毛细管电泳化学发光检测研究新进展

http://www.paper.edu.cn - 1 -毛细管电泳化学发光检测研究新进展1 吉邢虎，徐秦峰，何治柯* 武汉大学化学与分子科学学院，武汉 (430072) E-mail：zhkhe@whu.edu.cn 摘 要：分析技术的微型化、集成化和自动化是当前分析化学发展的一个新趋势。本文综述了毛细管电泳化学发光检测系统微型化、集成化和自动化的最新研究进展。 关键词：毛细管电泳，化学发光检测，微型化，集成化，自动化 中图分类号：O657.8

1．引言 自1990年Manz等[1,2]提出“微全分析系统”（Micro total analysis system, µ- TAS）概念以来，分析技术的微型化、集成化和自动化成为分析化学发展的一个新趋势。分析仪器微型化、集成化带来的分析性能的全面提升为当前科研工作者所瞩目。但µ-TAS的技术平台－微流控分析芯片的制作加工程序复杂，操作技术难度大，设备成本高，实现普通研究工作室的全面普及还有很长的距离。如何实现已成熟的分析方法的微型化、集成化，以提高其分析性能，达到全面普及的要求，也成为当前科研工作的一个研究热点。 毛细管电泳（Capillary Electrophoresis, CE）与化学发光（Chemiluminescence，CL）的结合（CE-CL），兼备了毛细管电泳分离效率高和化学发光灵敏度高的优点，直接用于复杂样品中微量组分的分离与测定，可同时解决选择性差和灵敏度低的问题，给化学发光研究和毛细管电泳技术提供了发展机会[3-5]。1991年Hara等[6]首次将化学发光检测应用于毛细管电

泳分析。经过十多年的发展，CE-CL不断突破联用接口技术难关[4]，技术优势不断突现，发展速度相当快。不同特性的化学发光体系，包括鲁米诺[7-13]、过氧草酸酯[6,14-17]、吖啶酯[18-20]、钌配合物[21-29]、高锰酸钾[30-32]等已在CE-CL中获得成功使用，用于测定金属离子、蛋白质、氨基酸及其衍生物、H2O2或多环芳烃等物质。在此基础上，毛细管电泳化学发光检测系统的微型化、集成化和自动化也取得了一定进展。

2．微型化 Tsukagoshi等[33]将柱端液池式CE-CL检测装置微型化（图1A），以模拟芯片毛细管电

泳化学发光检测系统（Microchip-based CE-CL, MCE-CL）[34]（图1B）。50 µm内径的毛细管用聚乙烯管连接形成类似于微流控芯片的十字交叉进样通道。交叉点到R4的毛细管长30 mm，其余毛细管长度为10 mm，尺寸基本与微芯片相当。以四个硅胶管做为储液池，金属离子样品溶液放入R1，鲁米诺电泳缓冲溶液分别放入R2和R3，氧化剂H2O2放入R4，光

电倍增管（PM）置于R4的底部用于化学发光检测。在R1和R2间施加电压使样品进入交叉区域，进样结束后在R3和R4间施加电压实现电泳分离。为防止样品的泄漏，进样和分离时采用了芯片毛细管电泳的夹流进样方式[35]。在上述实验操作条件下，完成了Co(II)，

Cu(II)，Ni(II)三种金属离子的分析检测，对Co(II)的检测范围为1×10-7~1×10-6 mol/L。与芯片毛细管电泳的检测结果相比，浓度检测限可低1~2个数量级，可能原因在于该装置下的进样量比芯片的进样量多；但微芯片的质量检测限却可达到0.4 fmol。该装置可以完全模拟芯片毛细管电泳化学发光检测的全过程，而且容易操作，可更改性很强。作者认为该仪器装

1 本课题得到教育部博士点基金（20050486026）的资助。 http://www.paper.edu.cn - 2 -置同样符合µ-TAS的概念。

Hashimoto等将光纤引入液池式[36]和流通式[37]毛细管电泳化学发光检测系统，以简化仪

器结构。实验中采用聚四氟乙烯材料制作化学发光检测池（图2 A和B），既充当检测池的作用，又作为柱后电泳液的储液池。毛细管末端1~2 mm的聚酰亚胺涂层被烧去后，与接地电极和光导纤维分别固定于检测池上相应位置，结构如图2所示。其中（A）检测池含有两根光纤，与毛细管成直角方向放置；（B）检测池中只有一根光纤，正对毛细管的出口放置。两检测池中接地电极均置于距中心8 mm远的位置。以鲁米诺-H2O2-K3Fe(CN)6化学发光反

应体系为模型，考察了两检测池的检测效果。结果表明，（B）检测池对鲁米诺的灵敏度比（A）检测池高出近100倍。原因在于，（A）检测池中电泳分离出来的鲁米诺阻力较小，迅速穿过两光纤的间隙，试剂混合效率低，反应不完全；（B）检测池中电泳分离的鲁米诺直接碰撞光纤的横截面，混合效果好，反应完全，灵敏度高。在（B）检测池的模式下，有微过氧化物酶参与的化学发光反应体系中，鲁米诺的检测限可达1.7×10-9 mol/L。该检测池

用于异鲁米诺异硫氰酸酯（ILITC）标记的甘氨酸及其形成的小肽，均可达到基线分离检测。而且该检测池易于与毛细管电泳装置结合，实验操作过程也不繁琐，有望成为CE的一种实际的化学发光检测系统。在流通式化学发光检测器中（图2 C），1 mm直径的光导纤维正对聚四氟乙烯化学发光反应管内分离毛细管出口放置，间距0.5 mm。接地电极从光导纤维所在三通接入构成电泳电场回路，H2O2由注射泵经分离毛细管侧三通泵入化学发光反应区

图2 采用光纤的液池式(A，B) [36]和流通式(C)[37]CE-CL检测器

图1 微型化CE-CL(A)[33]与MCE-CL(B)[34]比较 http://www.paper.edu.cn - 3 -域。在优化的实验条件下，该流通式化学发光检测池对鲁米诺的检测限达到7.6×10-9 mol/L，

理论塔板数高达130000~160000，为文献报道中分离效率的最好结果。 Tsukagoshi等[38]报道了一种高度集成化的毛细管电泳化学发光检测装置（图3）。整个

装置都由聚四氟乙烯材料做成，体积60 mm×40 mm×30 mm，仅有手掌尺寸大小，可与微全分析系统相媲美。集成装置包括样品池、电泳缓冲溶液池和化学发光检测池三个储液池，两根电泳电极以及一根用于发光检测的光导纤维。分离通道可采用10 cm长的石英毛细管或者聚四氟乙烯管，避免了微流控分析芯片通道可能堵塞等不必要麻烦，而且毛细管可任意修饰、随时更换。该装置不仅可用于ILITC的分离分析，而且利用ILITC标记的人血清白蛋白（HSA）和分析物HAS同试样池内固定了HSA抗体的玻璃微珠之间的竞争性免疫反应，通过测定ILITC-HSA的信号，可实现HSA的在线免疫分析测定。

通常，毛细管电泳化学发光检测采用柱端模式。最近，Zhang等[39]报道了毛细管电泳在

柱（on-capillary）化学发光检测模式，工作原理如图4所示。在距毛细管入口端50 cm的地方去除约4 cm长聚酰亚胺涂层，形成透明的检测窗口，固定窗口两端以防毛细管折断。采用脉冲激光器在50.5 cm处的毛细管壁打出直径为30 µm的小孔，用于化学发光试剂进入分离毛细管，与电泳分离组分在毛细管内发生反应，产生化学发光信号，即实现了零死体积的毛细管电泳在柱化学发光检测。实验中，以pH 10.8磷酸盐溶液作为电泳缓冲液，在进样端加入Cu(II)离子作为催化剂，在小孔处加入H2O2。鲁米诺与氨基丁基乙基异鲁米诺（ABEI）

进样电泳分离后，与经小孔进入毛细管的氧化剂H2O2反应，在小孔下游1~1.2 cm处产生最

图3 集成化CE-CL检测装置示意图[38]

图4 毛细管电泳在柱化学发光检测原理示意图[39] http://www.paper.edu.cn

- 4 -强化学发光信号。该方法对鲁米诺和ABEI的检测限分别为1×10-11 mol/L和2×10-10 mol/L，

理论塔板数在25000~40000之间。可能由于样品与化学发光试剂的高效混合使得检测灵敏度很高，但另一方面却损失了分离效率。同液池式和流通式的柱端化学发光检测相比，在柱化学发光检测模式仪器结构更简单紧凑，有利于仪器的微型化、集成化和自动化，是一种有待进一步开发研究的检测模式。 电致化学发光检测器的集成化程度通常都比较高[40-42]，检测器制作的重现性直接影响

该方法的实际应用。为提高电致化学发光检测器的制作重现性，Wang研究组基于当前成熟的微流控芯片加工技术，提出了两种通用型的微型电致化学发光检测器的制作方法[43,44]。一

种方法[43]是采用化学湿法刻蚀技术在20 mm×15 mm×1.7 mm玻璃表面刻蚀出试剂通道和工作电极、参比电极以及毛细管相应的连接槽，经键合将盖板和基板玻璃连成一体形成反应和检测池主体。试剂由PVC吸头制作的储液池分别从盖板玻璃上2 mm的小孔加入或输出，工作电极和毛细管经不锈钢导管接入池体，以银导线作为准参比电极。根据实验要求，连接相应的试剂导管或毛细管，可实现流动注射或毛细管电泳电致化学发光检测。由于试剂通道仅0.6 mm，即使Ru(bipy)3

2+连续流动，消耗量也只有~100 µL / h，可大大节约试剂消耗。该

装置用于三丙胺和脯氨酸的分离检测，检测限分别1.4×10-9 mol/L和1.6×10-7 mol/L，电致

化学发光信号的相对标准偏差介于1.7~2.5%。该方法制得的检测池，体积小，集成度高，灵敏度和重现性好，但涉及微芯片的刻蚀、键合等微加工技术，操作步骤繁琐，加工难度大，不利于批量生产。他们报道的另一种方法[44]采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）高分子聚合物一

次成型制得检测器，有望实现检测器的批量生产，有助于仪器的商品化。仪器制作时，在定位好毛细管和电极位置的模具内放入PDMS单体，聚合后固化成型即可得检测池主体。在相应位置插上毛细管和电极即可进行实验。该方法制作加工步骤简单；采用PDMS材料，成本低；一次成型，可进行批量生产。5个不同池体间，三丙胺和脯氨酸的迁移时间RSD分别为0.49%和1.13%，峰面积RSD分别为9.6%和11.4%。虽然峰面积的重现性不甚理想，但该结果开创不同检测池间比较报道的先例。

3．集成化 毛细管电泳的检测方法主要包括紫外-可见、激光诱导荧光、电化学、质谱、核磁共振等方法。由于各种检测方法的原理不同，这些方法通常只能单独使用，单次分析仅可得到有限的分析信息。随着分析要求的不断提高，单方面的分析信息已无法满足实际需求，综合信息的捕获必然要求同时使用各种分析检测手段。最近，文献中出现不少关于毛细管电泳双检测器联用技术的报道[45-48]，CE-CL与其他检测手段的联用技术也得到一定发展。

Tsukagoshi研究组在CE-CL方法的建立及分析应用领域成果显著。在多年CE-CL研究工作的基础上，Tsukagoshi等[49]提出了毛细管电泳化学发光/紫外-可见双检测系统