SA磁珠
磁珠富集法筛选方正银鲫的三、四核苷酸重复微卫星DNA
第４ 卷 １
Ｖｏ． １４１
第 １期
Ｎｏ ．１
淡
水
渔
业
２１ ０ １年 １月
Ｊ ｎ ２ １ ａ．０ ｌ
Ｆ ｅ ｈ ｔｒ Ｆ ｓ ｅ ｅ ｒ ｓ ｗａｅ 正 银 鲫 的 、 四核 苷 酸 一
重 复 微 卫 星 ＤＮＡ
曹 ， 云 ， 虎 ， 远 ， 奇 ， 凤 ， 文 柱 鲁翠 郑先 储志 张天 赵元 孙效
３ Ｃ ｌｇ 厂 ｉ ｅｅ ａｄＬ ｅＳｉ ｃ，Ｓ ａｇ ａ Ｏｅｎ Ｕ ｉ ｒｔ，Ｓａ ｇ ａ ２ １０ ） ． ｏｌ ｅ０ Ｆｓ ｒ ｓ ｎ ｉ ｃ ｎｅ ｈ ｎｈ ｉ ｃａ ｎ ｅ ｉ ｅ ｈ ｉ ｆ ｅ ｖ ｓｙ ｈ ｎｈ ｉ ０ ３６
Ａｂ ｔａ ｔ Ｍａ ｎ ｔ ｅ ｄ ｎ ｉ ｈ ｄ ｍｅｈ ｄ ｗ ｓ ｕ ｅ ｏ ｉｏａｅ ｏ ｙ ｒ ｈ ｃ ｔ —ａ ｄ ｔｔａ ｕ ｌｏ ｉ ｅ ｒ ｐ ａ ｃ ｏ ａｅｌ ｅ ｓｒ ｃ ： ｇ ｅｉ ｂ ａ ｓｅ ｒ ｅ ｔｏ ａ ｓ ｄ ｔ ｓ ｌｔｄ ｐ ｌ ｍｏｐ ｉ ｒ ｎ ｅｒ ｎ ｃ ｅ ｔ ｅ ｅ ｔｍｉｒ ｓ ｔｌ ｔ ｃ ｃ ｉ ｄ ｉ
传统 的放射性 同位素杂交法相结合 ，进行 二次筛选 微卫星分 子标记 。结 果显示 ：对 ６ ２个 阳性克 隆进行测 序分 ５
析 ，获 得 微 卫 星 序 列 ８０个 ，其 中 完 美 型 ５ ２个 （ ７ ７ ％ ） ０ ４ ６ ． ５ ，非 完 美 型 １０个 （ ７ ５ ％ ） 混 合 型 ｌ８ 个 ４ １ ．０ ， １ （４ ７ ％ ） １．５ 。用 引 物 设 计 软 件 ｐｉ ｅ３ ｌｓ 线 设 计 引物 １３对 ，选 择 合 成 ７ ｒ ｒｐｕ 在 ｍ ６ ６对 ，引 物 多 态 性 通 过 二 倍 体 野 生 鲫
AMMS CD3-CD28抗体偶联磁珠说明书
AMMS TM CD3/CD28抗体偶联磁珠说明书产品名称通用名称：CD3/CD28抗体偶联磁珠英文名称：Anti-human CD3/CD28 monoclonal antibody beads适用范围AMMS TM CD3/CD28磁珠适用于人T细胞的分离，激活和扩增。
适用于直肠癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、恶性黑色素瘤、卵巢癌等多种肿瘤的细胞免疫治疗临床研究。
AMMS CD3/CD28磁珠提供了一种不需要抗原呈递细胞和抗原就能激活和扩增调节T细胞的简单的方法。
通过在磁珠上组合抗CD3和抗CD28抗体，就能提供调节T细胞激活和扩增需要的初级和协同刺激信号。
使用说明一、AMMS TM CD3/CD28磁珠的清洗：1.1 在小管里重悬磁珠（也就是说，涡旋超过30s，或者颠倒混匀5min）1.2 将确定体积的磁珠转移到管子中。
1.3 加入等体积的PBS缓冲液含1%的HAS，或者至少1ml的体积，进行重悬。
1.4把管子放在一个磁铁上1min，随后弃去上清。
1.5将管子从磁铁上转移下来，用相同体积的PBS缓冲液含1%的HAS重悬磁珠（第二步最初体积的磁珠）。
二、磁珠分离和扩增CD3+的T细胞注意：由于单核细胞在37℃能够快速的吞噬磁珠，因此就降低了所能够接触到T细胞磁珠的绝对数量，进而降低了T细胞活化和扩增的能力。
2.1 通过流式或者是其他的方法确定样本中CD3+T细胞的比例。
2.2 对于Ficoll分离的PBMC，将细胞轻柔的重悬于含1%HAS的PBS缓冲液中，并调节细胞密度为2-5×107个/mL，此处注意，总的细胞数量不要超过2×108个。
2.3 将磁珠和细胞比例为3:1，加入已经洗过的AMMS TM CD3/CD28磁珠。
2.4 将样品置于1转的摇床上，在4℃-25℃条件下孵育30min，在每次的试验中需要在4℃-25℃范围内优化最适的孵育温度。
2.5用无血清培养基或者含1%HAS的PBS缓冲液稀释磁珠和细胞的混合物，来保证磁铁的分选体积。
cDNA文库制备非常详细
cDNA⽂库制备⾮常详细cDNA⽂库组标准流程⼀. Total RNA的提取 (2)⼆. mRNA的分离 (5)三．cDNA双链合成 (8)四．载体制备 (11)五. cDNA双链和载体的连接 (13)六．电转化流程 (14)七．快速鉴定、菌落PCR (16)⼋．pBlueScript cDNA库扩增 (18)⼀.Total RNA的提取1.试剂配制准备⼯作：1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均⽤锡纸包裹⼝部，置于烤箱内,180℃，烤6⼩时。
2、50ml/1.5ml离⼼管、枪头等塑料制品⽤0.1‰DEPC⽔浸泡过夜后，121℃20mins ⾼压灭菌。
3、电泳槽及电泳托、梳⼦⽤3%双氧⽔处理。
4、常⽤试剂及其配⽅：▲DEPC⽔：在1000ml去离⼦⽔中加⼊100ul DEPC, 静置过夜后⾼压灭菌。
▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5三⽔合柠檬酸纳22.94g加DEPC⽔定容⾄100ml，室温放置备⽤。
▲10%肌氨酸钠：肌氨酸钠10g加DEPC⽔定容⾄100ml，室温放置备⽤。
▲变性裂解液：0.78M柠檬酸钠8.25ml10%肌氨酸钠12.375ml异硫氰酸胍118.05g加DEPC⽔定容⾄250ml，室温放置备⽤临⽤前加β-巯基⼄醇使其终浓度为1%（v/v）▲2M 醋酸钠PH=4.5NaAc·3H2O 13.6g加DEPC⽔定容⾄50ml,⾼压灭菌，室温放置备⽤▲3M醋酸钠PH=5NaAc·3H2O 20.4g加DEPC⽔定容⾄50ml,⾼压灭菌，室温放置备⽤▲4M LiCL:LiCL 24.164g加DEPC⽔定容⾄100ml,⾼压灭菌，室温放置备⽤▲0.5M EDTA PH=8.0EDTA 18.61g⽤NaOH调PH值⾄8.0，定容到100ml，⾼压灭菌，室温放置备⽤▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):MOPS 41.86gNaAC·3H2O 4.10g0.5MEDTA（PH 8.0）20ml⽤NaOH调PH值 6.5 , DEPC⽔定容到1L，室温避光放置备⽤。
Total RNA的提取
一.Total RNA的提取1.试剂配制准备工作:1,研钵,5ml/10ml/ 25ml移液管,100ml/250ml量筒,250ml/100ml容量瓶,药匙, 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部,置于烤箱内,180℃,烤6小时.2,50ml/1.5ml离心管,枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后,121℃20mins 高压灭菌.电泳槽及电泳托,梳子用3%双氧水处理.4,常用试剂及其配方:▲DEPC水:在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌.▲0.78M柠檬酸纳:PH=4~5三水合柠檬酸纳22.94g加DEPC水定容至100ml,室温放置备用.▲10%肌氨酸钠:肌氨酸钠10g加DEPC水定容至100ml,室温放置备用.▲变性裂解液:0.78M柠檬酸钠8.25ml10%肌氨酸钠12.375ml异硫氰酸胍118.05g加DEPC水定容至250ml,室温放置备用临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%(v/v)▲ 2M 醋酸钠PH=4.5NaAc·3H2O 13.6g加DEPC水定容至50ml,高压灭菌,室温放置备用▲3M醋酸钠PH=5NaAc·3H2O 20.4g加DEPC水定容至50ml,高压灭菌,室温放置备用4M LiCL:LiCL 24.164g加DEPC水定容至100ml,高压灭菌,室温放置备用▲0.5M EDTA PH=8.0EDTA 18.61g用NaOH调PH值至8.0,定容到100ml,高压灭菌,室温放置备用▲10X MOPS (3-(N-吗啉代)丙磺酸):MOPS 41.86gNaAC·3H2O 4.10g0.5MEDTA(PH 8.0) 20ml用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L,室温避光放置备用.1x MOPS:10x MOPS 30ml加DEPC水270ml,用时现配.▲4x RNA Loading buffer:10x MOPS 400ul甘油(高压过) 200UL溴酚兰10ul甲醛(37%) 72ul去离子甲酰氨310ulEDTA(0.5M PH 8.0) 8ulErBr(10mg/ml in DEPCH2O) 70ul在4℃可保持3个月10x PBSpH=7.4NaCl 80gKCl 2gNa2HPO4 14.4gKH2PO4 2.4g定容至1000ml▲变性电泳胶:称取0.5g琼脂糖,加入47.5ml 1x MOPs,加热至琼脂糖熔化后,冷却至50℃左右,加入2.5ml 甲醛,轻轻混匀后倒入电泳托上.▲变性电泳缓冲液:在250ml容量瓶内加入5ml甲醛,用1x MOPS定容至250ml2.动物组织total RNA的提取根据表1适当的组织量和相应的变性裂解液量,将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中,冰浴5分钟.将组织样品放入变性裂解液中,在高速下匀浆15-30秒/次,直到看不见组织和细胞碎片. 根据表1加入适量2M的乙酸钠(pH4.0),反复颠倒混匀4-5次.根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次,再摇动10秒钟.冰浴10分钟.4C,12000g离心20分钟.小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,内含所需的RNA.蛋白质和DNA 分别留在了有机相和中间层.加入等体积的异丙醇,-20C沉淀30分钟以上.4C,12000g离心20分钟.根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA.加等体积的氯仿,加盖颠倒混合4-5次,再摇动10秒钟.4C,12000g离心20分钟.小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇,-20C沉淀至少30分钟.4C,12000g离心20分钟.弃上清,加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀.4C,12000g离心10分钟.弃上清,空气中干燥RNA沉淀,直至没有乙醇气味.用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀. 取少量RNA用于测定OD值及电泳,其余置-80C冰箱中保存.表 1Mg# of tissue5008001000变性裂解液(ml)58102M NaOAC pH 4 (ml)0.50.81水饱和酚(mL)5810氯仿(mL)11.62异丙醇(mL)468变性裂解液(mL)0.50.81异丙醇(mL)0.50.8175% 乙醇(mL)111DEPC-treated H20 (mL)0.50.813.植物组织total RNA的提取先将研钵于-80℃冰箱中预冷,然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状.将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中,充分匀浆.(1g样品加入3ml变性裂解液).加入0.3ml(1/10体积)2M的NaAc(ph4-5)颠倒混匀.加入3ml(等体积)的水饱和酚,充分振荡,再加入1ml(1/3)的氯仿,振荡.冰浴10min.4℃,12000g离心10min小心转移上清于另一离心管中,加入2倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀至少1小时.4℃,12000g离心20min.去上清,取沉淀.加1ml 4M的LiCl 溶解沉淀(1mlLiCl/g组织),并转入1.5ml离心管中. 4℃,13000rpm离心15min.用0.4ml DEPC水溶解沉淀,加1/2体积的水饱和酚,1/2体积的氯仿,颠倒混匀.4℃,13000rpm离心10min.取上清,加1/10体积的3MNaAc(ph5)和2倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上. 4℃,13000rpm离心15min.弃上清,用1ml 75%的乙醇洗涤沉淀,4℃,13000rpm离心10min.弃上清,取沉淀,空气中干燥RNA沉淀,直至无乙醇味.用40-60ul DEPC水溶解(300-500ug/g)RNA沉淀.取少量RNA用于测定OD值及电泳,其余置-80℃冰箱中保存.4. TRIzol Reagent 提取total RNA(GIBCO)查表2根据样品量适当的TRIzol Reagent体积装入50ml RNase-free离心管中,注意样品体积不能超过TRIzol Reagent体积的10%.将组织样品放入TRIzol Reagent中,高速下匀浆15-30秒/次,直至看不见组织和细胞碎片.3.室温温育10分钟.据表2加入适量体积的氯仿,剧烈震荡15秒钟,然后室温下温育3分钟.4 C,12000g离心15分钟,形成淡红色的苯酚/氯仿有机相,中间相和上层水相,水相约占TRIzol体积的60%.转移上清于另一个Rnase-free的50ml离心管中.根据表2加入适量异丙醇,-20 C沉淀1小时以上.4 C,12000g离心10分钟.去上清,据表2加入适量体积的75%的乙醇混匀.4 C,7500g离心5分钟.去上清,空气中干燥或真空抽干RNA沉淀,但不要太干.加入适量体积的DEPC-WATER,溶解沉淀.取少量RNA用于测定其OD值和电泳,其余置-80 C冰箱中保存.表2组织量TRIzol Reagent氯仿异丙醇75%乙醇50~100mg1ml0.2ml1ml1ml二.mRNA的分离1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN)法准备工作:1.将Oligotex Suspension 置于37℃水浴中,旋转混匀,溶解Oligotex.,然后置于室温.2.将OBB Buffer置于37℃水浴中,旋转混匀,重溶沉淀物,然后置于室温.3.将OEB Buffer置于70℃水浴中,待用.试验步骤:表3:加入试剂量据此表Total RNARNase-free Water to:Buffer OBB(ul)OligotexSuspension (ul)Prep size<=0.25mg250ul250ul15Mini0.25-0.5mg500ul500ul30Midi0.5-0.75mg500ul500ul45Midi0.75-1.00mg500ul500ul55MidiTotal RNA 量不要多于1mg,用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中,加RNase-free water 补足到500ul根据表3加入适当体积的OBB Buffer和Oligotex Suspension, 轻弹1.5ml离心管彻底混匀置于70℃水浴中3min取出置于室温(20℃-30℃)10min13000rpm室温离心2min,用移液器吸出上清到一个新的1.5ml离心管中,保留上清直到polyA被结合上.用移液器取400ul OW2 Buffer混匀沉淀物,将混合物转移到Spin Column 中,RT ,13000rpm,离心1min将Spin Column 转移到一个新的1.5ml离心管中,加400ul OW2,RT, 13000rpm,离心1min将Spin Column 转移到一个新的1.5ml管中,取出25ulOER Buffer(70℃)到Column中,用移液器吹打3-4次树脂,室温13000rpm,离心1min.取出25ul OER Buffer(70℃)到Column中,用移液器吹打3-4次树脂,室温13000rpm,离心1min.测OD,并电泳定量.2.磁珠法分离mRNA1. 在RNase-free的Eppendorf 管中加入0.1~1.0mg的总RNA和RNase-free水至终体积为500ul.2. 65 C加热10分钟.3. 加入3ul生物素标记的Oligo(dT)和13ul 20×SSC于RNA中,轻轻混合,室温放置逐渐冷去至室温,一般需10 分钟左右.4. 同时配0.5×SSC 1.2ml和0.1×SSC 1.4ml.5. 将磁珠(SA-PMPs)轻晃散开,放入磁性分离架上,使SA-PMPs集中于管的一侧(约30sec),小心去上清,切不可离心.用0.3ml 0.5×ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分离架集中磁珠,去除上清,重复3次.6. 将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.1ml 0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs应在30分钟内使用.7. 将(3)中的oligo(dT)/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA—PMPs管中,轻轻摇匀,室温下放10 分钟.8. 用磁性分离架捕获SA-PMPs,小心去上清,但不要弃去.用0.1×SSC,每次0.3ml洗3次,每次都晃至SA-PMPs悬浮,最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相,而不损坏SA-PMPs.将SA-PMPs重新悬浮在0.1ml RNase-free水中,反复颠倒,使SA-PMPs散开,洗脱mRNA. 用磁性分离架捕获SA-PMPs,将洗脱的mRNA吸入另一个新的Eppendorf管中.将SA-PMPs再悬浮于0.15ml RNase-free的水中,洗脱,与(11)步洗脱液合并.将得到的mRNA溶液取几微升跑电泳,若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录,则需将得到的mRNA溶液浓缩(浓缩步骤见14-18).加0.1体积的3mol/l NaAc和1.0体积的异丙醇于洗脱液中,-20 C沉淀过夜.4 C,13000g离心60 分钟.去上清,加入500ul 70%乙醇混匀.4 C,7500g离心10 分钟.去上清,真空或空气中自然风干,但不要太干,加适量RNase-free水溶解.重复步骤5-12,将步骤8保留下的样品重新上柱注意事项:1.所有操作均需要严格戴手套,戴口罩进行2.如果total RNA质量高,杂质少,就Oligotex的方法分离mRNA,相反则可以用磁珠法.3.mRNA的电泳图是smear.三.cDNA双链合成1. Superscipt II—RT合成第一链:1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入xul mRNA(大约500ng)1ul Xho I Primer(1.4ug/ul)(5' GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3')11-x ul RNase-free water(大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.)2. 混匀后,70℃反应10分钟;3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;稍微离心一下,顺序加入以下试剂:4ul 5×first strand buffer2ul 0.1M DTT1ul 10mM dNTP(自己配制)混匀,稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT,混匀;42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.2. cDNA第二链的合成:1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物-20℃冰箱中保存,待电泳检测.其余的产物合并,混匀,然后顺序加入下列试剂(promega):20ul 10×DNA Polymerase I buffer6ul 10mM dNTP(自己配制)xul dd H2O1ul RNase H(2U/ul)10ul DNA Polymerase I(10U/ul)总体系为200ul;2. 混匀后,16℃反应2.5小时;3. 70℃灭活10分钟;4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;5.取2ul二链产物,同保存的一链产物一起电泳鉴定.同时上1kb ladder,确定双链的大小范围.注:一链,二链的电泳图是smear,且二链稍比一链大一些.3. 双链cDNA末端补平:1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):6ul 10mM dNTP2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)2ul BSA(10mg/ml)2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.注:第3,第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替.PCR纯化试剂盒操作流程:1.溶液PE使用前应加入适量体积95%-100%的乙醇,混匀.2.向200ul二链补平产物中加入5倍体积的buffer PB,混匀.3.加入spin column中,13000rpm离心1min.4.加入0.75ml buffer PE,13000rpm离心1min.5.13000rpm,再离心1min.6.将spin column放入一新的离心管中,加入50ul buffer EB,静置10min.7.13000rpm离心2min.8.加入30ul buffer EB,静置10min.9.13000rpm离心2min.10.加入1/10体积3M的NaAc,2.5倍体积无水乙醇,混匀,-20℃沉淀过夜.4 EcoR I adaptor 加接:1. 往双链cDNA沉淀中加入9ul EcoR I adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分钟以充分溶解cDNA沉淀;2. 溶解完成后,顺序加入下列试剂:1.2ul 10×Ligase Buffer1ul 10mM rATP1 ul T4 DNA Ligase(4U/ul)3. 混匀后,4℃连接3days,或者8℃过夜连接;5双链cDNA末端的磷酸化及Xho I酶切:1. 连接反应完成后,将反应体系70℃放置15分钟灭活T4 DNA Ligase;2. 稍微离心使反应物集中至管底,室温下放置5分钟,然后加入下列试剂:1ul 10×Ligase Buffer1ul 10mM rATP6ul dd H2O1ul T4 PNK(10U/ul)3. 37℃反应30分钟,然后70℃灭活15分钟;4. 稍微离心使反应物集中至管底;5. 室温放置5分钟;然后加入下列试剂:4ul Xho 10×Buffer2ul BSA5ul ddH2O8ul Xho I (10U/ul)6. 37℃反应1.5小时,然后65℃灭活酶10分钟;7. 反应完成,双链cDNA合成完毕.置于4℃准备回收.6.胶回收cDNA(QIAEXII GEL Extraction Kit 回收试剂盒)配制小胶数板(每个样品一板):1%琼脂糖凝胶,2ul EB/300ml 胶取4℃保存样品上样,40ul/孔.3.电泳50V;1hr4.紫外灯下分别切下500~1kb,1.0-2.0kb及2.0-4.0kb cDNA 片段.,分别放入已做标记的1.5ml离心管中.称取胶重,加入三倍体积buffer QXI(例如,100mg胶中加入300ul buffer QXI)50℃水浴数分钟,至胶完全融化.用手指弹QIAEX II 使重悬,每管中加入5ul QIAEXII 50℃水浴10min,每隔2min 取出颠倒混匀数次,使QIAEX II 保持悬浮4℃,13000rpm,30sec.(弃上清,离心机中甩一下,吸取上清)加入500ul buffer QXI,轻弹管底使QIAEX II 重悬离心并去上清(同操作8)加入500ul buffer PE,重悬QIAEX II,离心30sec,去上清再加入500ul buffer PE,重悬QIAEX II,离心30sec,弃上清,离心机中甩一下,吸去上清超净台上吹干(至无乙醇味),加入10ul elution buffer,重悬QIAEX II,静置5min,13000rpm,30sec.吸上清,冰上放置.取1ul上清上样电泳,同时做分子量标准(1kb ladder)及DNA含量标准(10ng,20ng)作对照. 将收回的cDNA置于-20℃内保存,据电泳结果,取适量DNA进行连接.注意事项:1.胶回收前电泳槽,电泳板,梳子等都要用1%的HCl浸泡过夜.2.胶回收时电压要稳定.四.载体制备1.pBlueScriptII的提取1.取1ul商品的pBlueScriptII,转化入大肠杆菌宿主菌中,取5ul转化产物均匀涂布在含AMP的LB平板上,37℃培养过夜.2.第二天取一只无菌的50ml离心管,加入10ml AMP抗性的LB液体培养基,挑单克隆于离心管中,37℃,250rpm,培养过夜.3.第三天取200 l小摇后的菌液接种于250ml 含AMP的LB液体培养基中,37℃,250rpm 培养6 hr左右,使OD值达到0.6-0.8.4.将菌液移入250ml离心管中, 4℃,3000rpm,离心15min.取出离心管,菌团朝上倒掉上清,将离心管倒置于吸水纸上使上清充分滤干.(注意离心前需配平)5.加入10ml溶液Ⅰ(50mM Glucose , 25mM Tris-HCl,10mM EDTA, pH8.0),加入RNase至终浓度100 g/ml,晃动摇菌,使菌体充分悬浮,静置10min.6.按NaOH(0.4N):SDS(2%)--1:1的比例新鲜配制溶液Ⅱ,加入20ml溶液Ⅱ,静置3-5min. 注: 静置时间勿超过5min,提前将溶液Ⅲ置于冰盒中.7.加入15ml冰浴的溶液Ⅲ,冰浴15-30min.8.4℃,5000rpm,离心15min.9.取上清于两个50ml离心管中,弃去原离心管中的沉淀.10.每管加入0.6倍体积的异丙醇,充分混匀,室温下放置10min.11. 20℃,12000g,离心20min回收质粒沉淀.12.弃上清,用70%的乙醇洗2次.13.弃上清,倒扣于吸水纸上,尽量空干液体.14.用3ml TE(pH8.0)溶解沉淀,移入1.5ml Eppendorf离心管中.15.电泳检查DNA质量并定量.(必要的话,可以用胶回收的方法先纯化一下质粒再进行双酶切.)2.pBlueScriptII的双酶切消化1.以如下体系进行EcoRI酶切:pBSK(+) X l(6 g)ddH2O 174-X l10×Buffer E 20 l混匀,加入限制性内切酶:EcoRI (10U/ l) 6 l总体积为200 l.2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀,在离心机上甩一下.3.37℃,水浴1hr.4.加入200ul 1:1的酚/氯仿,混匀.4℃,13000rpm,离心15min.5.取上清,加入等体积的氯仿,4℃,13000rpm,离心10min.6.取上清,加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇,-20℃,沉淀30min.7. 4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀.8.加入200ul 70%的乙醇洗沉淀.9.4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀.10.自然风干沉淀,至无乙醇味,加入100ul ddH2O充分溶解沉淀.11.加入以下试剂进行XhoI酶切:ddH2O 74 l10×Buffer D 20 l混匀,加入限制性内切酶XhoI:XhoI (10U/ l) 6 l总体积为200 l.12.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀,在离心机上甩一下13.37℃,水浴1.5hr.14.加入200ul 1:1的酚/氯仿,混匀.15.4℃,13000rpm,离心15min.16.取上清,加入等体积的氯仿,4℃,13000rpm,离心10min.17.取上清,加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇,-20℃,沉淀30min.18. 4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀.19.加入200ul 70%的乙醇洗沉淀.20.4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀.21.自然风干沉淀至无乙醇味,加入40ulddH2O充分溶解沉淀,得到双酶切载体.3.载体去磷酸化1.在40ul双酶切载体中加入以下试剂:6ul 10×buffer6ul CIAP(0.01U/ul)8ul ddH2O总体积60ul.2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀,在离心机上甩一下.3.37℃,水浴1hr.4.70℃,15min,灭活酶.5.电泳分离,胶回收双酶切载体,定量.4.载体效率检测按以下所示作4个连接反应:DNA连接酶1pBlueScriptII/E/X /CIAP-检测酶切效率2pBlueScriptII/E/X /CIAP+检测脱磷效率,载体自连效率3商品Vector加标准Insert+对照4自制Vector加标准Insert+检测载体效率14℃连接过夜.各取1ul连接产物作电转化(具体流程见电转化)计算克隆数,计算载体相对脱磷效率及连接效率.五.cDNA双链和载体的连接:1.连接:根据载体和cDNA的电泳定量结果,每个样品设置3个比例的连接,即:insert/vector=1/3 incert/vector=1/1 insert/vector=3/1按以下体系依次加入:ddH2O xulT4 ligase 10x buffer 1ulPBK(E/X)vector(20ng/ul) 1ulcDNA (由浓度及连接比例而定)T4 DNA ligase(3U/ul) 1ulTotal 10ul14℃,连接过夜2.检测:(PCR方法)取适量PCR薄壁管,置于冰上,按以下体系依次加入:连接产物insert vector 阳性对照阴性对照(H20)模板: 1 1 1 1 110x buffer 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5Mgcl2(25mM) 1.8 1.8 1.8 1.8 1.8DNTP(2.5mM) 1 1 1 1 1T3 引物(10pmol) 1 1 1 1 1T7 引物(10pmol) 1 1 1 1 1Taq酶0.4 0.4 0.4 0.4 0.4ddH20 16.3 16.3 16.3 16.3 16.3total 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul各试剂均加好后,离心机上甩一下,使之沉底,置于PCR仪上反应程序: 94℃ 4分钟94℃ 20秒53.6℃ 20秒35个循环72℃ 4分钟72℃ 10分钟4℃ 24小时待PCR反应进入4℃后,取下PCR薄壁管,取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳,同时上1Kb DNA ladder半小时后照相,观察胶图:insert,vector,阴性三个样品除了有少量引物带(大约在200bp左右)外,均无其他带形.阳性带形清晰.好的连接产物应在500至4,5Kb大小之内形成一条清晰的smear.六.电转化流程1.电转化感受态细胞的制备用枪头挑取单克隆菌落,投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中.(同时做培养基和枪头的空白对照)37℃,220rpm,培养14-16个小时.第二天,以1:100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中,37度,220rpm,振摇2-3小时,每半小时测一次OD,当OD值达到0.3-0.4时,停止培养.将菌液在冰上预冷30分钟,随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中,4℃,2500rpm离心10分钟.弃上清,离心杯中加入少量ddH2O,使沉淀悬浮后,再将水注满离心杯,4℃,4000rpm离心10分钟.弃上清,加少量灭菌水,重悬菌体,再将水注满离心杯,4000rpm,4℃,离心10min.弃上清,往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌,预冷),重悬菌体,再加满10%甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min.弃上清,每个离心杯中加入5ml10%的甘油,使沉淀悬浮后,将菌液以300ul/管分装于1.5ml 的离心管中,-80 ℃冰箱中保存.同时取100 μl感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化,检测转化效率.次日观察转化子生长情况,并记录.2.连接产物纯化1.将连接产物转移至一1.5ml Eppendorf管中,加入下列试剂:10ul of ddH2O2ul of 3M NaAC(PH5.2)50ul of 无水乙醇轻轻混匀,稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上;2.4℃,top Speed 离心30分钟;3.小心移去上清,避免接触到管底的沉淀物;4.加入500ul70%的乙醇,轻轻颠倒几次洗涤沉淀(注:不要离心混匀);5.4℃,top Speed离心5分钟;6.小心移去上清,将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味;7.加入10ulddH2O重新溶解沉淀,4℃短期保存,-20℃长期保存备用;3.电转化从-80℃冰箱中取出感受态细胞,置于冰上解冻;取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中,将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷. 将40～100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml 的离心管中,小心混匀,冰上放置10min. 打开电转仪,调至Manual,调节电压为2.1KV.将此混合物转移至已预冷的电极杯中,轻轻敲击电极杯使混合物均匀进入电极杯的底部; 将电极杯推入电转化仪,按一下pulse键,听到蜂鸣声后,向电击杯中迅速加入1000μl的SOC液体培养基,重悬细胞后,转移到1.5ml的离心管中.7.37℃,220-250rpm复苏1小时.8. 取20ul转化产物加160ulSOC涂板,放于37℃温室,过夜培养,次日查看转化结果.其余菌液加1:1的30%的甘油后混匀-80℃保存.注:每块加有Amp的平板上均匀涂有X-Gal 80μl ,SOC 80μl,IPTG 20 μl.4.电击杯清洗流程用清水将电击杯稍冲一下.向电击杯中加入的75%酒精浸泡2hr.弃去酒精,再用蒸馏水冲洗2~3遍,然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电击杯10遍以上. 加入无水乙醇2ml于电击杯中,浸泡30分钟.弃去无水乙醇,于通风厨内挥干乙醇.将清洗好的电击杯放入-20 ℃冰箱内待用.注:1.不同样品使用的电机杯应分开;2.每周用1%酒精浸泡30分钟.七.快速鉴定,菌落PCR1.质粒快速鉴定试剂:Protoplasting buffer:30mM Tris-HCl, pH8.0 0.33ml/1.0M5mM EDTA 0.1ml/0.5M50mM NaCl 0.1ml/5.0M20% Sucrose 5ml/40%50 g/ml RNAseI 50ul/10mg/ml50 g/ml lysozyme 50ul/10mg/ml补水至10ml,-20℃分装保存.Lysis buffer:89mM Tris-HCl, pH8.089mM boric acid 2ml of 5×TBE2.5mM EDTA2% SDS 2ml of 10%5% sucrose 1.25ml of 40%0.04% bromphenol blue 4mg补水至10ml,-20℃分装保存.步骤:1.将转化后的菌液铺平板,37℃过夜培养.2.配制0 .6--0 .7%的琼脂糖TBE 胶.3.用连续加样枪在96孔板中每孔加入10 l Photoplasting Buffer.4.用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至含有Photoplasting Buffer的96孔板中,振荡混匀.5.用连续加样枪将Lysis Buffer上样于凝胶中,每孔4 l,用排枪将细胞与Protoplasting buffer混合液上样于凝胶中(细胞在Protoplasting buffer中不宜超过30-40 min),并点上Marker.6.调节电压为20V(小槽)或40V(大槽),电泳15min,使细胞充分裂解,将电压调高到200V,继续电泳1hr,照相.7.根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率.2.菌落PCR1.取适量PCR薄壁管,置于冰上,每管先加入17.3ul的灭菌水.2.用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中,振荡混匀.3.依次加入:10x buffer 2.5Mgcl2(25mM) 1.8DNTP(2.5mM) 1T3 引物(10pmol) 1T7 引物(10pmol) 1Taq酶0.4total 25ul各试剂均加好后,离心机上甩一下,使之沉底,置于PCR仪上4.94℃,2min.5. 94℃ 4分钟94℃ 40秒53.6℃ 40秒35个循环72℃ 4分钟72℃ 10分钟4℃ 24小时6.待PCR反应进入4℃后,取下PCR薄壁管,取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳,同时上1Kb DNA ladder.半小时后照相,观察胶图,根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率.7.将快速鉴定和菌落PCR检测合格的文库送检.八.pBlueScript cDNA库扩增1.试剂及配方:2 x LB (1升):20g 氯化钠20g 蛋白提取物10g 酵母提取物加入蒸馏水至1升,用NaOH调pH值至7.0,高压灭菌2 x LB-甘油(12.5%)(200ml)175ml 2 x LB液体25ml 甘油(100%)加入蒸馏水至200ml,压灭菌,置于4℃备用2.步骤将cDNA文库转入大肠杆菌,如DH5a(DH10B)后,取少量菌液涂布氨苄平板,以推算克隆总量.取一大小合适的三角瓶,根据克隆总量配制2 x LB液体,每500ml 2 x LB液体可扩增5x105个克隆,可以适当增加2 x LB液体的量,但不能少于此比例按每100ml加0.3g的比例在2 x LB液体中加入SeaPrep agarose70℃加热搅拌至琼脂糖溶解,高压灭菌后再70℃搅拌30分钟.37℃放置1小时加入适量安苄青霉素,使之终浓度为50ug/ml加入全部菌液,并轻柔旋转使之混匀,避免振荡将三角瓶置于冰水中1小时,水面必须没过三角瓶内液面轻轻取出三角瓶,30℃培养40-45小时10.将三角瓶内容物全部转入离心管中,离心10,000g ,20分钟,必须室温11.弃上清,每100ml培养基离心得到的沉淀用10ml 2x LB-甘油(12.5%)重悬.12.将重悬液留下10ul检测滴度,其余分装于1.5ml离心管,-80℃冰箱内保存13.取1ul扩增后菌液倍比稀释.14.各取10ul 稀释为10-5和10-6的菌液涂布于含安苄青霉素的LB固体平板上,37℃过夜培养,次日计算其克隆数以及扩增后总克隆数.构建cDNA文库实验中所有可能遇到的问题以及解决方法构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二者大同小异。
自制核心链霉亲和素的性质
自制核心链霉亲和素的性质马勇杰;高峰;古宏晨【摘要】在实验室分离和纯化链霉亲和素的基础上对其性质进行了鉴定.在SDS-PAGE中链霉亲和素只有一条带,单体的分子量为14500Da,链霉亲和素的相对分子量约为5800ODa;其等电点为5.9～6.2;结合生物素的活性为15.7U/mg.结果表明自制链霉亲和素为核心链霉亲和素,在纯度、活性等方面达到了理想的效果.【期刊名称】《上海师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2004(033)003【总页数】5页(P67-71)【关键词】链霉亲和素;生物素;聚丙烯酰胺凝胶电泳;等电聚焦电泳【作者】马勇杰;高峰;古宏晨【作者单位】上海交通大学,纳米科学与技术工程中心,上海,200030;上海交通大学,纳米科学与技术工程中心,上海,200030;上海交通大学,纳米科学与技术工程中心,上海,200030【正文语种】中文【中图分类】R392.33自1963年Chaiet[1]首先发现链霉亲和素(Streptavidin,SA)以来，国内外学者对其性质和应用进行了大量的研究.链霉亲和素具有与亲和素(Avidin,AV)相似的生物学特性，如都能与4分子的生物素(Biotin)特异性结合，结合常数为1015/M.同时，由于SA不带糖基、等电点低，在检测中具有比AV低的阴性背景而大大提高了检测的灵敏性.SA-biotin系统既可偶联抗原、抗体及核酸分子,又能被酶等多种材料标记.因此，SA-biotin被用来作为生物反应放大系统，用以检测抗原或抗体[3～5,9].目前，该系统在国外已广泛用于酶免疫、免疫组织化学及分子杂交等技术.但目前，国内所用SA均为价格昂贵的进口产品，因此研制国产化的SA具有重要意义.本实验室经过链霉菌的培养及SA的分离纯化，对SA的性质进行了鉴定，为进一步的产业化奠定了基础.1 材料与方法1.1 SA的制备SA菌株自河北医科大学引进，参照文献[13]，固体培养基(1L)配方为：葡萄糖10g，天冬酰胺1g，酵母粉0.5g，K2HPO4.3H2O 0.1g，KH2PO4 2g，MgSO4.7H2O 0.5g，FeSO4.7H2O 0.01g，琼脂粉20g.发酵液培养基(1L)配方为：葡萄糖10g,蛋白胨3g，黄豆饼粉10g,NaCl 2.5g,CaCO3 2g.将菌种接种到固体培养基，28℃温箱培养3～5d，当菌落生长到5mm左右，取一定量转接到装有140mL灭菌发酵液培养基的500mL培养瓶中培养，设定细菌培养箱振荡速度为160r/m，温度28℃，连续培养192h.发酵液过滤掉菌体后，用本室制备的亚胺生物素化的纳米磁珠在磁场作用下纯化SA(专利申请号200310109350.3).1.2 SA的性质1.2.1 SA的浓度测定实验所用SA为本实验室制备(链霉菌的培养及链霉亲和素的制备另文报道).用Thermo spectronic Unicom UV300分光光度计测定SA的OD282nm值，通过公式C=A/E(SAE =3.356L/g)计算，即得SA浓度(mg/mL)[10～12].1.2.2 纯度和分子量测定采用常规SDS-PAGE法[15].5%浓缩胶，12%分离胶，上样量约2μg(低分子量标准蛋白为上海西巴斯公司产品，SA分别为自制SA与Sigma-SA).用Bio-rad MP3型电泳槽电泳约90min，先恒压100V，指示剂走至分离胶后改为恒压160V.凝胶用0.25%考马斯亮蓝R250染色15min，脱色至清晰，用复日FR-980生物电泳图像分析仪对电泳结果进行拍照.将低分子量标准蛋白的相对分子量取对数，与他们在SDS-PAGE中的迁移距离做线性回归得logMW=a-bRf.1.2.3 等电点测定采用IEF-PAGE法[14].凝胶板面积240×200(mm)，厚0.5mm.胶浓度7.5%，交联度3%，载体两性电解质pH4-10(上海化学试剂公司产品).阳极电解液为1MH3PO4，阴极电解液为1MNAOH.经去离子水透析的SA(0.36mg/mL)与样品缓冲液等体积混匀，将5×5(mm)滤纸放入样品中浸透，多余的水分用滤纸吸干，放于偏向阴极一侧.用DYC-37A型电泳槽(北京六一仪器厂)电泳，先恒压200V45min，再恒压500V至电流不再下降为止.等电聚焦结束后沿电流方向在凝胶边缘切宽1cm的均匀长条，按从正极到负极顺序每隔1cm切成一块，放入指形管中，加1mL双蒸水盖紧，1h后测pH值，以pH为纵坐标、迁移距离为横坐标绘制标准曲线.凝胶用10%TCA浸泡15min，1%TCA浸泡2h，0.25%考马斯亮蓝R250染色.1.2.4 SA活性测定采用233nm紫外光谱测定法.在比色皿中加SA(44.5μg/mL)1mL，分次加入0.1μg/μL的生物素，用Thermo spectronic Unicom UV300分光光度计测定233nm OD值，以吸收值不再增加时的生物素总μg数除以比色皿中SA的mg 数，即SA的活性单位[6].1.2.5 紫外吸收扫描图谱用Thermo spectronic Unicom UV300分光光度计对1mL50μg/mL的SA进行200～340nm紫外区域连续扫描，加入过量生物素(0.1mg/mL20μL)后再次扫描比较曲线的变化.2 结果2.1 纯度和分子量测定如图1所示，自制SA在SDS-PAGE中显示一条带，与Sigma-SA基本位于同一位置.以低分子量标准蛋白lgMW为纵坐标，以蛋白的相对迁移率Rf(表1)为横坐标作图并作线性回归得lgMW=5.0793-1.1575Rf，SA的相对迁移率为0.793，得MW=14500.SA由4个亚基组成，所以SA的分子量为58000Da.表 1 标准蛋白分子量的测定结果proteinMWl gMWRf兔磷酸化酶b974004.990.138牛血清白蛋白662004.820.207兔肌动蛋白430004.630.333牛碳酸酐酶310004.490.494胰蛋白酶抑制剂201004.300.678鸡蛋清溶菌酶144004.160. 816图 1 SA的SDS-PAGE图图 2 SDS-PAGE分子量标准曲线2.2 等电点测定SA的IEF-PAGE的标准曲线如图3，线性回归方程为pI=0.3544RF+3.8341.将SA的迁移距离代入方程得SA的等电点.经多次实验得到SA的等电点为5.9～6.2. 图3 SA的等电聚焦标准曲线2.3 SA活性测定参加反应的SA的量为44.5μg，生物素的量为0.7μg(表2)，因此SA的活性为15.7U/mg.表 2 SA结合生物素活性biotin(0.1μg/μL)OD2330μL0.4922μL0.5242μL0.5312μL0.5441μL0.5461μL0.5 462.4 紫外吸收扫描图谱如图4所示，加入过量生物素后，240nm～223nm波长吸收值增加，其中以233nm处吸收值增加最明显，其余部分曲线重合.图4 SA的紫外吸收扫描图谱3 讨论本文旨在鉴定本室制备的SA的性质，为其产业化并作为进口产品的替代品奠定基础.Cazin等报道[4]，SA完整单体(组成完整SA)的分子量为18000Da，由于发酵液中蛋白酶的作用完整SA单体失去某些末端序列成为核心单体SA(组成核心SA)，其分子量缩小至14000Da左右；Pahler等报道[3]SA完整单体的分子量为16450Da，核心单体SA分子量为13096～13254Da；本室自制的SA单体经SDS-PAGE检验分子量为14500Da.我们认为在链霉菌的培养过程中，由于培养基成分、培养时间及温度等条件不尽相同，SA的纯化方法与条件也有所不同，从而蛋白酶对完整SA作用不同而造成核心SA分子量出现差异.另据报道[3,9]，完整的SA溶解性差、易于聚集，核心SA被蛋白酶水解掉了与活性无关的某些末端序列，一方面提高了结构的稳定性；另一方面由于减少了空间位阻，使SA更容易与生物素化的大分子反应.本室制备的SA，分子量为58000Da，比文献报道的略小[2,5,11,12]，但其生物活性高达15.7U/mg，接近理论值(16.8U/mg).因此推测，本室制备的SA为核心SA，具有较高的生物活性和稳定性. 在纯度上，经SDS-PAGE检验，与Sigma产品一致，均只有一条带，说明自制的SA具有较好的纯度.以上结果表明，我们分离与纯化的核心SA，在纯度与活性等方面都达到了令人满意的效果，为进一步的产业化奠定了基础，同时也证明了我们的分离与纯化方法是切实可行的，值得进一步推广应用.参考文献:[1] CHAIET I,WOLF FJ. The properties of streptavidin, a biotin binding protein produced by streptomycetes[J]. Arch Bio-chemBiophys,1964;106:1-5.[2] BAYER EA, HUR HB, GITLIN G, et al. An improved method for the single-step purification of streptavidin[J]. J Bio-chem BiophyMeth,1986,13(12):103.[3] PAHLER A, WAYNE A,et al. Characterization and Crystallization of Core Streptavidin[J]. J Biol Chem,1987,262(29):13933-13937.[4] CAZIN J, SUTER M, BUTLER JE, et al. Production of Streptavidin in a synthetic medium[J]. J Immunol Meth,1988,113(2):75.[5] BAYER EA, BEN-HUN H, et al. Postsecretory modifications of streptavidin[J]. Biochem J,1989,259(2):369-76.[6] 程振球,章谷生. 链霉亲和素的特性及其应用[J]. 上海免疫学杂志.1992,12(1):56.[7] 程振球,章谷生. 生物素链霉亲和素系统在医学检验中的应用[J]. 中华医学检验杂志.1992,15(4):239.[8] 程振球,朱晴辉,周亦昌,等. 自制链霉亲和素的纯化和特性[J]. 上海免疫学杂志.1993,13(5):303.[9] SANO T, PANDORI MW, et al. Recombinant Core Streptavidins:a minimum-sized core streptavidin has enhanced struc-tural stability and higher accessibility to biotinylated macromolecules[J]. J Biol Chem, 1995, 270: 28204-28209.[10] 贾文祥,孟文彤,胡其乐,等. 链霉菌的培养和链霉亲和素的纯化[J]. 华西医大学报.1995,26(1):113.[11] 贾文祥,黄健,孟文彤. 链霉亲和素的鉴定[J]. 华西医大学报.1995,26(4):436-438.[12] 刘丽,吕占军,王秀芳,等. 分泌链霉亲和素菌株的筛选及其链霉亲和素性质的研究[J]. 河北医科大学学报,2001,2(5):42.[13] 宋淑霞,吕占军,韩丽枝,等. 链霉亲和素产生菌培养条件的研究[J]. 河北医科大学学报.2002,23(1):4.[14] 汪家政,范明. 蛋白质技术手册[M]. 北京:科学出版社,2001.124-131.[15] 分子克隆实验指南[M].北京:科学出版社,第三版,2002.1713-1722.。
免疫化学发光实习鉴定表实习小结
免疫化学发光实习鉴定表实习小结一、项目设计背景1、国际成熟的免疫学自动检测体系及分析早在上世纪八十年代，一些知名的IVD厂商就开始全自动免疫分析仪的研制。
发展到今天，市场上的全自动免疫分析仪已经非常成熟，而检测原理也有着一定的区别。
对此，我们做一个简单的分析。
Abbott公司，第一代产品也是目前世界上临床应用最为成功的全自动免疫分析仪，Axsystem,检测原理是：基于聚苯乙烯粒子包被，碱性磷酸酶标记(Alp)的荧光分析技术，仪器的洗涤体系为其专利的醋酸纤维吸附洗涤，洗涤及检测杯设计得非常精致，科学，保证了检测体系的特异性和精密性，因此在国内，很长一段时间里，Axsystem 的检测结果都作为一些项目检测的金标准。
但是由于体系的检测信号为荧光信号，因此其检测量程相对较低，例如：CEA检测高限最高为500ng；从而影响了项目的检测性能。
第二代产品Architect系列是基于磁珠包被的，吖啶酯标记的化学发光免疫学检测分析仪。
该体系采用磁珠分离体系，吖啶酯标记的化学发光技术，吖啶酯作为化学发光法标记物，优点很多：首先缩短了检测光信号所需要的时间，其次发光集团能够在强碱的作用下脱落，之后在均匀的液相中收集光信号，使体系可能拥有更好的精密度，同时光信号的采集是对整个峰值的积分，使检测体系拥有更广的检测量程，例如：CA125在该体系的检测高限可达1500ng，是Axsystem的3倍。
但吖啶酯标记的化学发光技术为Bayer公司的专利，在应用上存在限制。
Bayer公司（Siemens），全自动免疫检测分析体系实际是来自Ciba-corning检测体系，即：吖啶酯标记，磁珠捕获的化学发光检测体系。
该体系同Architect体系一样，应用吖啶酯有专利的限制。
Beckmen－Coulter公司,碱性磷酸酶标记，磁珠捕获的化学发光检测体系，碱性磷酸酶标记的缺点很多：首先，作为标记物，分子量过大，在免疫学反应过程中可能存在空间位阻从而影响捕获，其次人血清中含有碱性磷酸酶的同工酶，可能存在由于非特异性吸附造成的非特异性发光反应。
高灵敏电化学发光法检测人血清抗甲状腺过氧化物酶抗体
p
j
,LTD,Shenzhen５１８０５５,Ch
２．
ShenzhenPumenTe
chno
l
ogyCo．
i
na)
Ab
s
t
r
a
c
t:Ob
ectຫໍສະໝຸດ ive Humans
e
r
um an
t
i
Ｇt
hy
ro
i
d pe
rox
i
da
s
e an
t
i
body (An
t
i
ＧTPO) wa
sde
t
e
c
t
ed by
j
e
l
l
５ 环 境 下,室 温 反 应
;
次透析去除未交联的小分子;
加入等体
０．
５~１．
５h ３
积甘油,置于 ２~８℃ 长期保存.
２．
２ 磁颗 粒 的 工 作 浓 度 用 PBS 稀 释 链 霉 亲
和素包被 的 磁 珠 至 ０．
７５mg/mL,配 制 完 毕 后 密 封,
２~８℃ 避光保存.
２．
性成分 [１].在滤 泡 细 胞 遭 受 破 坏,机 体 免 疫 调 节 紊
乱,
TPO 暴 露,浆 细 胞 产 生 An
t
i
ＧTPO,参 与 桥 本 病
中滤泡细胞 损 伤 和 破 坏,导 致 甲 状 腺 的 自 身 免 疫 损
伤 [２].An
t
i
ＧTPO 是自身免 疫 性 甲 状 腺 炎 (
ATD)患
值与理论值进行直线拟合,得出相关系数r.
３．
STA COMPACT凝血仪的工作原理及典型故障处理
检测系统 ：这是该仪器的关键部件。仪器通过
收 稿 日期 ：２０ —１ —０ ０８ １ ７ ７ ８
少许气 泡 。 由此 可判 断 ，这 主要是 玻璃 注射 器因长 期使 用磨损 ，孔径 变大 ，气体 通过 活塞 与管 壁之间 的空 隙而漏 入 。更 换新 的注 射器后 ，故 障排 除 。
Ｓ Ａ Ｔ ＣＯＭ Ｐ ＡＣＴ 凝 血 仪 的 工 作 原 理 及 典 型 故 障 处 理
徐 国 庆
（ 安徽省 立 医院物流 中心 ，安徽合 肥 ２０ ０ ） ３０ １
［ 图分 类 号 ］唧 ７ 中 ３ ［ 文献 标 识 码 ］Ｂ ［ 章 编 号 ］ １０ —２７ （Ｏ ９ ３ ０ ８ １ 文 ０２ ３ ６ ２Ｏ ）０ —０７ —０
试 剂冷藏 位 ：为避免试 剂 变质 ，仪 器备有 试剂 冷藏功 能 ，可 以同时放置 几十 种试剂进 行冷 藏 。
样 品及试 剂分 配系统 ：样 品臂 自动提起标 本 盘
中的测试杯 ，将其 置于样 品预 温槽 中进 行 预温 。然 后试 剂臂将 试剂 注入测试 杯 中 ，带有旋 涡混 合器 的 装置 将试剂 与样 品进行 充 分 混合 后 ，送 至 测试 位 ， 检测 后 的测 试杯 被该装 置 自动 丢弃 于废物箱 中。
中。 由此 可判 断 ，此抽 吸装 置存在 漏气或 堵塞 。经 仔 细检查 后 ，发 现 吸杯 头上 的金属 部分有 微堵 。进
前者 可 以放置 几十份 血浆样 品 。吸样针将 血浆 标本 吸取后 放于预 温盘 的测试杯 中 ，可供重 复测试 ， 自
动再 常工作 。 故 障三 ：绝 大部 分 的检测结 果大 于最大值 。 故 障分析 与处理 ：从 上述现 象分 析 ，这 与加入
理：
免疫磁珠分选两步法纯化原代小胶质细胞
， ｉｉ Ｚ Ｎ ｕ，Ｘ ｕ —ｕｎ ｅｉ ｎｔｕｅ ｏ ｅｍ ｃ ｎｅ ａｉ ｌ ｄ ａ Ｕ ｉ ｒｔ， ｅｉｇ ｕＬ— ， Ｅ Ｇ Ｈ ｉ Ｕ Ｑ ｎｙ ａ ．Ｂ ｉ ｇＩｓ ｔ ｒＮ ｕ ｓｉ ｃ ，Ｃ ｐ ａ Ｍｅｉ ｌ ｎｖ ｓｙ Ｂ ｒｎ ｌ ｊ ｎ ｉ ｔｆ ｅ ｔ ｃ ｅｉ Ｃｎｅ ｏ ｅｒｌ ｅｅｅ ｔ ｎａ ｄＲｐ ｉｎ ， ｅ ａｏａｏ ｆｒ ｅｒｄｇｎｒｔｅ ｉ ａｅ ｏ ｔｅ ｎｓｙｏ ｅｔ ｒｆＮ ｕａ Ｒｇｎｒ ｉ ｎ ｅａｒ ｇ Ｋ ｙＬ ｂｒｔｒ ｏ Ｎ ｕｏｅｅｅａｉ ｓ ｓ ｈ ｉｒ ｆ ａｏ ｉ ｙ ｖＤ ｅ ｓ ｆ Ｍｉ ｔ
【 ｅ ｏｄ 】 Ｍｉ ｏｌ ； ｇｅ ｃａｔ ａｅ ｅ ｏ ｉｇ Ｋ ｙｗ ｒ ｓ ｃ ｇ ａ Ｍａｎｔ ｃｖｔ ｃｌ ｓｒｎ ｒ ｉ ｉ ｉ ｄ ｌ ｔ
小 胶 质 细胞 是 中枢 神 经 系统 中 的 免疫 效 应 细 ａｔ ａｅ ｅ ｏｔ ｇ ＭＡ Ｓ 两 步 法 ， 得 较 高 纯 度 ｃ ｖｔ ｃｌ ｓｒｎ ， Ｃ ） ｉ ｄ ｌ ｉ 获 胞 。虽 然 仅 占 全 脑 神 经 胶 质 细 胞 总 数 的 ５ ～ ％ 并 能够尽 可 能反映其 在体情 况 的原代 小胶 质细胞 。 ２ ０％ ＿ 但 是 ， 胶质 细胞参 与 中枢神 经 系统 的众 多 １ 小 材料 与方法 生 理活 动 ， 与许 多疾病 的发生 发展 密切 相关 【 ， 并 ２ 特 ］
孙珊 珊 王蓓蓓 鞠 莉 莉 曾辉 徐群渊
【 要】 目的 神经 系统感染研究需获得纯度高 、 摘 细胞生物学状态 接近体 内的小胶质细胞 。既 往分离纯化方法不能满足研究需要 ， 需建立新的高效纯化方法。方 法 获得小 鼠全脑单细胞 悬液后 ，
应用磁珠分选 阳选 法 ， 过两 步分 选获 得小 胶 质细胞 。用 流式 细胞仪 检 测小 胶质 细胞 的纯度 ， 经 瑞 氏． 姬姆萨染色观察细胞形态 ， 采用 ７Ａ Ｄ染色鉴定分选后细胞的活性 。结果 －Ａ １ ３ ） 。该方法所获得的小胶质 细胞 活性良好 ， ．５ ％ 形态正常。结论
mRNA提取
mrna使用TRIZO L肯定没有什么好效果的，它只限于提取RNA,然后在使用Q IGEN或是PROMEGA的磁珠法试剂盒来提取1.样品一定要新鲜，对于MRNA来说首要的就是RNA的完整以及纯净，如果RNA都有所讲解的话，那么会影响MRNA的质量，如果是用来构库的话会影响库容量的。
所以小鼠我们就是一边杀，一边提取RNA，如果没有条件就带上液氮桶，然后马上提取，不新鲜的组织效果非常的差。
而且组织的量必须要足够，因为提取的MRNA是RNA的1%，而且要保证后续试验的用量。
2.选用的提取试剂盒是关键，比如Q IGEN有人说好有人说不好，这肯定和组织本身的MRNA丰度有关。
但是查阅文献大部分人用的就是QIGEN，他的基本原理还是使用纤维素。
而PROMAGE的盒子比较便宜，但是效果不如人意，它的损耗比较大，虽然磁珠法比较新颖，但是我自己试验很多次，发现起始量要很大才可以，国产上海华舜的比较不错，便宜而且纯度很好，我自己用的就是这个试剂盒。
关于提取MRNA最重要的就是组织的新鲜程度，如果是细胞就是细胞的数量，其次就是试剂盒的选择，第一次作的时候比较紧张不容易出现，总结经验慢慢就可以了我自己的程序mRNA提取(Promega,PolyATtract mRNA Isolation Sy stems)(Sy stemsⅢand Ⅳ，每次总RNA<1mg)玻璃仪器200°C烘烤过夜；塑料仪器在0.1N NaO H，1mM EDT A中彻底清洗,随后用无RNA酶水清洗；CO REX管用DEPC处理，不烘烤。
1．探针退火1.5mlEP管中加入总RNA（0.1mg~1.0mg）加入RNase-free水使体积至500μl65°C热休克10 min加入Biotiny lated-O ligo(dT) Probe3μl和20×SSC13μl，轻柔混合，室温孵育(<=10min)直至完全cool2．0.5 ×SSC,0.1×SSC准备1.2ml 0.5×SSC: 20×SSC(30μl)+RNase-free水(1.170ml)1.4ml 0.1×SSC: 20×SSC( 7μl)+RNase-free水(1.393ml)3.清洗Streptav idin-Paramagnetic Particles（SA-PMPs）轻触/弹（flick）SA-PMPs管的底部至SA-PMPs完全分散SA-PMPs管放在磁力架（Magnetic Stand）上，至SA-PMPs聚集在管一侧（约30秒）用枪小心移去液体（SA-PMPs不能离心）取下SA-PMPs管，加入0.5×SSC300μl，轻触/弹管底至SA-PMPs完全分散。