小鼠肝脏过氧化氢酶的制备及测定
过氧化氢酶(CAT)测定
实验器材：紫外分光光度计、冷冻离心机、水浴锅、天平、100微升枪2支、10ml容量瓶、10 mL试管、具塞试管、5 mL枪一支、研钵试剂：（1）0.05mo l·L-1磷酸缓冲液（PH7.0）。
pH 0.05mol/L NaH2PO4(ml) 0.05mol/L Na2HPO4(ml)5.7 93.56.55.8 92.0 8.05.9 90.0 10.06.0 87.7 12.36.1 85.0 15.06.2 81.5 18.56.3 77.5 22.56.4 73.5 26.56.5 68.5 31.56.6 62.5 37.56.7 56.5 43.56.8 51.0 49.06.9 45.0 55.07.0 39.0 61.07.1 33.0 67.07.2 28.0 72.07.3 23.0 67.07.4 19.0 81.07.5 16.0 84.07.6 13.0 87.07.7 10.5 89.57.8 8.5 91.57.9 7.0 93.08.0 5.3 94.7（2）200 mmo l·L-1H2O2溶液，30% H2O2 45.44 mL溶于磷酸缓冲液，定容至1 L。
（3）50 mmo l·L-1Tris-HCl缓冲液（PH7.0）(Tris三羟甲基氨基甲烷；氨基丁三醇；缓血酸胺，C4H11NO3):250ml 0.2mol/L的Tris（含三羟甲基氨基甲烷24.23g/L）+450mL 0.1mol/L的HCl(取83ml浓度为37.2%的盐酸定容至1L)，加水稀释至1L。
步骤：1、酶液提取：取0.5g新鲜植物样品，置于预冷研钵中，加2mL磷酸缓冲液及少量石英砂，在冰浴上研磨匀浆。
2、将研磨好的匀浆转移至10mL容量瓶中，用磷酸缓冲液冲洗研钵2-3次（每次1-2mL）,转移至容量瓶，定容至10 mL。
3、取提取液5 mL于离心管中，在4℃、15000g下离心15min，上清液即为酶提取液，4℃下保存备用。
过氧参考资料化氢酶(CAT)活性测定
过氧化氢酶(CAT)活性测定高锰酸钾滴定法(李合生．植物生理生化实验原理和技术[M]．北京：高等教育出版社．2000．165-167)一、原理过氧化氢酶(catalase，CAT)普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，它属于血红蛋白酶，含有铁，能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
22R(Fe OH3+－) R(Fe2+2 2)2+2 H O2＋O2因此，可以根据H2O2的消耗量或者O2的生成量测定该酶活力的大小。
在该体系中加入一定量(反应过量)的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。
5H2O2+2KMnO4+4H2SO45O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4二、材料、仪器设备及试剂(一)材料植物器官(花瓣、叶片等)(二)仪器设备冰箱、离心机、微量加样器(1ml、20μl、100μl)、移液管、精密电子天平、试管、研钵、剪刀、镊子、三角瓶、恒温水浴、容量瓶、酸式滴定管(三)试剂(1)10% H2SO4(2)0.2mol/L PH7.8磷酸缓冲液(3)0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4(AR)3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000mL，再用0.1mol/L草酸溶液标定(4) 0.1mol/L H2O2：取30% H2O2(大约等于17.6 mol/L)5.68mL，稀释至1000mL，用0.1mol/L高锰酸钾标准液(在酸性条件下)进行标定(5) 0.1mol/L草酸：称取优级纯，用蒸馏水溶解后，定溶1000mL。
三、试验步骤(一)酶液提取取植物材料2.5g，加入PH7.8的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至25mL容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定溶，4000r/min离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
实验四 比较过氧化氢酶和Fe3+的催化效率
Sy-4 比较过氧化氢酶和Fe3+的催化效率Ⅰ实验程序酶：是活细胞产生的一类具有生物催化作用的有机物。
酶的作用具有高效性。
一、实验原理新鲜的肝脏中含有过氧化氢酶，Fe3+是一种无机催化剂。
它们都可以催化H2O2分解成H2O + O2。
分别用一定数量的过氧化氢酶和Fe3+催化过氧化氢分解成水和氧，可以比较两者的催化效率。
经计算，用质量分数为3.5%FeCl3溶液和质量分数为20%的肝脏研磨液做实验,每滴FeCl3溶液中的Fe3+,大约是每滴肝脏研磨液中过氧化氢酶分子数的25万倍。
说明酶的高效性。
二、目的要求1.初步学会探索酶的催化效率的方法。
2.探索过氧化氢酶和Fe3+催化效率的高低。
三、重点与难点1.重点：初步学会探索酶的催化效率的方法。
探索过氧化氢酶和Fe3+催化效率的高低。
2.难点：学习掌握探索实验的方法，培养学生独立实验的能力和创新思维能力。
三、材料用具新鲜的质量分数为20%的肝脏(如猪肝、鸡肝)研磨液。
量筒，试管，滴管，试管架，卫生香，火柴。
体积分数为3%的过氧化氢溶液，质量分数为3.5%的氯化铁溶液。
四、实验步骤（录象观察）1.取两支洁净的试管放H2O2（20×200mm大试管）。
2.制取20%的肝脏研磨液。
3.对比催化效率。
说明:①本实验通过观察哪一个试管先有较大、较多气泡逸出。
判断催化效率高低，不是收集整个过程的总气量，因为Fe3+的后期也会大量冒泡。
②过氧化氢有一定的腐蚀作用，勿溅到皮肤上，不小心滴上要用清水冲洗。
③也可用马铃薯块茎代替肝脏，取5g去皮的马铃薯，加3mL水研磨成桨，用双层纱布过滤成滤液，即可使用。
Ⅱ 注意事项(1)合理设计对照实验。
催化剂可以加快反应速度，而本身的质和量不发生变化，而反应速度可以通过测定反应物的消耗速度或者生成物的产生速度来测定。
要比较酶和无机催化剂的效率，选择的反应应具备以下特点：①反应可由两种催化剂(一种是酶，一种是无机催化剂)催化；②生成物易于鉴别；③反应物廉价，反应过程简单、安全等。
过氧化氢酶产生菌的研究
过氧化氢酶产生菌的研究摘要：过氧化氢酶一类以过氧化氢为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气的酶。
关键字：过氧化氢酶发酵调控过氧化氢酶简介过氧化氢酶(Hydrogen peroxide oxidoreductase，catalase EC 1.11.1.6.) 是一类以过氧化氢为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气的酶。
研究表明几乎所有的需氧微生物中都存在过氧化氢酶，只有少数好氧菌如过氧化醋杆菌Acetobacter peroxydas 不存在过氧化氢酶。
除谢氏丙酸杆菌Propionibacterium shermanji 和巨大脱硫弧菌Desulfovibrio gigas 等微生物外，绝大多数厌氧微生物体内不存在过氧化氢酶。
根据过氧化氢酶在结构和序列水平上的异同将其划分为 3 个亚群，即单功能过氧化氢酶(Monofunctional catalase or Typicalcatalase)、双功能过氧化氢酶(Catalase-peroxidase) 和假过氧化氢酶(Pseudocatalase or Mn-catalasee)。
大多数的过氧化氢酶由4 个相同的亚单位组成，分子量在240 kDa 左右，在亚基的活性部位各含一个血红素基团。
来自哺乳动物以及某些真菌和细菌的过氧化氢酶还含有 4 个紧密结合的NADPH 分子。
过氧化氢酶可被氰化合物、苯酚类、叠氮化物、过氧化氢、尿素及碱等物质所阻抑。
过氧化氢酶主要集中存在于细胞的过氧化物酶体中，另外线粒体和细胞质中也含有少量的过氧化氢酶。
过氧化氢酶能及时分解细胞内产生(主要为SOD 歧化产物) 或由胞外进入细胞的过氧化氢。
避免了过氧化氢通过Fenton 和Harber-weiss 反应产生·OH。
同时过氧化氢酶还能对血红蛋白及其他含巯基蛋白质起到保护作用，使它们不被氧化。
人们研究过氧化氢酶的历史可追溯到100 多年前，早在1811 年就已发现动植物组织可以分解过氧化氢产生氧气，到1892 年Jacobson 证明了在动植物组织内有专一分解过氧化氢的酶，即过氧化氢酶的存在。
生物化学过氧化氢酶Km值测定
用不同的H2O2的起始量代表同一体 系不同时刻的底物浓度。 根据不同的底物浓度和对应的反 应速度绘制标准曲线。 从坐标图上读出-1/Km，计算Km值。
三、试剂
1、0.02mol/L 磷酸盐缓冲液（ pH7.0 ）。
2、0.02mol/LKMnO4：称取 KMnO4 3.2 g，加蒸馏水 1000 mL，煮沸15 min，2d后过滤，棕色瓶保存
Km值的含义
a)Km值是酶的特征性常数之一 b)Km值可近似表示酶对底物的亲和力 b)同一酶对于不同底物有不同的Km值 测定Km是研究酶的一种重要方法，大多 数酶的Km值在0.01∽100mmol/L之间。
Km值的测定方法
双倒数作图法
Vmax[S] V = Km+[S]
两边同取倒数
1/V=
Km Vmax
5、25% H2SO4
四、实验步骤 1、酶液的制备：
每组(共分6组)称取马铃薯5g， 加磷酸缓冲液 10mL，研钵匀浆， 滤纸过滤。
2、反应速度的测定：取干燥的50-100ml锥形瓶 6只，编号后按下表操作：
试剂（mL） 0
H2O2溶液/mL 0 蒸馏水/mL 9.5
1
2
3
4
5
1.00 1.25 1.67 2.50 5.00 8.50 8.25 7.83 7.00 4.50
〔S〕＝H2O2摩尔浓度×加入H2O2的mL数 10
＝加入H2O2的摩尔数 10
＝ （mmol/mL）
反应速度的计算
V = 加入的H2O2的毫摩尔数－ 剩余的H2O2的毫摩尔数/5min
= H2O2的摩尔浓度×加入H2O2 毫升数－0.004×2.5×消耗KMnO4 的ml数/5min 注意硫酸和高锰酸钾使用安全！
过氧化氢酶活力测定CAT
过氧化氢酶活力测定碘量法目的意义过氧化氢酶(Catalase，CAT)普遍存在于植物所有组织中，其活性与植物的代谢强度、抗衰老、抗寒、抗病能力有一定关系，在生产实践中常进行测定。
学习几种测定CAT活性的方法，理解其测定原理。
一、实验原理过氧化氢酶能把过氧化氢分解为水和氧，其活性大小，可以一定时间内分解的过氧化氢量或生成氧气的量来表示。
H202的测定常采用氧化还原滴定法，碘量法是其经典方法。
其原理是在有催化剂钼酸铵存在时，过氧化氢与碘化钾反应，放出游离碘，再用硫代硫酸钠滴定碘，以淀粉指示剂指示滴定终点。
根据空白和测定二者滴定值之差，即可算出酶分解的过氧化氢量。
其反应为：H2O2十2KI十H2S04→I2十K2S04十2H20I2+2Na2S2O3→2NaI+NaS406二、材料、设备与试剂1．植物材料小麦或其他植物新鲜叶片。
2．主要设备天平、研钵、100ml容量瓶、50ml酸滴定管、移液管(1、5、10ml)、100ml 三角瓶。
3．试剂(1)碳酸钙粉末(2)1.8mol/L的硫酸取1000ml烧杯1只，加入约500ml蒸馏水，边搅拌边加入100ml 浓硫酸，冷却后用量瓶定容到1000ml。
(3)10％的钼酸铵溶液：称取钼酸10g，溶于蒸馏水中使成100ml。
(4)1％淀粉溶液：取1g可溶性淀粉于小烧杯中加约20ml水调匀，慢慢倾入约80m1沸水中，在搅拌下加热至重新沸腾冷却后贮于滴瓶中(可加少量HgCl2防腐)。
(5)0.05mol/L硫代硫酸钠称取Na2S2O3·5H2O 25g，溶于新沸腾并冷却过的蒸馏水中，加入约0.1gNa2CO3，，并稀释至1升，保存于棕色试剂瓶中，放置暗处。
一天后进行标定。
标定方法：精确称取分析纯K2Cr207约0．15g于500ml三角瓶中，加30ml蒸馏水溶解，加入2gKI和5ml 6mol/L盐酸，在暗处放置5min，然后用水稀释至200ml，用0.05mol/L 硫代硫酸钠溶液滴定，当溶液由棕红色变为浅黄色时，加入1ml淀粉溶液，继续滴至溶液由蓝色变为亮绿色(Cr3+离子的颜色)为止。
高中生物实验知识：过氧化氢酶活性的测定
高中生物实验知识：过氧化氢酶活性的测定过氧化氢酶广泛存在于植物的所有组织中，能将过氧化氢分解为氧和水，可使生物机体免受过氧化氢的毒害作用。
测定过氧化氢酶的方法有测压法、滴定法以及分光光度法等。
用氧电极法测量放氧速度，方法灵敏而快速。
放氧速度与过氧化氢酶活性成正比。
仪器药品氧电极仪记录仪电磁搅拌器超级恒温水浴注射器、微量注射器容量瓶反应杯亚硫酸钠过氧化氢酶50mmol/L磷酸缓冲液，pH7.0(见附表2)。
50mmol/L过氧化氢溶液：取1.4ml30%H2O2用磷酸缓冲液定容至250ml即得。
标准过氧化氢酶溶液：称取过氧化氢酶(Sigma)1.0mg(110U/mg)，溶于50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)11ml中，使酶浓度为10U/ml。
操作步骤1.仪器的标定按实验88步骤进行仪器的标定，以求得记录纸上每小格相当的含氧量。
2.绘制酶活性标准曲线(1)在反应杯中放满过氧化氢磷酸缓冲液，开启电磁搅拌器搅动10分钟，插入电极，吸去溢出在电极外面的溶液，调节移位旋钮，使记录笔位于满刻度的10─20%左右，使记录纸走动，1─2分钟后温度达到平衡，记录笔画出直线。
(2)用微量注射器从电极塞小孔中注入10μ110U/ml过氧化氢酶，立即记录最初90秒钟内的氧释放曲线。
(3)根据上述同样步骤，注入不同浓度的过氧化氢酶10μl(例如浓度为20、30、40、50U/ml等)，记录氧释放曲线。
(4)取放氧曲线的直线部分，根据其斜率及走纸速度，计算每分钟氧的释放量。
(5)以过氧化氢酶活性单位为横坐标，每分钟氧的释放量为纵坐标，绘制标准曲线。
3.样品测定(1)在反应怀内注入50mmol/L过氧化氢磷酸缓冲液搅动10分钟，插上电极，待记录为一直线后，注入10μl合适浓度的待测酶液样品，立即记下最初90秒钟内的放氧曲线。
(2)根据样品的放氧曲线，计算得到每分钟的放氧量，在标准曲线上查得酶活性大小。
(3)如果没有标准的过氧化氢酶，不能计算酶活性单位时，也可以用每分钟的放氧量相对地表示酶的活性大小。
过氧化氢酶活性测定
实验29 过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。
一、原理过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。
即可求出消耗的H2O2的量。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：小麦叶片（二）仪器设备：1. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水浴； 5. 容量瓶。
（三）试剂：1. 10%H2SO4；2. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液；3.0.1mol/L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液标定；4. 0.1mol/L H2O2市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液 5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；5. 0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。
三、实验步骤（一）酶液提取：取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
（二）取50ml三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮死酶液 2.5ml，再加入 2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO42.5ml。
实验9-过氧化氢酶活性测定幻灯片
5 实验结果
酶活性：每g鲜重样品1min内分解H2O2的mg数表 过 示 氧化H 氢 2O 2m 酶 g/活 ） g (.m 性 A W B i V n V （ )S T t1.7
式中：A－对照KMnO4滴定mL数； B－酶反应后KMnO4滴定mL数； VT－提取酶液总量（mL）； VS－反应时所用酶液量（mL）； W－样品鲜重（g）； T－反应时间（min）； 1.7－1mL0.1mol/L KMnO4相当于1.7mgH2O2。
2 材料:小麦叶片 3 主要设备：离心机，恒温箱，酸 式滴定管
四 方法步骤
1、 酶液提取
2 、滴定：取50mL三角瓶3个（2个测定，另 1个为对照），测定瓶中加入酶液2.5mL， 对照加煮死酶液2.5mL，再加入0.1mol/L H2O2 2.5mL ，同时计时，于30℃恒温水 浴中保温10min，立即加入 10%H2SO42.5mL。
0.1mol/L KMnO4标准液：称取KMnO4〔AR〕3.1605g， 用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000mL，再用0.1mol/L 草酸 溶液标定；
0.1mol/L H2O2：取30%H2O2 〔17.6mol/L〕溶液 5.68mL，稀释至1000mL，用标准0.02mol/L KMnO4溶 液〔在酸性条件下〕标定。
实验9-过氧化氢酶活性测 定幻灯片
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一 实验目的
1 掌握和学习测定过氧化氢酶活性的原理 和方法；
2 了解过氧化氢酶的作用。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 实验原理
过氧化氢酶活性测定
过氧化氢酶活性测定过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。
紫外吸收法一、原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。
根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【仪器与设备与试剂】1、材料小麦叶片等。
2、仪器设备研钵；离心机；250ml容量瓶；移液管（0.5ml、2ml各2支）；10ml试管3支；恒温水浴；紫外分光光度计；3、试剂0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。
【方法】1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。
混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm 下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。
5℃下保存备用。
2.酶活性测定取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表2-14-1顺序加入试剂。
表2-14-1 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表将S0号管在沸水浴煮1min以杀死酶液，冷却。
然后将所有试管在25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色皿中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。
3.结果计算：以每分钟A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（U）。
过氧化氢酶活性U/(g.min)=Wt V V A S T⨯⨯⨯⨯∆1.0240∆A 240= A S0－2)(21S S A A +式中 A S0—加入煮死酶液的对照管吸光值； A S1, A S2—样品管吸光值； Vt —粗酶提取液总体积（ml ）； V 1—测定用粗酶液体积（ml ）； FW —样品鲜重（g ）；0.1—A 240每下降0.1为1个酶活单位（u ）； t —加过氧化氢到最后一次读数时间（min ）。
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实验：小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定1：《小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定》实验背景资料过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2对细胞的危害。
人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。
小鼠肝脏过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。
溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。
本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。
2、3. 实验目的熟悉并掌握生化四大技术—离心、层析、比色、电泳。
熟悉并掌握分离纯化小鼠过氧化氢酶和测定其含量的技术和方法。
4. 实验原理匀浆原理：分离纯化某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性，所以要根据所提取蛋白质的性质采用适当的方法将组织和细胞破碎。
过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中溶解度很小，而脂质在有机溶剂中溶解度较大,通过加入有机溶剂可实现过氧化氢酶与脂质的分离。
过氧化氢酶在乙醇、氯仿等有机溶剂中稳定性好，不易变性，而某些杂蛋白在有机溶剂中稳定性差，容易变性。
根据上述原理选择0.05mol/L，pH4.0醋酸-乙醇缓冲液以及氯仿作为匀浆缓冲液，通过匀浆法破碎肝组织细胞，匀浆液离心后脂质分配到有机相中，部分杂蛋白则沉淀下来，而过氧化氢酶主要存在于上清液中，分离出上清液即获得过氧化氢酶的粗提液。
盐析原理：蛋白质在高浓度盐溶液中由于水化膜被破坏而溶解度降低。
通过向过氧化氢酶粗提液中加入适当浓度的中性盐,使过氧化氢酶呈盐析状态,而部分杂蛋白呈盐溶状态, 离心后过氧化氢酶主要存在于沉淀中，弃去上清收集沉淀，即可实现过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离。
透析原理：采用20%乙醇、0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液、0.1mol/L NaCl溶液为透析液，对产物进行透析处理。
在该透析条件下，过氧化氢酶溶解度变小，以沉淀形式析出，但不变性。
透析过夜后离心，过氧化氢酶主要存在于沉淀中，但沉淀中也可能含有少量变性的杂蛋白。
选择0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液复溶沉淀，则过氧化氢酶溶解，而变性的杂蛋白不能溶解，从而实现过氧化氢酶与部分杂蛋白的分离。
层析原理：凝胶层析法主要根据混合物中分子大小不同的各种物质，随流动相流经作为固定相的凝胶层析柱时，各种物质分子扩散移动速度不同使混合物中各种物质得到分离的技术。
采用sephadexG-200葡聚糖凝胶层析柱可以实现过氧化氢酶与其他分子量杂蛋白的分离，通过监测洗脱液在407nm（过氧化氢酶特征性吸收波长）和280nm波长下的光吸收值变化，合并收集OD407nm和OD280 nm重叠峰值管，即可获得纯化后的过氧化氢酶。
5. 结果比活（IU/mg）=酶活力/蛋白浓度总酶活力105=酶活力×溶液体积匀浆酶活力（IU/ml）=（H2O2的浓度×加入H2O2的ml数-2.5×KMnO4ml数×KMnO4浓度/加入样品的ml数）×105层析酶活力（IU/ml）=（H2O2的浓度×加入H2O2的ml数-2.5×KMnO4ml数×KMnO4浓度/加入样品的ml数）×3×105回收率%=用各步产物的酶活力占匀浆离心上清液酶活力的百分比来表示IU定义：在规定条件下，每分钟催化1umol的【S】转变为【P】的酶量，为1IU。
层析后蛋白吸光值变化曲线SDS-PAGE 图譜（一）组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液【实验器材】1、动物：成年小鼠2、器材：手套、镊子，剪刀，肾盘，冰袋，电子天平，托盘天平，组织捣碎机，10mL 匀浆管，冰浴盒，吸量管，滴管，10ml 、50mL 量筒，100mL 烧杯，50mL 锥形瓶，玻璃棒，离心管，离心机，制冰机，4℃冰箱，纱布，滤纸3、试剂：0.05mol/L 醋酸-乙醇（23.5％）缓冲液，pH4.0；氯仿 【实验原理】：1）在肝内过氧化氢被过氧化氢酶水解为水和氧 2）组织匀浆法: 机械切碎，破碎细胞匀浆缓冲液:pH4.0醋酸缓冲液（水溶性物质），23.5%乙醇（脂溶性物质） 3）氯仿; Pr 沉淀剂，CA T 由于对氯仿的沉淀性大而不沉淀 4）离心：离心机 离心力 分离固液 【实验步骤】1、 颈椎脱臼法处死小鼠（6只），取肝脏（按6g 计算，不称重）；2、 加入肝重8.5倍体积（51ml ）的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L, pH4.0醋酸缓冲液,23.5％乙醇，），用组织捣碎机匀浆1-3min （三组合并一块匀浆，快慢交替使用）。
【留样】不离心，取200ul 匀浆液留样，放-20o C 保存。
3、 冰浴下缓慢滴加肝重0.5倍体积（3ml ）的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆30s-1min ；匀浆液离心，4℃，层析匀浆透析盐析M a r k e r7500rpm，30min后，弃沉淀，收获上清液约44ml于100ml锥形瓶中。
4、取匀浆后上清液120uL，加入40 uL 4×电泳上样Buffer，沸水浴3-5分钟，备用于SDS-PAGE检测，-20℃冰箱保存。
【留样】另取200 uL匀浆后上清液-20℃冰箱保存，用于酶活的测定和蛋白定量。
（二）盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶【实验器材】1、100mL锥形瓶，冰浴盒，制冰机，JT-1型定时电磁搅拌器，离心管，托盘天平，离心机，透析袋（截留量10KD-20KD，直径2公分），滴管，50mL量筒，5mL吸量管2、试剂：0.5mol/LNa2SO4；0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液；透析液（20%乙醇，0.1mol/LpH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L NaCl），50%甘油。
【实验原理】：1）在Pr溶液中加入中性盐使Pr沉淀析出过程2）盐酸沉淀原理：中性盐破除水化膜、中和表面电荷，Pr溶解度降低而沉淀析出3）透析:利用具有一定孔径的高分子物质不能透过的半透膜，分离生物大分子和小分子的一种分离纯化技术【实验步骤】1、冰浴搅拌状态下，向肝匀浆上清液中缓慢滴加0.06倍体积的0.5M Na2SO4溶液，继续冰浴搅拌1h（用玻璃棒手动搅拌）；2、将盐析溶液离心（40C，7500rpm，10min）后弃去上清，保留沉淀；3、用肝重4倍体积（24ml）的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀（用手动玻璃匀浆器助溶）15min ，离心（40C 5000rpm , 10min）后，弃去沉淀，保留上清液；4、【留样】取盐析后上清样品120ul，用40 uL 4×电泳上样Buffer制样，煮3-5min，备用于SDS-PAGE 检测，-20℃冰箱保存。
5、将透析袋（截留量10-20KD，直径2公分）置于沸水中煮5min，清洗晾凉后备用6、将上清液放入透析袋（截留量10-20KD，直径2公分）内（注意封口要结实），置于透析液（20%乙醇，0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L NaCl溶液，上清液的10倍体积）中透析两周，中途更换一次透析液（7、两周后，取出透析袋内混浊溶液，离心（40C，7500rpm，10min）后，弃去上清，收集沉淀；8、用2mL~3mL的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀15min（用手动玻璃匀浆器助溶），离心（40C，4000rpm，10min）后，弃去沉淀，收获上清液。
9、【留样】取上清样品120ul，用40 uL 4×电泳上样Buffer制样，沸水浴3-5分钟，备用于SDS-PAGE 检测。
放置-20℃冰箱保存。
10、将透析袋（截留量10-20KD，直径2公分）置于沸水中煮5min，清洗晾凉后备用；11、将收获的样品液（三组样品合并为一组）放入处理后的透析袋中，置于75%的甘油中包埋浓缩2小时，待样品浓缩至1~1.2ml收样，放置-20℃冰箱保存。
（三）凝胶层析法进一步纯化纯化过氧化氢酶【实验器材】1、玻璃层析柱（直径1.8cm长45cm）、细乳胶管、夹子、玻璃棉或棉花、细玻璃棒、收集管（试管）、试管架、紫外\可见分光光度计（型号-9100）、锥形瓶、吸量管、滴管。
2、试剂：sephadexG-200，0.1mol/L pH7.8磷酸盐缓冲液【实验原理】根据混合物中各种物质分子大小不同，在凝胶层柱的扩散移动速度不同使混合物分离的方法。
【实验步骤】1、凝胶的处理：每组取2.5g sephadexG-200葡聚糖凝胶干粉（膨胀体积30~40mL/每克干胶），浸泡于蒸馏水中充分溶胀，倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，替换等体积磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH7.8) 继续浸泡一天2、装柱：取层析柱一支，将层析柱出口接上乳胶管，在柱底部填入一薄层玻璃棉或海绵垫，越薄越好。
将层析柱垂直夹于铁架上，层析柱下端的止水夹夹紧，向柱中加入约5-7cm 高的缓冲液，用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液，顺玻璃棒缓缓倒入层析柱中。
当凝胶颗粒沉积约2cm高时，开启止水夹子，使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，掌握倒入速度，使其与缓冲液流出速度大体相同，直至凝胶床高度达35cm（柱床体积约60ml）时为止。
关闭止水夹子，要求凝胶床要均匀，中间要连续，不得有气泡或断纹，表面要平整。
如凝胶床表面不平整，可用细玻璃棒轻轻将凝胶床上部颗粒搅起，待其自然下沉，即可使表面平整。
凝胶床表面要保留10cm高的缓冲液。
3、平衡：打开层析柱出口，控制流速为0.3~0.5mL/min (约5-10滴/min，不要超速)，用磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH7.8)流洗平衡20min。
凝胶管柱上端平衡液应始终不少于10cm高度，不得出现干胶和断层，并应保持凝胶面平整。
4、浓缩样品5、加样：打开层析柱出口，使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床表面平齐时，关上出口。
用吸管吸取待分离的浓缩后样品溶液1-1.2ml，在接近凝胶床表面处沿层析柱内壁缓缓加入。
打开层析柱出口，使样品溶液进入柱床（开始收集）。
待样品液恰好完全进入凝胶柱上端面内时，立即用滴管沿层析柱内壁加入少量磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH7.8)小心冲洗壁管上的蛋白质，然后再加入磷酸盐缓冲液至距凝胶床表面约4cm高。
6、洗脱：洗脱过程中不断补加磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH7.8)，保持0.3~0.5mL/min的流速。