比色法和可见分光光度法- 第三章仪器分析法简单介绍
第三章紫外可见分光光度法
23
3.双波长
将不同波长的两束单色光(λ 1、λ 2) 快束交替通 过同一吸收池而后到达检测器。产生交替信号。无需 参比池。△=1～2nm。两波长同时扫描即可获得导数 光谱。
max也作为定性的依据。不同物质
的λmax有时可能相同，但ε
定量分析的依据。
max不一定相同。
（6）吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比,
10
3．紫外-可见吸收光谱的产生
由于分子吸收紫外-可见光区的电磁辐射，分 子中价电子（或外层电子）的能级跃迁而产生紫 外-可见吸收光谱。 电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动
紫外分光光度计检测；可作为溶剂使用。
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2、n→ζ＊跃迁
所需能量较大。 吸收波长为150～250 nm，大部分在远紫外区 ，近紫外区仍不易观察到。
含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O、S和卤
素等杂原子)均呈现n →ζ*跃迁。 如一氯甲烷、甲醇、三甲基胺n →ζ*跃迁的λ分 别为173 nm、183 nm和227 nm。
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1、σ →σ ＊跃迁
所需能量最大，ζ电子只有吸收远紫外光的能量 才能发生跃迁。
饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区。
吸收波长λ< 200 nm。 例：甲烷λmax为125 nm , 乙烷λmax为135 nm， 环丙烷（饱和烃中最长） λmax为190 nm。 在近紫外没有饱和碳氢化合物的光谱，需真空
8
2．能级跃迁的讨论
（1）转动能级间的能量差Δ Er：0.005～0.050 eV， 跃迁产生吸收光谱位于远红外区，称为远红外 光谱或分子转动光谱； （2）振动能级的能量差Δ Ev约为：0.05～１eV，跃
第三章 仪器分析 紫外-可见吸收光谱法
R hv
C O
_R
+
C
O
电子给予体
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电子接受体
第一节 基本原理
6. 配位体场跃迁
在配体的作用下，过渡金属离子的d轨道和
镧系、锕系的f 轨道裂分，吸收辐射后，产生d一d、
f 一f 跃迁；
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第一节 基本原理
各种电子跃迁吸收光谱的波长分布图
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第一节 基本原理
1、 * 跃迁
化合物：所有存在σ键的有机化合物。 能 量：最大 波 长：最短，处于小于200 nm的真空紫外区。 如甲烷的为125nm ，乙烷为135nm
注意：在此波长区域中，N2、CO2、O2和H2O有吸收，难以 应用，一般不讨论σ-σ*跃迁所产生的吸收带；但可作溶剂， 如 己烷、庚烷、环己烷等。
度为纵坐标作图，这样得到的谱图称为该物质的吸收光谱或
吸收曲线。
1
4
A2
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3
λ
250 300 350 400nm
概述
2）吸收曲线的讨论
①同一种物质对不同波长光的 A 不 同。 A 最大处对应的波长称为λmax
②不同浓度的同一种物质，其吸收 曲线形状相似，λmax不变。
③对于不同物质，它们的吸收曲线 形状和λmax则不同——定性分析
物质的吸收光谱与测定条件有密切的关系。测定条 件（温度、溶剂极性、pH等）不同，吸收光谱的形状、 吸收峰的位置、吸收强度等都可能发生变化。
1.位阻效应
共轭效应使共轭体系形成大 π键，结果使各能级间的 能量差减小，从而所需能量也相应减小，因此共轭效应使 吸收波长产生红移。
分光光度法
原子发射光谱法 (atomic emission photometry) 分子发光分析法
II. 可见-紫外分光光度法
一、概述
1、定义：
利用物质的分子或离子对某一波长范围 的光的吸收作用，对物质进行定性、定量 及结构分析的方法
3、所用仪器： 分光光度计(spectrophotometer)
（1）主要部件：
信
光 源
单
吸
检
色
收
测
器
池
器
号 显 示 系
统
（2）使用： 1．开电源开关，打开箱盖，预热10min
2．将空白管、对照管、测定管分别装入 比色皿(3/4vol),并用吸水纸擦干光面外壁
3．选定波长
4．打开箱盖(光路开关自动关闭)，用空 白管调T=0
5. 盖上箱盖(光路开关自动打开)，再用空 白管调T=100%(若调不到，则可调节灵敏 度开关)
6．将选择开关旋至A,此时显示数值应为0， 否则调节“消光零”旋钮调至0
7．逐步拉出试样架拉手，读取各管吸光度 值A
8．全部测定结束后，取出比色皿(洗净)， 关闭开关
4、比色法的定量方法：
①标准曲线法: 将一系列浓度不同的标准溶液按照一定
选择吸收
----组成物质的分子仅吸收与其内能变化 (基态与激发态能量差)相对应的波长或 频率的光，所得到的光谱称为吸收光谱
能量释放
----处于较高能态的分子(激发态分子)不稳 定，当其返回基态时，以热或发射光谱的 形式将能量释放出来。所发射出的相应光 谱，称分子发射光谱
激发态 发 射 光 谱
E1 吸 收 光 谱
比色法与紫外可见光光度法
比色法的干扰因素较多，如颜色干扰、浊度等，而紫外可见光光度法对样品的 要求较高，但干扰因素较少。
应用范围的比较
应用范围
比色法通常用于测定有色物质，如重金属离子等，而紫 外可见光光度法则可以用于测定许多有机和无机物质。
适用范围
比色法适用于一些特定的化学反应和物质，而紫外可见 光光度法则广泛应用于各种化学和生物分析领域。
比色法的应用领域
总结词
比色法广泛应用于化学、生物、医学等领域，用于测定金属离子、有机物、生物大分子 等的含量。
详细描述
比色法具有操作简便、准确度高、适用范围广等优点，因此在化学、生物、医学等领域 得到广泛应用。例如，在化学分析中，比色法可用于测定金属离子、有机物、无机物等 的含量；在生物领域，比色法用于测定生物大分子如蛋白质、酶、核酸等的含量；在医
要点二
详细描述
比色法是一种常用的化学分析方法，通过比较有色溶液的 颜色深浅来测定物质含量。该方法基于物质对光的吸收和 反射特性，当光线通过有色溶液时，特定波长的光被吸收 ，其余的光则被反射或透射。溶液颜色的深浅与物质含量 成正比，因此可以通过比较标准溶液和未知溶液的颜色深 浅来测定未知溶液中物质的含量。
药物分析
用于药物成分的定量和定性分析，以及药物 生产过程中的质量控制。
食品检测
用于检测食品中的添加剂、农药残留、重金 属等有害物质。
医学诊断
用于检测生物样品中的激素、蛋白质、酶等 生物活性物质，辅助医学诊断和治疗。
04 比色法与紫外可见光光度法的比较
CHAPTER
操作难度的比较
1 2
操作难度
比色法通常较为简单，需要的仪器设备较少，而 紫外可见光光度法需要使用紫外-可见分光光度 计，操作相对复杂。
目视比色法和分光光度法的分析和比较
目视比色法和分光光度法的分析和比较2015年12月5日龙浪李珂璇王宇鑫李嘉浩程卫东王佳佳临床医学院指导教师：徐尧一、摘要本讨论报告通过分析和比较目视比色法和分光光度法两种比色法的主要优缺点，即目视比色法操作简便但精度较低，分光光度法精确度较高但对溶液的性质要求较高；并且结合实例说明两种比色法各自的适用范围和浓度限制，即两种比色方法分别在光的波长、物质的组分、以及对朗伯-比尔定律的符合情况上有不同的适用范围，并给出了适用的吸光度范围（0.2-0.8）和浓度范围。
由此针对不同情况给出了不同的选择方案。
这对实际的研究和生产生活具有指导性的意义。
二、前言在确定有色溶液待测组分含量时，常常可以通过比较和测量溶液的颜色来进行，这种方法叫做比色法。
早在19世纪30-40年代，比色法就开始作为一种定量分析的方法被应用到研究和生产中。
常用的比色法有目视比色法和分光光度法两种，其中前者主要通过眼睛观察得出结论，后者借助光电比色计进行。
由于这两种比色方法的实际应用非常广泛，因此分析和比较两种方法对于方法的优化显得尤为重要。
三、内容（一）两种比色方法优缺点比较1.目视比色法1）优点（1）比色时操作简便，成本较低相比分光光度法，目视比色法不需要动用分光光度计，只需要几个比色管便可以完成测定，因此显得仪器设备简单，操作简便，使用成本低。
同时节省了电能，有利于能源的节约和保护。
在分析大批试样时，其优势就显得更加明显，大大节省了人力、物力、财力以及测定消耗时间。
在本实验中，我们仅需配置5个标准溶液，便可直接在比色管架上进行比较，与分光光度法中所需的多次清洗比色皿的操作要求相比比较简易。
（2）适用范围较广，可用于不严格符合Lambert-Beer定律的情况目视比色法是通过比较通过光的强度来测定组分含量，可以在白光下进行[2]，因此对于有些不严格符合Lambert-Beer定律的显色反应也是适用的。
例如在用碘量比色法测定油脂中过氧化值时，碘和淀粉反应的特征蓝色只有在含碘量在2~10μg[6]时才较为严格地符合Lambert-Beer定律，因此只要反应产生的碘稍稍过量或不足，使用分光光度法测定就会产生较大误差，只能使用目视光度法。
分析化学(仪器分析)第三章-仪器分析(UV)
1
第一节
概述
一、紫外-可见吸收光谱法
根据溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱
区辐射能的吸收来研究物质的组成和结构的方法。
包括比色分析法和紫外-可见分光光度法。 紫外-可见吸收光谱的产生：分子价电子能级跃迁。 波长范围：10-800 nm.
(1) 远紫外光区: 10-200nm
(2) 近紫外光区: 200-400nm (3) 可见光区:400-800nm
结束结束结束25一基本部件二分光光度计的构造原理26紫外可见分光光27光源单色器样品室检测器显示光源在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱具有足够的辐射强度较好的稳定性较长的使用寿命
第三章 紫外-可见吸收光谱法
第一节 概述
第二节 紫外-可见吸收光谱
第三节 紫外-可见分光光度计
第四节 紫外-可见吸收光谱法的应用
金属离子的影响，将引起配位体 吸收波长和强度的变化。变化与成键 性质有关，若共价键和配位键结合， 则变化非常明显。
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3.电荷转移吸收光谱
电荷转移跃迁：辐射下，分子中原定域在金属
M轨道上的电荷转移到配位体L的轨道，或按相反
方向转移，所产生的吸收光谱称为荷移光谱。
Mn+—Lbh M(n-1) +—L(b-1) h [Fe2+SCN]2+ [Fe3+SCN-]2+ 电子接受体
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2. 定量分析
依据：朗伯-比耳定律—分子吸收光谱定量分析 的基本定律，它指出：当一束单色光穿过透明介质 时，光强度的降低同入射光的强度、吸收介质的厚 度以及光路中吸光微粒的数目成正比。
吸光度： A= e b c 透光度：-lgT = e b c
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分光光度法
物质对光的选择性吸收
1、光的基本性质
光具有波粒二象性，即波动性、粒子性。 描述其波动性的主要参数是：波长λ，频率 γ ，光速C。 三者间关系为： λγ＝C 根据波长的不同，可分为：p396
紫外光区：200nm ～ 400nm
可见光区：400nm ～ 750nm
光度分析法的特点
—灵敏度高：测定下限可达10－5～10－6mol/L, 10-4%～10-5%
– 准确度高一般吸光光度法的相对误差为2-5%， 对微量成分来说，还是比较满意的，因为在 这种情况下，滴定分析法和重量法也不够准 确了，甚至无法进行测定。
– 操作简便快速 – 应用广泛:几乎所有的无机离子和有机化合物
互补色光
黄
绿
青
橙
白光 青蓝
红
紫蓝
物质的颜色
如KMnO4吸收绿色光，因此KMnO4溶液呈现紫色。
3 吸收曲线
将不同波长的光透过某一固定的溶液，测量不同波长下溶液对光 的吸光度，作图得到光吸收曲线,描述物质对不同波长光的吸收。
A 1.6
λmax
D
A、B、C、D代表不同浓 度下的吸收曲线。
1.2Biblioteka C 0.8红外光区：750nm ～ 1000μm
光的粒子性：如光电效应。 光子的能量（E）决定于光的频率和波长：
Ehr h c
具有同一波长的光称为单色光。
不同波长组成的光称为复合光。
白光（如日光）是复合光，是由红、橙、黄、绿、 青、蓝、紫等光按适当的强度比例混合而成的，在 400nm～750nm 范围的一种复合光。
B
0.4
A
400 480 560 640 720 λnm KMnO4 溶液的吸收曲线
仪器分析各个章节小结
仪器分析各个章节小结仪器分析是对于物质进行定性、定量和结构分析的一种方法。
它是近几十年来发展迅猛的一门科学，已经成为当代化学、生物学、药学和地球科学等各类研究工作中不可缺少的分析技术。
在仪器分析课程中，涵盖了许多章节，如下。
第一章：分光光度法分光光度法是利用物质对光的吸收作用来分析物质的一种方法。
该方法是一种非常常用、快速准确的分析方法，可以用于测定有机和无机物质，例如测量肝素、胆固醇、蛋白质、染料、金属离子等的浓度。
分光光度法的测定方法有单波长法、多波长法和倒置分光光度法等。
单波长法测定速度快，但多波长法测定的结果更加准确。
第二章：原子吸收光谱法原子吸收光谱法利用物质吸收特定波长的光来分析物质的成分和浓度，这种方法是一种分析化学的经典技术。
原子吸收光谱法的主要优势是其选择性、准确性和精确程度都比较高。
原子吸收光谱法的应用范围广泛，可以用于测定钠、钾、镁、铜、铅、锌等元素的含量。
第三章：荧光分析法荧光分析法是利用物质对光的荧光特性来分析物质的一种方法。
这种方法对于非常微小的样本也具有极高的灵敏度，可以用于检测基于荧光信号的分子诊断，荧光标记的细胞和生物分子等。
在荧光分析法的范畴中，有几种不同的方法，包括比色融合法、固相光谱法和时间分辨荧光光谱法等。
每种方法都有其独特的应用领域和优劣点。
第四章：分析色谱法分析色谱法是一种广泛应用于分析化学、生物化学和环境科学中的方法。
该方法是通过将样品通过色谱柱来分离各种成分，再用检测器来检测成分的浓度来进行分析。
分析色谱法包括气相色谱法、液相色谱法和毛细管电泳法等。
它们的使用范围广泛，涉及到生物和药物的分析、环境监测等方面。
第五章：电化学分析法电化学分析方法是利用电化学反应的原理进行定量分析的方法。
在电化学分析领域中，包括电位滴定法、极谱法和循环伏安法等多种方法。
电化学分析法的优点在于对物质进行非常精确的定量分析，对样品的形状和大小没有要求。
这种方法可以应用于分析化学、电化学和材料科学中的很多方面。
比色法与紫外可见光光度法
03
紫外可见光光度法基础
紫外可见光光度法的定义
紫外可见光光度法是一种基于物质吸 收紫外-可见光特性进行定量和定性分 析的方法。
它利用物质对紫外-可见光的吸收特性， 通过测量物质溶液的吸光度，实现对 物质的分析。
紫外可见光光度法的基本原理
物质对紫外-可见光的吸收遵循朗伯比尔定律，即吸光度与溶液浓度呈线 性关系。
VS
通过测量不同波长下的吸光度，可以 确定物质的特征光谱，进而进行定性 和定量分析。
紫外可见光光度法的应用领域
环保监测
用于检测水体、土壤等环境样品中的重 金属、有机污染物等。
临床检验
用于检测人体内的代谢产物、药物残 留等。
食品药品安全
用于检测食品、药品中的添加剂、农 药残留等。
化学分析
在化学分析领域中，紫外可见光光度 法常用于痕量组分的分析，如金属离 子、有机化合物等。
04
比色法与紫外可见光光度 法的比较
操作难度的比较
操作难度
比色法通常较为简单，需要的仪 器设备相对较少，而紫外可见光 光度法则需要较为复杂的仪器设 备，操作过程也相对繁琐。
实验要求
比色法对实验环境的要求较低， 而紫外可见光光度法则需要在暗 室中进行，对环境的要求较高。
实验操作
比色法在实验操作上较为简单， 而紫外可见光光度法则需要更多 的实验操作步骤。
感谢您的观看
THANKS
比色法是一种基于颜色反应的分析方法，通过观察有色物质 的颜色变化来测定物质的浓度。而紫外可见光光度法则利用 物质在紫外-可见光区的吸收特性来进行分析。
研究目的和意义
研究目的
对比色法和紫外可见光光度法的原理、特点、应用范围进行深入探讨，分析其在不同领域的应用案例，为实际应 用提供理论支持和实践指导。
比色及吸光光度法
比色及吸光光度法教学目的：1、掌握比色分析法的特点、方法原理，应用范围和一些专业术语。
2、明确溶液颜色与光吸收的关系。
3、掌握朗伯-比耳定律的物理意义及其应用。
教学重点：朗伯-比耳定律教学内容：第一节概述一、比色分析法比色分析法：利用比较溶液颜色深浅的方法来确定溶液中有色物质的含量。
有色物质溶液颜色越深，浓度越大；颜色越浅，浓度越小。
二、比色分析法测定步骤①选择适当显色剂，使被测组分转变成有色物质，称为显色阶段。
测定无色溶液时要进行显色阶段。
②选择最佳条件测定溶液的深浅度，称为比色阶段。
三、发展过程：目视比色法→光电比色法→分光光度计（吸光光度法）四、比色与分光光度法的特点比色和分光光度法主要用于测定微量组分。
1、灵敏度高：测定试样中微量组分（1～0.001%）常用方法，甚至可测定10-4 ~ 10-5%的痕量组分。
2、准确度高：一般比色法相对误差为5～10%，分光光度法为2～5%，其准确度虽比重量法和滴定法低，但对微量组分的测定已完全满足要求。
如采用精密分光度计，误差将减少至1～2%。
3、应用广泛：几乎所有的无机离子和许多有机化合物都可以直接或间接地用比色法和分光光度法进行测定。
4、操作简便、快速，仪器设备也不复杂。
例如：试样中含Cu量为0.001%，即在100mg试样中含Cu 0.001mg，用比色法可以测出。
如用碘量法进行滴定分析测定：设Na2S2O3溶液浓度为0.05mol/L，消耗体积为V（mL），则：0.001/63.55 = 0.05·VV = 0.0003（mL）所需Na2S2O3标准溶液0.0003mL，无法用化学分析法来测定，但比色和吸光光度法完全可以准确的测定其含量。
第二节光的基本性质：光具有两象性：波动性和粒子性1、波动性：入ν = c入：波长（nm）ν：频率（Hz）c：速度（3×1010 cm/s）例如：光的反射、折射、衍射、偏振、干涉等现象。
2、粒子性：E = h νE：光量子能量h：常数（普朗克常数=6.6256×10-34 J·s）ν：频率不同波长（或频率）的光，其能量不同。