基于棉花转录组测序的SSR分子标记的开发
分子标记的发展及分子标记辅助育种
分子标记的发展及分子标记辅助育种分子标记辅助选择育种(Marker Assisted Selection (MAS)或Marker Assisted Breeding)是利用与目标基因紧密连锁的分子标记或功能标记），在杂交后代中准确地对不同个体的基因型进行鉴别，并据此进行辅助选择的育种技术。
通过分子标记检测，将基因型与表现型相结合，应用于育种各个过程的选择和鉴定，可以显著提高育种选择工作的准确性，提高育种研究的效率。
分子标记辅助育种示意图DNA分子标记相对同类技术来说具有很强的优越性：因为大部分标记为共显性，对隐性性状的选择十分有利；数量极多，应对极其丰富的基因组变异；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用标记分析；不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁等等。
随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术也有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴定、基因库构建、基因克隆等方面。
分子标记的类型分子标记按技术特性可分为三大类。
第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR反应)为基础的各种DNA指纹技术；第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)，由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入／缺失等。
分子标记是以DNA多态性为基础，因而具有以下优点：①表现稳定，多态性直接以DNA 形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响；②数量多，理论上遍及整个基因组；③多态性高，自然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为大量重要性状基因紧密连锁的标记筛选创造了条件；④对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁；⑤部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体；⑥成本不高，一般实验室均可进行。
ssr分子标记原理
ssr分子标记原理SSR分子标记原理引言：SSR分子标记（SSR molecular tagging）是一种用于分析和鉴定生物体内特定分子的技术。
它基于分子生物学和生物化学的原理，通过特定的标记物，可以在细胞、组织或体液中准确地检测和定位目标分子。
本文将介绍SSR分子标记的原理及其在科研和医学领域的应用。
一、SSR分子标记的原理SSR分子标记是一种基于DNA序列多态性的分子标记技术。
它利用了DNA序列中的简单重复序列（simple sequence repeat, SSR），即由1-6个碱基重复组成的核酸序列。
SSR序列在基因组中广泛存在，具有高度变异性和遗传稳定性，因此可以作为DNA分子标记的候选序列。
SSR分子标记的原理可以简单概括为以下几个步骤：1. DNA提取：从样品（如细胞、组织或体液）中提取总DNA。
2. SSR标记物设计：根据目标分子的序列信息，设计特异性引物，引物的两端分别包含互补的SSR序列。
3. PCR扩增：利用PCR技术，使用设计好的引物对DNA进行扩增，扩增产物中包含了目标分子的序列和SSR序列。
4. 电泳分析：将PCR扩增产物进行电泳分析，根据SSR序列的长度变异性，可以将不同样品中的目标分子进行定性和定量分析。
二、SSR分子标记的应用SSR分子标记技术在科研和医学领域具有广泛的应用价值，以下是几个典型的应用案例：1. 遗传多样性研究：SSR分子标记可以用于研究不同物种或不同个体间的遗传多样性。
通过对多个基因座进行SSR分子标记，可以获得物种或个体的遗传背景信息，进而推断种群结构、基因流动和进化关系等。
2. 基因定位和图谱构建：SSR分子标记可以用于构建遗传图谱，帮助研究人员定位和克隆感兴趣的基因。
通过SSR标记物在遗传图谱上的位置，可以确定目标基因的大致区域，为后续的克隆工作提供有力的指导。
3. 疾病诊断和预后评估：SSR分子标记在医学诊断中的应用也日益广泛。
通过对特定基因的SSR序列进行分子标记，可以检测和鉴定与疾病相关的突变或多态性。
ssr分子标记技术存在问题
ssr分子标记技术存在问题SSR（Single-Strand Conformation Polymorphism Analysis）分子标记技术是一种常用的分子生物学工具，用于检测DNA或RNA的序列变异。
然而，虽然SSR分子标记技术在许多领域都有着广泛的应用，但它也存在一些问题需要解决。
本文将探讨SSR分子标记技术存在的问题，并提出一些解决方案。
第一部分：介绍SSR分子标记技术首先，让我们简单介绍一下SSR分子标记技术。
SSR是指简单重复序列（Simple Sequence Repeats），也被称为微卫星序列，它是DNA 或RNA分子中短序列的重复单元。
SSR分子标记技术可以通过PCR扩增和凝胶电泳等方法来分析样品中这些重复序列的长度变异，从而研究基因型和表型之间的关系。
第二部分：SSR分子标记技术存在的问题然而，尽管SSR分子标记技术在基因型鉴定、种群遗传结构分析和品种选育等方面表现出了良好的应用前景，但它也存在以下几个问题：1. 数据分析复杂：SSR分子标记技术获得的数据通常需要进行复杂的分析，包括基因频率、遗传多样性等统计学参数的计算。
这对于非专业人士来说可能是一个挑战。
2. 缺乏标准化操作流程：不同实验室或研究机构之间使用的SSR分子标记技术操作流程可能存在差异，导致结果的可比性不高。
3. 多态性程度低：由于SSR分子标记技术只能分析简单重复序列，因此它对于复杂基因组的分析有一定局限性。
在某些物种中，SSR位点的多态性程度较低，导致分辨率不高。
第三部分：解决方案尽管SSR分子标记技术存在问题，但我们可以通过以下途径来解决这些问题：1. 开发简化的数据分析工具：研究人员可以开发易于使用且功能强大的数据分析工具，以简化SSR分子标记技术数据的处理过程，并提供可视化和统计学参数计算等功能。
2. 建立标准化的操作流程：国际间的合作可以制定和推广SSR分子标记技术的标准化操作流程，确保不同实验室或研究机构之间获得的结果具有可比性。
SSR分子标记在作物遗传育种中的应用_罗冉
基因组学与应用生物学，2010年，第29卷，第1期，第137－143页Genomics and Applied Biology,2010,Vol.29,No.1,137－143评述与展望Review and ProgressSSR 分子标记在作物遗传育种中的应用罗冉吴委林张旸李玉花*黑龙江哈尔滨东北林业大学生命科学学院,哈尔滨,150040*通讯作者,lyhshen@摘要SSR (simple sequence repeat)是建立在PCR 技术上的一种广泛应用的分子标记，具有含量丰富、多态性高、共显性等优点。
本文简要介绍了SSR 分子标记技术的原理和特点，重点介绍了SSR 分子标记技术在作物遗传育种中的应用，主要在作物遗传多样性、基因定位、分子辅助标记、遗传图谱构建、品种鉴定和纯度鉴定等方面进行阐述。
关键词SSR,分子标记,作物,遗传育种SSR Marker and its Application to Crop Genetics and BreedingLuo Ran Wu WeilinZhang Yang Li Yuhua *Heilongjiang Harbin College of Life Sciences of Northeast Forestry University,Harbin,150040*Corresponding author,lyhshen@ DOI:/10.3969/gab.029.000137Abstract SSR (simple sequence repeat)is a classic technique for molecular marker based on PCR technique,which had many advantages,such as abundance,high polymorphism,co-dominance etc.This paper has clarified the concept and characteristics of SSR marker,then presents emphatically its application to plant genetics and breeding,and focus on genetic diversity,gene mapping,marker assistant selection,construction of genetic map,varietal identification,purity identification and so on.Keywords SSR (simple sequence repeat),Molecular markers,Crop,Genetics and breeding /doi/10.3969/gab.029.000137基金项目：本研究由国家科技部863项目(2008AA10Z156)和国家自然基金重点项目(30730078)共同资助遗传标记(genetic marker)是指在遗传分析上用作标记的基因，也称为标记基因。
分子标记技术及其在棉花遗传育种中的应用
一
２ ３ ９ —
摩 业 础 挝她
苷 酸 多态 性
２ ０ １ ５ ． ４ 经 济作 物
摘要 ： 介 绍 了几种 分 子标 记 及 原理 ， 综 述 了其 在棉 花遗 传 图谱 的构 建 、 遗传 多样 性 的鉴 定 、 ＱＴ Ｌ ｓ 的 定位 、 标记 辅 助 育种 、 亲缘 关 系 的鉴 定及 种 子 纯度 的检 测 方 面的应 用情 况 ， 为棉 花 育种等 相 关研 究
提 供 了理论 依据 和技 术指 导 。
生及 产量 的 影 响 ［ Ｊ ］ ． 江西 农 业 学 报 ， ２ ０ １ ３ ， ２ ５ （ ５ ） ： ６ ４ — ６ ５ ．
『 ｌ Ｏ ］ 葛洪滨 ， 刘宗 发 ， 马众 文 ， 等． 不 同 杀 菌 剂 对 连 作 花 生 叶 斑 病
的 防 治效 果及 产 量 影 响 ［ Ｊ ］ ． 花 生学报 ， ２ ０ １ ４ ， ４ ３ （ １ ） ： ５ ２ — ５ ５ ． ［ １ １ 】 王苏影 ， 刘宗 发 ， 马众文 ， 等． 配施 硼肥 ・ 钼 肥 对 花 生 产 量 的
作 障碍 的效 果 【 Ｍ 】 ／ ， 中国 科 学 院 红 壤 生 态 实 验 站 主 编 ． 红 壤 生 态 系统研究 （ 第 五集 ） ．北 京 ：中 国农 业 科 技 出 版 社 ， ９ ９ ８ ：
２ ３ ９ － ２ ４ ４ ．
【 ９ 】 葛洪 滨 ， 刘宗发 ， 曾细华， 等． 不 同拌 种 剂 对 连 作 花 生 病 害 发
［ １ ２ 】 王兴祥 ， 张桃林 ， 戴传超． 连 作 花 生 土 壤 障碍 原 因 及 消 除 技 术研究进展【 Ｊ 】 ． 土壤 ， ２ ０ １ ０ ， ４ ２ （ ４ ） ： ５ ０ ５ — ５ １ ２ ． 『 １ ３ １ 车玉萍 ， 李 振高 ， 潘 映华 ， 王俊华 ， 俞 慎． 施 肥 对 消 除 花 生 连
应用SSR标记方法检测棉花种子纯度
应用SSR标记方法检测棉花种子纯度
张灿;吴照华;汪莲莲;周翠华
【期刊名称】《中国棉花》
【年(卷),期】2012(39)8
【摘要】@@%SSR分子标记纯度检测技术应用于杂交棉花种子生产,室内检测与大田鉴定有较高的正相关性,大大缩短海南种植鉴定所需时间,规避种子生产单位的质量风险,对于促进杂交棉的推广应用具有积极作用.
【总页数】2页(P31-32)
【作者】张灿;吴照华;汪莲莲;周翠华
【作者单位】安徽绿亿种业有限公司,合肥230088;安徽绿亿种业有限公司,合肥230088;安徽绿亿种业有限公司,合肥230088;安徽绿亿种业有限公司,合肥230088
【正文语种】中文
【中图分类】S562.035.3
【相关文献】
1.SSR分子标记技术在种子纯度检测中的应用 [J], 刘奇燕
2.黄瓜种子DNA快速提取新方法及其在SSR检测种子纯度中的应用 [J], 郭依蓬
3.杂交稻种子纯度的SSR分子检测及应用研究 [J], 殷兆晴;王玉平;周黎军;肖小余;李仕贵
4.种子企业应用SSR分子标记鉴定棉花品种真实性和种子纯度 [J], 黄殿成;王飞;
刘建功;刘金海;周关印;李根源;张西岭
5.应用SSR分子标记方法检测玉米种子真实性的几点思考 [J], 李巧英
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SSR分子标记剖析
三、实验用品
1. 仪器设备与耗材：PCR扩增仪、电泳仪和电泳槽、 微型移液器、恒温水浴锅、凝胶成像系统等，离心 管、PCR管、移液器枪头等 2. 试剂 ① 提取缓冲液：100mmol/L Tris· Cl，20mmol/L EDTA ，500mmol/L NaCl，1.5% SDS。 ② 氯仿：异戊醇：乙醇（80：4：16）。
引物 设计
二
使用,筛选SSR位点
5'锚定PCR 分离SSR标记
K可以跟任何核苷酸配对，V不 能与A配对，R不能与G配对， 其他核苷酸均可与它们配对。 这样，VRVRV五个碱基一起 构成了一个封闭碱基群。在 PCR过程中，由于VRVRV不 能与GA配对，该引物与模板 DNA结合的时候，就不会在 (GA)n重复区滑动，只会结合 在如图1所示的位置上，以保 证SSR位点的长度多态性不会 丢失。
SSR座位突变率高，对变异反应非常敏感等等。
2. SSR分子标记的步骤
第一步：基因组DNA 提取 第二步：PCR 第三步：扩增产物电泳检测 第四步：结果分析
微卫星分子标记对18份基因型的扩增结果
3. SSR分子标记引物设计
一
从有关数据库（GenBank, EMBL DDBJ等）或文章中查 询
之用。
2. DNA提取
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ 将玉米幼叶在研钵中加液氮磨成粉状后，取约0.1g放入1.5ml离心管中，立 即加入0.5ml提取缓冲液（60℃水浴预热），摇动混匀。 60℃水浴保温30~60min（时间长，DNA产量高），不时摇动。 加入0.5ml氯仿：异戊醇：乙醇（80：4：16）溶液，颠倒混匀，室温下静 置5~10 min，使水相和有机相分层。 室温下12000rpm离心5 min。 小心移取上清液至另一1.5ml离心管，加入等体积异丙醇，混匀，室温下放 置片刻即出现絮状DNA沉淀。 室温下12000rpm离心5 min，去除上清液，再加入100μl TE溶解沉淀。 加入1/10体积（约10μl）的3mol/L NaAc及二倍体积（约300μl）预冷的无 水乙醇，混匀，-20℃放置20 min左右。 室温下12000rpm离心5 min。 去上清，用1ml 70%乙醇漂洗沉淀二次，待沉淀干燥后，重新加入100μl TE溶解，-20℃贮存,备用。
基于干旱胁迫下杉木转录组序列的EST-SSR分子标记开发
１—５．
Ｔｈｅ ＥＳＴ—ＳＳＲ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ ｗｅｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｄａｔａ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｆ ｉｒ ｔｒａｎ．
ｓｃｒｉｐｔｓ ｕｎｄｅｒ ｄｒｏｕｇｈｔ ｓｔｒｅｓｓ．Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｕｎｄｅｒ ｄｒｏｕｇｈｔ ｓｔｒｅｓｓ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｏｌｅｘａ ｍＲＮＡ．Ｓｅｑ ｐｌａｔ ｆｏｒｍ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｔｈｅ ７５ ３５７ ｃｏｎｔｉｇｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｆｔｅｒ ｓｐｌｉｃｉｎｇ．ｔｈｅ ｔｏｔａｌ
关键词 杉木转 录组 ；ＥＳＴ—ＳＳＲ标记 ；毛 细ｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＥＳＴ－ＳＳＲ Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍ ａｒ ｋｅｒ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｕｎｄｅｒ
棉花优异品质及抗性基因挖掘与分子育种
棉花优异品质及抗性基因挖掘与分子育种商海红;袁有禄;于霁雯;石玉真;巩万奎;李俊文;吴曼;葛群;龚举武;范森淼【摘要】棉花品质、产量、抗性等均是多基因控制的数量性状,其表现型受基因型和环境的共同影响,且纤维品质和产量性状之间存在较大的负相关,采用常规育种手段实现棉花纤维品质与产量的同步改良具难度很大,针对棉花品质、产量、抗性等性状形成的遗传基础这一关键科学问题,棉花品种分子设计研究团队以陆陆种内分离群体、陆海种间分离群体等材料,交叉利用分子数量遗传学、功能基因组学和分子育种学等研究手段,在陆地棉优质品质及抗性基因挖掘、海岛棉优质品质及抗性基因挖掘以及分子标记辅助方法开发及棉花新品种培育等方面取得了一系列研究成果.为棉花品质、产量、抗性性状形成的同步改良奠定了重要基础.%The fiber quality,yield and resistance of cotton were all the quantitative traits which were controlled by multi-genes and affected by the genotype and environment.As the fiber quality traits and yield traits showed negative correlation,improving the fiber quality and yield of cotton is difficult synchronously.Aiming at the key scientific problem that the hereditary basis of fiber quality,yield and resistance,the team of molecular design of cotton varieties used the population which were constructed by two Gossypium hirsutum of intraspecific and population constructed by one G.hirsutum and one G.barbadense of interspecific,combined the subject of molecular quantitative genetics,functional genomics and molecular breeding the genes related to high fiber quality and resistance inG.hirsutum,and G.barbadense were discovered,the method of molecular mark assisted breeding was developed and the new cotton varieties werecultivated.These results could provide new data and materials to solve the problem of the large scientific problem that the hereditary basis of fiber quality,yield and resistance.【期刊名称】《棉花学报》【年(卷),期】2017(029)0z1【总页数】10页(P62-71)【关键词】棉花;纤维品质;抗性基因;种子品质;分子育种【作者】商海红;袁有禄;于霁雯;石玉真;巩万奎;李俊文;吴曼;葛群;龚举武;范森淼【作者单位】棉花生物学国家重点实验室/中国农业科学院棉花研究所,河南安阳455000;棉花生物学国家重点实验室/中国农业科学院棉花研究所,河南安阳455000;棉花生物学国家重点实验室/中国农业科学院棉花研究所,河南安阳455000;棉花生物学国家重点实验室/中国农业科学院棉花研究所,河南安阳455000;棉花生物学国家重点实验室/中国农业科学院棉花研究所,河南安阳455000;棉花生物学国家重点实验室/中国农业科学院棉花研究所,河南安阳455000;棉花生物学国家重点实验室/中国农业科学院棉花研究所,河南安阳455000;棉花生物学国家重点实验室/中国农业科学院棉花研究所,河南安阳455000;棉花生物学国家重点实验室/中国农业科学院棉花研究所,河南安阳455000;棉花生物学国家重点实验室/中国农业科学院棉花研究所,河南安阳455000【正文语种】中文【中图分类】S562.03棉花品质、产量、抗性等性状均是由多基因控制的数量性状，其表现型受基因型和环境的共同影响，且纤维品质和产量性状之间存在较大的负相关，采用常规育种手段实现棉花纤维品质与产量的同步改良难度很大。
SSR分子标记的开发策略概述
1.3 基于锚定PCR技术的省略筛库法
1996年，Fisher[17]等人为了提高有用SSR序列的得率，提出了利用5′锚定PCR开发SSR的技术.其原理是利用5′至少含2个SSR的重复单位的锚定SSR引物对基因组DNA进行扩增.该方法有以下优点：①PCR扩增产物至少含有两个SSR的重复单位，并且SSR座位的以扩增许多单基因座SSR标记.
【正文语种】中 文
【中图分类】Q78
SSRs(simple sequence repeats)即简单重复序列[1]，又称微卫星DNA(Microsatellite DNA)[2]、短串联重复(Short Tandem Repeat，STR)[3]或简单重复序列长度多态性(Simple sequence length polymorphisms，SSLPs)是以少数几个(一般为1～6 bp)核苷酸为重复单位的首尾串联重复DNA序列，如(CA)n，(TG)n，(GGC)n等，其中n代表重复次数，重复次数从几个到几十个不等.SSR在原核和真核生物基因组中均有分布[4]，大约每隔10～50 kb就存在一个SSR，尤其广泛分布于真核生物基因组中的非编码区、3′、5′非翻译区及内含子中，也有少量分布于外显子、启动子或基因组的它位置中.每个特定位点的SSR均由微卫星核心序列和两端的侧翼区两部分组成.核心序列的重复次数在同一物种的不同基因型间是随机的，具有高度变异性，因而SSR具多态性.两端的侧翼区是相对保守的单拷贝序列，因此可以设计一段互补序列的寡聚核苷酸引物，进行PCR扩增，扩增产物通过电泳分析其长度多态性.
(3)含SSR片段的选择性杂交筛选：在第(1)或第(2)中获得的PCR扩增片段在变性解链后，与生物素标记的SSR探针进行杂交，杂交混合液与亲和素蛋白混合，与SSR探针杂交的片段由于生物素与亲和蛋白的亲和反应而增.扩增产物连接该研究物种中获取重复序列两侧的序列信息，并设计引物，而后才能被利用，所以，SSR标记技术应用瓶颈是引物的开发.本文系统地总结了微卫星引物开发策略及其进展.1 从基因组开发SSR引物1.1 传统方法
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事棉花种植资源利用与创新研究ꎮ Ｅ － ｍａｉｌ:ｌｉｕｄｏｎｇｍｅｉ７８＠ １２６. ｃｏｍꎮ 通信作者:裴冬丽ꎬ博 士ꎬ教 授ꎬ 主 要 从 事 植 物 与 微 生 物 互 作 研 究ꎮ
基于棉花转录组测序的 狄１ ꎬ 喻 拥１ ꎬ 裴冬丽１
(１. 商丘师范学院生物与食品学院 / 植物与微生物互作省级重点实验室ꎬ河南商丘 ４７６０００ꎻ ２. 商丘工学院土木工程学院ꎬ河南商丘 ４７６０００)
摘要:通过对棉花转录组进行测序获得的 ５７ ６９５ 条 Ｕｎｉｇｅｎｅｓꎬ 利 用 ＭＩＳＡ 软 件 进 行 搜 索ꎬ 得 出 简 单 重 复 序 列 ( ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔꎬ简称 ＳＳＲ) 的分布情况ꎬ共挖掘检索得到 １ ８８６ 个 ＳＳＲ 位点ꎬＳＳＲ 的出现频率为 ３. ２７％ ꎮ 所有 ＳＳＲ 位点分布于 １ ７５９ 条 Ｕｎｉｇｅｎｅｓ 上ꎬ发生频率为 ３. ０５％ ꎬ平均每 ２０. ８ ｋｂ 会出现 １ 个 ＳＳＲ 位点ꎮ 有 １１７ 条 Ｕｎｉｇｅｎｅｓ 含有 １ 个以上 ＳＳＲ 位点ꎬ含有复合型 ＳＳＲ 的 Ｕｎｉｇｅｎｅｓ 数目为 ５６ 条ꎬ其中三核苷酸基元类型分布最多ꎬＳＳＲ 数量为 １ ５８２ 个ꎬ占挖掘出总 ＳＳＲ 数量的 ８３. ８８％ ꎬ而单、二、四、五、六核苷酸重复类型所占的比例较小ꎮ 最后通过 Ｐｒｉｍｅｒ ３ 程 序进行 ＳＳＲ 引物设计ꎬ得到部分引物序列ꎬ可用于棉花遗传多样性分析、分子标记辅助育种以及种质资源的保存等ꎮ 关键词:棉花ꎻ转录组测序ꎻＳＳＲꎻ分子标记ꎻ引物设计 中图分类号: Ｓ５６２. ０２４ 文献标志码: Ａ 文章编号:１００２ － １３０２(２０１９)０７ － ００３２ － ０３
１ 材料与方法
１. １ 棉花转录组数据来源 ２０１４ 年 ８ 月ꎬ以陆地棉洞 Ａ 不育和可育花药为材料ꎬ委
托深圳华大基因科技有限公司进行转录组测序ꎬ获得的全基 因序列共包含 ５７ ６９５ 条 Ｕｎｉｇｅｎｅｓꎬ以此为材料进行 ＳＳＲ 位点 的挖掘ꎮ １. ２ 棉花转录组 ＳＳＲ 位点检索
利用 ＳＳＲ 位 点 挖 掘 软 件 ＭＩＳＡ 对 陆 地 棉 洞 Ａ 花 药 的 ５７ ６９５ 条 Ｕｎｉｇｅｎｅｓ 进行 ＳＳＲ 位点挖掘ꎬ共挖掘出 ６ 种不同类 别的 ＳＳＲꎬ分别是单、二、三、四、五、六核苷酸 ＳＳＲꎮ １. ３ ＳＳＲ 引物挖掘
微卫星 ＤＮＡꎬ即简单重复序列( ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔꎬ简 称 ＳＳＲ) ꎬ通常构成其重复基元的核苷酸个数为 １ ~ ６ 个ꎬ特点 是长度长达几十个核苷酸ꎬ为串联重复序列ꎮ 单一序列的保 守性较强ꎬ在基因组中ꎬ微卫星侧翼序列就有此特性ꎮ 因此首 先通过克隆相应的微卫星侧翼 ＤＮＡ 片段ꎬ对其数目进行扩 增ꎬ然后对扩增 ＤＮＡ 进行全部测序ꎬ再对微卫星的侧翼序列 引物进行人工合成ꎬ最终实现通过 ＰＣＲ 扩增微卫星的目的ꎮ 自分子领域发展以来ꎬ人们最常用的分子标记技术主要有随 机扩增多态性 ＤＮＡ( ＲＡＰＤ) 、扩增片段长度多态性( ＡＦＬＰ) 、 序列标签位点( ＳＴＳ) 、限制性片段长度多态性( ＲＦＬＰ) 、单核 苷酸多态性( ＳＮＰ) 、ＳＳＲ 等[１ ꎮ － ６] 与其他分子标记相比ꎬＳＳＲ 标记具有其独特的优点ꎬ(１) ＳＳＲ 标记的操作非常简便ꎬ无需 消耗大量试验器材即可进行ꎬ整个过程消耗的时间较其他几 种分子标记短ꎬ且对于多态性而言ꎬＳＳＲ 标记所发掘出的多态 性较高ꎻ(２) ＳＳＲ 标记所开发的位点具有多等位基因的特性ꎬ 且在分子水平上ꎬ其提供的信息量较高ꎻ(３) ＳＳＲ 标记识别出 的基因位点呈共显性ꎬ在整个基因组有着均匀分布ꎬ且整个过 程无放射、辐射危险ꎮ ＳＳＲ 标记适用于 ＤＮＡ 指纹图 谱的 构 建[７] 、基因定位[８] 和遗传多样性分析[９] 等方面ꎮ 高度变异是 微卫星中重复基元的显著特性ꎬ微卫星数目可呈现出整倍性 变异ꎬ并且重复基元序列中的序列有可能不完全相同ꎬ因而造 成多个位点的多态性ꎮ
— ３２ —
江苏农业科学 ２０１９ 年第 ４７ 卷第 ７ 期
刘冬梅ꎬ娄喜艳ꎬ吴 狄ꎬ等. 基于棉花转录组测序的 ＳＳＲ 分子标记的开发[ Ｊ] . 江苏农业科学ꎬ２０１９ꎬ４７(７) :３２ － ３５. ｄｏｉ:１０. １５８８９ / ｊ. ｉｓｓｎ. １００２ － １３０２. ２０１９. ０７. ００８
利用 ＭＩＳＡ 软件进行 ＳＳＲ 位点 挖掘 之前 首先 将单、 二、 三、四、 五、 六 核 苷 酸 重 复 次 数 的 操 作 参 数 分 别 设 置 为 ≥１２ ｂｐ、≥６ ｂｐ、≥５ ｂｐ、≥５ ｂｐ、≥４ ｂｐ、≥４ ｂｐꎻ其次对长度 条件参数进行设置ꎬ当 ２ 个微卫星可以组合为 １ 个复合微卫 星时ꎬ这 ２ 个微卫星之间的距离必须小于 １００ ｂｐꎮ １. ４ 引物设计 通过 Ｐｒｉｍｅｒ ３ 程序进行 ＳＳＲ 引物设计ꎮ
Ｅ － ｍａｉｌ:ｐｅｉｄｏｎｇｌｉ＠ １２６. ｃｏｍꎮ
全转录组 ＳＳＲ 位点进行挖掘ꎬ利用生物信息学技能和 ＭＩＳＡ 软件ꎬ发掘基于陆地棉洞 Ａ 基因型的 ＳＳＲ 分子标记数据ꎬ在 ＲＮＡ 水平上分析棉花 ＳＳＲ 的特点及规律ꎬ以期为在分子水平 上研究棉花种质资源、鉴定亲缘关系及进行分子辅助育种奠 定基础ꎮ
目前关于棉花全基因组 ＳＳＲ 分子标记开发的研究报道 较少ꎬ随着棉花品种数量的逐渐增多ꎬ田间表型农艺性状鉴定 方法已难以满足快速并准确鉴定品种、质量、亲缘关系等的需 求ꎮ 本研究以陆地棉洞 Ａ 转录组的测序结果为试验材料ꎬ对
收稿日期:２０１８ － ０５ － ３１ 基金项目:国家自然科学基金( 编号:３１５７１９９７ ) ꎻ河南省高等学校重