原代肝细胞分离方法
遗传学实验课：实验一肝细胞的原代分离与培养
血球计数板使用方法
• 静置片刻，待细胞沉降到计数板，不再随液 体漂流
• 如细胞位于大方格的双线上，计数时则数上 线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
血球计数板使用方法
• 计数重复3次，取其平均值 • 使用完毕，用自来水清洗血球计数板，勿用
硬物洗刷
• 计数板计算公式
细胞数/ml=(4个大方格内的细胞数/4)×104×稀释倍数
细胞存活率计算
• 细胞存活率=活细胞数/细胞总数×100%
思考题
• 1、什么是细胞的原代培养与传代培养？ • 2、除了台酚蓝染液，还有哪些染液可用于细胞死活
的鉴定？ • 3、简述采用灌流方法分离肝细胞的技术有哪些？ • 4、血球计数板的使用方法及注意事项？并计算本实
验中的细胞数量。
操作步骤
3、用手术剪将肝脏剪成小块（约1mm3）， 再用玻片充分研磨，转移到离心管，离心 1000 rpm，5min。
注意：玻片研磨既需要充分又不能用力太大
操作步骤
4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5mL）胰酶， 37℃水浴中消化20分钟，每隔5分钟振荡一 次，或用吸管轻柔吹打一次，使细胞分离。
操作步骤
2、用针头将小鼠四肢固定在泡沫板上,腹部朝上。镊 子捏起腹部皮肤，剪刀剪一小口，暴露腹壁。
注意：不要一刀剪破腹壁，这样毛容易进入腹腔， 里面就不是无菌的了。 镊子夹起腹壁，剪开腹腔，取出肝脏，置于培养 皿中，剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移 到另一个盛有PBS液的平皿中。
镊子捏起腹部皮肤，剪刀剪一小口，暴露腹壁。 镊子夹起腹壁，剪开腹腔，取出肝脏，
9、细胞计数前，先用台酚蓝染料染色，细胞悬液与 0.4%台酚蓝溶液以9:1混合均匀，用血球计数板计 数，计数活细胞。
小鼠提原代肝细胞原理
小鼠提原代肝细胞原理
小鼠提原代肝细胞是一种实验室技术，用于研究和探索肝脏生物学和疾病机制。
其原理主要包括以下几个步骤：
1. 鼠标准备：选取适合的小鼠作为实验对象，例如常用的实验小鼠品种如C57BL/6等。
2. 消化和分离：通过注射合适的麻醉药物使小鼠进入无意识状态，然后进行腹腔解剖，取出肝脏组织。
将肝脏组织切碎并进行酶消化，将肝细胞从其他细胞分离出来。
3. 培养和传代：将分离得到的原代肝细胞放入适当的培养基中，并提供适宜的营养物质和环境条件，使其在培养皿中继续生长和增殖。
当细胞充分增殖并达到一定密度时，可以进行传代，即将细胞从原培养皿中分离并重新分配到新的培养皿中。
4. 鉴定和确认：对传代后的细胞进行鉴定和确认，例如通过形态学观察、细胞计数、细胞功能检测等方法，确保细胞的纯度和活性。
同时，可使用特异性标记物如肝细胞特异性蛋白等进行免疫染色，确认细胞的特异性。
通过小鼠提原代肝细胞，科研人员可以获得高质量的原代肝细胞样本，用于开展各种疾病模型、药物筛选和机制研究等实验。
该技术为肝脏疾病的治疗和预防提供了重要的实验基础。
小鼠原代肝细胞分离培养
小鼠原代肝细胞分离培养准备材料1.能够提供灌注速度为1-10mL/分钟的蠕动泵（我们用的是保定兰格的蠕动泵，某宝有售）；2.能够容纳50-100mL溶液的无菌容器；3.凹槽（可供放置操作台面并提供引流槽，我们用的是搪瓷实验盘+泡沫板的组合）；4.可维持37℃的水浴设备（即恒温水浴锅）；5.无菌100mL广口玻璃瓶；6.无菌50mL锥形管；7.一次性或可重复使用的70微米不锈钢过滤器（就是不锈钢滤网，查阅资料提示这里选用的滤网规格大概为200目左右）；8.细胞培养皿（直径10cm，即常说的大皿）；9.无菌器械，至少要有一把剪刀和两对细尖镊子；10.70%-75%酒精和去污剂（去污剂我们没有用过，只要小鼠备皮充分一般影响不大），均盛装于喷雾瓶中（碘剂可选）；11.麻醉剂，注射或吸入剂型均可（我们选用水合氯醛或戊巴比妥）；12.Vacutainer牌蝶型插管（我们选用BD公司的套管针）; 推荐小鼠体重：20g-40g（我们的建议是25g以上）；13.口罩；14. 每只小鼠2只吸水台垫（我们是用大量吸水纸代替吸水台垫铺在手术操作平台上，主要是吸收灌注后流出的灌注液）；15.动物操作台；16.胶带。
分离试剂1.前灌液：Hank's缓冲盐溶液（HBSS），使用不含钙镁离子、含0.5mM EGTA 的1x工作液；共需要大约 60ml-70ml；使用前预温至37℃；2.后灌液：IV型胶原酶+低糖DMEM+1xPenn-Strep+15mM HEPES（低糖DMEM 和IV型胶原酶是必须的，HEPES缓冲液等等可以选择性加入）；共需要90ml。
注意确保所使用的DMEM含钙；使用前预温至37℃；3.分散液：IV型胶原酶+低糖DMEM，共需要120mL；4℃预冷；4.IV型胶原酶;在消化液和分散液中，胶原酶的浓度至少要达到100胶原酶消化单位/ml（100CDU/ml）；（我们使用的是购自Gibco公司的IV型胶原酶，按照0.5mg/ml配成工作液用于消化和分散肝细胞）；5.蒸馏水。
原代肝细胞培养方法
原代肝细胞培养方法原代肝细胞培养是一种重要的技术手段，它可以使我们更好地理解肝细胞的生物学特性和功能，同时也被广泛应用于药物筛选、毒性研究和肝脏疾病模型的建立。
本文将探讨原代肝细胞培养的方法。
原代肝细胞是从动物（如小鼠、大鼠、猪等）或人体新鲜肝组织中分离得到的肝细胞。
它们具有种独立性和细胞特异性功能，是进行体外研究的理想模型细胞。
原代肝细胞培养的主要步骤包括：肝组织的分离、肝细胞的分离和纯化、肝细胞的培养和维持。
首先，肝组织的分离是原代肝细胞培养的起始步骤。
一般来说，选择健康的动物或人体捐赠的新鲜肝组织，快速解剖分离，并将其置于含有冷蘸过消毒的生理盐水或缓冲液的离心管中。
然后，用小剪刀对肝组织进行切细，使其暴露于细胞分离液或酶溶液中。
常用的细胞分离液包括肝素-胰酶、胰酶、胶原酶、凝集酶及胰蛋白酶。
这些酶能够降解结缔组织，使肝细胞从肝组织中游离出来。
接下来，肝细胞的分离和纯化是确保原代肝细胞培养成功的关键一步。
一般而言，将细胞分离液转移至新离心管，并用对应的培养基对其停滞，使浮游的肝细胞顺应性地附着在组织培养器皿的底部。
在培养基的作用下，非肝细胞（如纤维细胞和非肝上皮细胞）会悬浮离开，而肝细胞则紧密附着在培养器皿上。
此时，我们可以通过控制等粘附时间、细胞数目、培养基的组分和浓度，使纯化程度达到最佳。
然后，肝细胞的培养和维持是原代肝细胞培养的持续关键步骤。
首先，选择合适的培养基是非常重要的。
常用的培养基包括DMEM、威利精简培养基和L-15培养基等。
这些培养基中会添加适量的营养物质（如葡萄糖、氨基酸和维生素）和生长因子（如胰岛素、胆固醇和转铁蛋白）。
其次，细胞密度的控制也非常重要。
通常，当细胞趋于稳定时，可以通过减少培养皿内细胞的数量来避免细胞互相竞争和过度分泌胺碱酸等蛋白质。
此外，保持培养环境的稳定也是原代肝细胞培养的重要环节。
温度、湿度、CO₂浓度和培养基的更新等因素都会对肝细胞的生长和功能有一定的影响。
小鼠原代肝细胞实验报告
一、实验目的1. 掌握小鼠原代肝细胞的分离和培养方法；2. 了解肝细胞在体外培养过程中的生物学特性；3. 探讨肝细胞培养条件对细胞生长和功能的影响。
二、实验材料1. 实验动物：昆明小鼠（体重20-25g）；2. 培养基：RPMI 1640培养基（含10%新生牛血清、1%双抗、1%非必需氨基酸、1%谷氨酰胺）；3. 试剂：0.25%胰蛋白酶、0.2%胶原酶、台盼蓝染色液；4. 仪器：超净工作台、倒置显微镜、离心机、培养箱等。
三、实验方法1. 小鼠原代肝细胞的分离（1）处死小鼠，取出肝脏；（2）将肝脏放入含有RPMI 1640培养基的培养皿中，用剪刀剪成1mm³左右的小块；（3）加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化10min；（4）加入0.2%胶原酶，37℃水浴消化30min；（5）消化过程中每隔5min轻轻摇动培养皿，使肝细胞充分释放；（6）消化结束后，将消化液过滤，收集肝细胞悬液；（7）用RPMI 1640培养基洗涤肝细胞悬液2次，去除未消化的组织碎片；（8）将肝细胞悬液离心（1000r/min，5min），弃去上清液；（9）用RPMI 1640培养基重悬肝细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml。
2. 肝细胞培养（1）将肝细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养；（2）每隔2-3天更换新鲜培养基；（3）观察肝细胞的生长情况，记录细胞贴壁、伸长、伪足形成等过程；（4）利用台盼蓝染色法检测细胞存活率；（5）观察肝细胞在培养过程中的形态学变化。
3. 肝细胞功能检测（1）收集培养24h后的肝细胞，用RPMI 1640培养基洗涤2次；（2）加入0.5%台酚蓝染液，37℃水浴染色30min；（3）用RPMI 1640培养基洗涤细胞，去除未结合的染料；（4）用酶标仪检测吸光度（A）值，计算肝细胞对台酚蓝的摄取量。
四、实验结果1. 肝细胞分离与培养（1）分离得到的肝细胞形态为圆形、椭圆形或不规则形，细胞核清晰可见；（2）细胞存活率约为64.1%；（3）细胞在培养过程中呈典型的上皮样细胞形态，胞浆内有空泡和脂滴，相邻细胞伸长的伪足相互连接。
肝细胞的原代培养
肝细胞的原代培养1．准备工作及肝细胞的分离（1）对所要用的工具和器械进行高温高压消毒，对所要的培养液，平衡盐溶液，蛋白酶消化液用微孔滤膜过滤除菌（手术剪，镊子，止血钳，空针，解剖针，不锈钢呢绒晒网，培养皿，小烧杯，吸管，离心管，三角瓶，棉球，血细胞技术板）（2）工作台面取材前30分钟紫外线消毒，酒精棉球擦洗（3）操作者洗手着装（新洁尔灭浸泡前臂1min）（4）试验动物消毒（70％或75％乙醇浸泡）（5）切取动物组织，洗取血污，剔去多余部分，将所取组织放入不含Ca2＋的HEPES缓冲液（培养液）的培养皿中（6）将所取组织切碎，将组织块连同组织液用吸管吸至离心管中静置片刻待组织块下沉后吸去上清液（7）将组织块转移至一加入含0。
05％胶原酶－2和5mMCacl2的HEPES的小烧杯或小培养瓶中37C恒温床消化15－45min（也可加磁力棒）（8）用吸管吸去含酶溶液加入不含Ca2＋的HEPES 缓冲液并用吸管吹打使组织块刚好散开（9）用不锈钢筛网过滤，若未过滤组织块较多重复（7）（10）对过滤液离心，转速80－1000r /min 时间5－10min（50×g？）（11）弃上清液，将细胞沉淀用少量培养液重新悬浮（12）重复（10）（11）3次（13）用血细胞计数板计数密度（14）用培养液调节细胞悬液密度至期望密度（每75ml烧瓶8×106个细胞）准备接种2．培养(1) 培养基：75％Eagle MEM＋25％medium 199＋10nginsulin/m+0.2%bovin serum albumin+10%fetal calf serum(2) 将分离的肝细胞种在10ml培养基里(3) 过12小时换液(4) 以后每天换液且加入7×10-5 hydrocortisone hemisaccinate（去小牛血清加入1.5%的二甲基亚砜）。
鼠肝星状细胞分离方法汇总
1、大鼠原代肝星状细胞的分离培养方法汇总：方法一雄性SD大鼠，体重400—500g。
[操作步骤]1.大鼠以戊巴比妥钠麻醉，同时皮下注射5000U肝素钠抗凝；2.皮肤常规消毒后打开腹腔，钝性分离门静脉及下腔静脉；3.以16号套管针作门静脉插管，37℃灌注D-Hanks液，10ml/min至肝脏充盈，剪开下腔静脉放血后结扎。
立即打开胸腔，以16号套管针作上腔静脉插管，形成门静脉-上腔静脉循环；4.以0.1％链霉蛋白酶E 5mL/min灌注3-4分钟，0.03％Ⅱ型胶原酶5ml/min灌注3-4分钟；5．取出肝脏，去肝包膜，用眼科剪剪碎。
加入链霉蛋白酶E至终浓度为0.006％、DNA酶至终浓度为10pug/ml。
37℃5％C02孵箱内消化30分钟；6.过200目筛网，培养液洗4次，将细胞铺于制备好梯度的细胞分离管中，对照管中加入等量培养液;7.4℃800g平抛离心30分钟。
吸取1.040密度层的上层细胞，培养液洗2次；8.加入五血清RPMll640培养液，于37℃5％C02孵箱孵育15分钟：吸取细胞悬液，在6孔板中以含20％胎牛血清的RPMl1640培养。
24小时后换液，此后每3天换液1次。
方法二：[动物]雄性纯种Wistar大鼠，体重400-500g，普通饲料喂养。
[操作步骤]1.大鼠用戊巴比妥钠麻醉，无菌操作下打开腹腔；2.经门静脉肝素化，取出肝脏，灌流液灌注10-20分钟(37℃)，至肝细胞略显黄色；3.链霉蛋白酶E溶液(0.02％)反复灌注10-20分钟(40—41℃)，胶原酶溶液反复灌注10-15分钟(40—4l℃)，至肝组织完全软化；4.两液合于器皿中，钝性撕碎肝组织，置三角烧瓶内37~C下振荡消化20分钟，三层纱布过滤；5.无钙培养液洗2次，将细胞悬液加至三层非连续密度梯度最上层(从下至上为1.080、1.058、1.053)，再在上面加一层无钙培养液，16000r／min离心30分钟(20℃)；6.轻轻吸取上层培养基与1.053层之间的细胞，细胞经无钙培养液洗2次后，调成(1-5)XlO5/ml浓度，接种于50ml培养瓶(内含20％小牛血清的RPMl1640培养液)；7.培养28h后换含新鲜10％小牛血清的RPMl1640培养液，以后每隔3—4天换液1次。
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原代肝细胞分离方法
体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞. 自1953年Anderson[2]首创剪切法从肝脏分离肝细胞以来, 各实验室对肝细胞的分离方法进行了不断改进. 在众多方法中, 主要分为非灌流的方法和灌流的方法.
1.1 采用非灌流的方法
早期的研究一般通过非灌流这种简单的步骤分离肝细胞.
1.1.1 机械分离法:
机械分离法是利用机械剪切及强力吹打等物理手段来分离肝细胞的方法[3]. 张
顶et al[4]在分离树鼩肝细胞的过程中, 首先将树鼩的肝脏剪成小块, 然后通过挤压、剪碎和
震荡等机械手段, 使肝细胞从肝组织上脱落, 从而获得互相分离的肝细胞.
1.1.2 胰酶消化法:
胰酶消化法是利用胰酶来破坏肝细胞之间的桥连, 使肝细胞分离的一种方法. Dulbecco et al[5]首次采用胰酶来分离猴肾细胞、大鼠肝细胞, 并运用到体外细胞的研究和培
养中. 刘友平et al[6]利用该方法分离肝细胞时, 首先取出小鼠的肝组织用眼科剪剪碎至糊状, 然后用缓冲液充分清洗并加入胰酶进行消化. 待消化完全后用D-Hank's液清洗, 最后加入含有血清的培养液终止胰酶的作用, 得到消化彻底的细胞悬液.
1.1.3 胶原酶消化法:
胶原酶消化法是利用胶原酶来破坏细胞间的纤维成分, 使肝细胞分离的一种方法. 王琳et al[7]在利用该方法分离新生小鼠肝细胞时, 首先将新生小鼠的肝脏剪成1 mm3组
织块, 用无钙无镁的D-Hank's液反复冲洗后加入胶原酶进行消化. 最后用DMEM液终止胶原酶的作用, 得到肝细胞悬液.
1.2 采用灌流的方法
虽然非灌流的方法以其简单易行的特点得到了一定的应用, 但由于存在消化不
完全、分离得到的肝细胞中多细胞团块存在的问题, 不能满足许多基础研究或临床应用的要求. 1969年, Berry和Friend[8]引入了肝脏灌流法, 灌流可以使消化液与肝组织更加充分地接触, 不仅提高了分离效率, 还使分离所得肝细胞的活力和数量大大提高.
1.2.1 离体胶原酶灌流法:
离体胶原酶灌流法是将离体灌注与胶原酶消化相结合的方法. 在使用该方法分离肝细胞时, 首先将动物肝脏取出, 于门静脉内置管或直接在获得的肝组织块的血管或切口内置管, 用预热的无钙无镁的D-Hank's液灌流. 然后换用胶原酶作持续灌流, 使肝细胞与间质分离. 最后用培养液终止胶原酶的消化作用, 过滤、离心、弃上清后得到肝细胞悬液.
1.2.2 Seglen两步灌流法（原位胶原酶灌注法）:
自从引入灌流法分离肝细胞以来, 许多学者根据不同的应用条件对灌流法进行了改良. 其中Seglen[10]经过一系列细致的研究, 创立了改良的Seglen两步灌流法, 这一方法已成为应用至今的标准的原代肝细胞分离方法. 两步灌流法主要是通过门静脉先后用含EDTA或EGTA缓冲液和胶原酶缓冲液进行灌注来分离肝细胞的方法. 许多学者在具体操作中, 不断改进
两步灌流法的灌注条件, 目的在于进一步减少分离过程中肝细胞的损伤, 提高肝细胞的活率. 1.2.3 半原位胶原酶灌流法:
半原位胶原酶灌流法是我国学者彭齐容 et al[13]以Seglen法为基础建立的肝细胞分离技术. 俞红et al[14]在采用该方法分离乳猪肝细胞时, 首先用无钙无镁的D-Hank's
液于门静脉进行原位灌注. 接着, 除保留门静脉以外, 离断肝脏血管并将肝脏移入无菌平皿中, 继续用胶原酶进行灌注使肝细胞与间质细胞分离. 最后钝性撕裂组织, 过滤洗涤后得到制备好的细胞悬液.
1.2.4 下腔静脉插管的逆向胶原酶灌注法:
下腔静脉插管的逆向胶原酶灌注法是在肝下腔静脉插管, 并结合逆向胶原酶灌注来分离肝细胞的方法[9]. 在采用该方法分离肝细胞时, 首先将灌注针逆向插入下腔静脉后固定, 门静脉开放做流出道. 接着用含EGTA或EDTA的灌注液进行灌注, 一段时间后再用含有Ca2+的胶原酶进行充分灌注. 灌流结束后, 将细胞过滤、清洗后得到制备好的肝细胞悬液.
1.2.5 Gerlach五步胶原酶灌流法:
在使用两步灌流法分离大的肝组织块时, 仍存在消化不完全的问题. 而Gerlach et al[15]在两步灌流法的基础上, 创立了联合门静脉和肝动脉的五步胶原酶灌流技术, 建立了一种高效的细胞分离方法。