织 用无菌滤纸上吸水，用灭过菌的滤纸吸干转人筛选培 养基中，用在后期的抑菌分化筛选中，用５００ ｍｇ／Ｌ即 可有效抑制农杆菌的生长。