葡萄糖脱氢酶融合表达载体的构建
【浙江省自然科学基金】_表达载体构建_期刊发文热词逐年推荐_20140813
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2008年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
毕赤酵母 根特异启动子 核苷二磷酸激酶 枯草芽孢杆cd40 抗体生成 慢病毒载体 慢病毒感染 慢病毒属 序列分析 干扰素ⅱ型 密码子 增殖 基因表达 基因融合 基因 嘌呤核苷磷酸化酶 口蹄疫病毒 受体,表皮生长因子 反义cdna 原核载体 单链抗体 化疗敏感性 兔出血症病毒感染性cdna 免疫,细胞 克隆 人乳头瘤病毒6 人 亚细胞定位 乳腺肿瘤 乙型肝炎 sharp-2 rantes pdc316质粒 pcdna3.1(+) orf5 jab1/csn5蛋白 iptg诱导 il-18 gpi融合蛋白 cop9信号复合体 cd40配体 cd13 bmawd基因 bhk-21细胞 agap adrml accb accase
推荐指数 4 3 3 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
乙醇脱氢酶Ⅰ基因敲除的酿酒酵母重组菌构建的初步研究
参考文献：
Ｍ为分子量标准（ＤＬ ２０００，天为时代）；泳道ｌ和２均为扩增的样品
分子量为１０２３ｂｐ。
图４
以ＨｙＢｌ和Ｈ［ｙＢ２为引物扩增转化酵母基因组结果
筛选抗性菌落。结果显示（图３），有部分菌株可以在含 有潮霉素的平板上生长，表明其体内含有潮霉素抗性，
而在空白对照平板上（未涂有１００ ｐ ｇ，ｍｌ潮霉素）没有菌落 生成。
利用酵母基因组提取试剂盒，提取转化后酵母及野 生酵母的基因组ＤＮＡ，以ＨｙＢｌ和ＨｙＢ２引物进行ＰＣＲ 扩增。结果发现（图４），在酵母基因组上，扩增出本实 验所需要的片段１０２６ｂｐ，说明外源基因已经整合到酵母 基因组上。 ２．５ 发酵实验
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)做为传统的乙醇生产菌株，具有乙醇耐受性强，发酵工艺成熟，工业应用范围广泛，与其它微生物比较生物 安全性好等特点。同时，酿酒酵母是第一个基因组完成测序的真核生物，遗传背景非常清楚，由于其体内具有高效的同源重组机制，在分子和基因水平
进行操作非常容易。在实际工业生产中，为了降低发酵工艺成本、实现高效的转化率和产出率，菌种的优劣在整个生产流程中尤为重要。因此，菌种的 选育必须以降低生产耗资与高产出为原则。近年来，依据代谢工程理念，应用分子生物学手段对酿酒酵母进行分子育种是主要的研究方向，其中，尤为 突出的是重组DNA技术。应用代谢工程理念使用基因工程手段对菌种改造过程中，敲除或过表达特定基因可以阐明该基因功能，改变代谢途径，从而提高 目标产物产量。同时，该突变株为进一步探索目的基因的转录调控机制、基因与蛋白质相互作用以及分子信号传导通路等提供了理想材料，并为进一步 从基因和分子水平改进酿酒酵母乙醇代谢途径，构建优良性状高产乙醇生产菌奠定了基础。本研究利用酿酒酵母细胞内的同源重组机制，运用基因敲除 和过表达技术，降低了由乙醛生成乙酸的分解代谢流，并在此基础上增强了己糖代谢率。与原始出发菌株相比，不仅提高了乙醇产量，而且缩短了发酵 周期，提高了发酵产率。研究内容如下：
植物表达载体构建
植物基因工程常用的报告基因
指其编码产物能够被快速地测定、常用 来判断外源基因是否已经成功地导入寄 主细胞（器官或组织）并检测其表达活 性的一类特殊用途的基因。
作为报告基因的条件
在转化的寄主细胞中应不存在相应的内 源等位基因的活性，
其表达产物不仅不会损害寄主细胞，而 且还应具有快速、灵敏、定量和可重复 的检测特性。
检测方法
用于GUS基因检测的常用底物有三种： X-Gluc 5-溴-4-氯-3-I吲哚-B-D-葡萄糖苷酸酯 X-MUG 4-甲基伞形酮酰-B-D-葡萄糖苷酸酯 PNPG 对硝基苯B-D-葡萄糖醛酸苷 组织化学染色定位法 荧光法测定GUS活性 分光光度法测定GUS活性
组织化学染色定位法
该方法是将底物进入被测的植物组织。 将被检材料浸泡在含有底物的缓冲叶中保温，
cells).
Left, Down regulation of CaMV35S promoter in the syncytium of Heterodera schachtii monitored by expression of GFP (top). By comparison an unifected root shows regular GFP expression (bottom). Right, Image analysis of the mean red component of
植物表达载体构建
张玉刚 zyg4458@
载体 vector
克隆载体
载
体
原核表达载体
表达载体 真核表达载体
植物表达载体
质粒图谱及质粒构建
启动子 外源基因 终止子 启动子 报告基因 终止子
目的片段
（标记基因） 选择标记
目的基因在宿主细胞中的表达
T7噬菌体启动子表达载体系统：
T7噬菌体RNA 聚合酶活性很高，合成mRNA的的速率相当于大肠杆菌RNA 聚合酶的5倍。
外源目的基因在原核细胞的表达形式
包涵体：是外源基因的高表达蛋白在原核细胞中积累，并致密地聚集在 一起形成的一种水不溶性蛋白质结构。易于分离纯化。具有正确的氨基 酸序列，但因其空间构象错误，故一般无生物学活性。 融合蛋白：将外源目的基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改 变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白称为融合蛋白。具有稳定 性好、表达效率高、较易于分离纯化的优点。
考虑外源目的基因的组成。主密码子和罕用密码 子。
常见的原核细胞表达载体系统 Plac 启动子表达载体系统：以大肠杆菌乳糖操纵
子调控机制为基础设计和构建的表达系统。
PL 和PR启动子表达载体系统：
PL 和PR启动子 是大肠杆菌λ 噬菌体中控制早期转录的启动子， PL 和PR 表达载体系统是该启动子构建的高效表达载体。
表达载体和受体菌
• GS115： Mut+ ， His• KM71： Muts， His• SMD1168： Mut+， His-，蛋白酶缺陷型 • pPIC3.5K：5’ AOX1，MCS，TT，3’ AOX1，His4，
Kanr， ampr，
• pPIC9K：
5’ AOX1，MCS，TT，3’ AOX1，His4，ampr， Kanr，Sig， 5’ AOX1-MCS-TT的两端为BglⅡ和BamHⅠ
在原核细胞中高效表达目的基因 高效表达目的基因的基本策略 优化表达载体的构建 提高稀有密码子的表达频率 构建基因高表达受体菌 提高外源基因表达产物的稳定性 优化工程菌的发酵过程
• 优化表达载体的构建
羰基还原酶的纯化与基因表达简述
羰基还原酶的纯化与基因表达简述摘要：羰基还原酶具有高度的化学、区域和立体选择性，是一种极具潜力的催化不对称还原反应的生物催化剂。
能以NAD(P)H为辅酶，催化羰基化合物还原成羟基化合物，是手性化合物拆分过程中重要的酶类。
随着对手性化合物光学纯度要求的提高，羰基还原酶的催化效果、纯酶的获得和工程菌的构建越来越受到关注。
羰基还原酶的可以通过筛选天然菌株、天然羰基还原酶的纯化和工程菌的构建等方式获得。
在构建工程菌方面，最常用的宿主菌有大肠杆菌和毕赤酵母等，各具优缺点。
随着分子生物学技术的高速发展和成熟，越来越多的研究者选择用重组表达的方法来获得羰基还原酶。
Abstract：Carbonyl reductases are as a group of promising biocatalysts with high chemo-, regio-, and stereo-selectivity. They are NAD(P)H-dependent enzymes and can catalyze the reduction of carbonyl compounds. So carbonyl reductases as a group of oxidoreductase are very important during the biocatalysis. As for the optical purity of chiral requirements increase, the catalytic effect of carbonyl reductase, the obtainment of pure enzyme and construction of engineering bacteria are draw more and more attention. In building engineering bacteria , the most common host strains are E. coli and Pichia pastoris , etc., and each of them with advantages and disadvantages.With the rapid development of molecular biology techniques and mature, more and more researchers choose to use the method to obtain recombinant carbonyl reductase.关键词：羰基还原酶；纯化；基因表达Key Word: carbonyl reductase; purification; gene cloning1概述羰基还原酶（Carbonyl reductase, EC 1.1.1.184）属于醛酮还原酶家族，能以NADH 或NADPH 为辅因子，催化还原羰基化合物生成光学纯的羟基化合物。
实验题06实验设计思路及预期结果类(原卷版)
实验题06 实验设计思路及预期结果类考点01 细胞代谢1．（2023·全国甲卷·29T）某同学将从菠菜叶中分离到的叶绿体悬浮于缓冲液中，给该叶绿体悬浮液照光后糖产生。
回答下列问题。
(1)叶片是分离制备叶绿体的常用材料，若要将叶肉细胞中的叶绿体与线粒体等其他细胞器分离，可以采用的方法是_____（答出1种即可）。
叶绿体中光合色素分布_____上，其中类胡萝卜素主要吸收_____（填“蓝紫光”“红光”或“绿光”）。
(2)将叶绿体的内膜和外膜破坏后，加入缓冲液形成悬浮液，发现黑暗条件下悬浮液中不能产生糖，原因是_____。
(3)叶片进行光合作用时，叶绿体中会产生淀粉。
请设计实验证明叶绿体中有淀粉存在，简要写出实验思路和预期结果。
_____考点02 植物生命调节2．（2023·海南卷·16T）海南是我国火龙果的主要种植区之一、由于火龙果是长日照植物，冬季日照时间不足导致其不能正常开花，在生产实践中需要夜间补光，使火龙果提前开花，提早上市。
某团队研究了同一光照强度下，不同补光光源和补光时间对火龙果成花的影响，结果如图。
回答下列问题。
(1)光合作用时，火龙果植株能同时吸收红光和蓝光的光合色素是_____；用纸层析法分离叶绿体色素获得的4条色素带中，以滤液细线为基准，按照自下而上的次序，该光合色素的色素带位于第_____条。
(2)本次实验结果表明，三种补光光源中最佳的是_____，该光源的最佳补光时间是_____小时/天，判断该光源是最佳补光光源的依据是_____。
(3)现有可促进火龙果增产的三种不同光照强度的白色光源，设计实验方案探究成花诱导完成后提高火龙果产量的最适光照强度（简要写出实验思路）。
_____考点03 发酵工程3.（2023·北京卷·16T）自然界中不同微生物之间存在着复杂的相互作用。
有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出。
PAP蛋白重组表达载体的构建及在原核和真核细胞中的表达
ＰＡＰ的内化，提高其抗病毒效果。
由于编码ＰＴＤ的１０个氨基酸的核苷酸序列仅为３０ｂｐ，本实验采用在引物中直接引入该编码序列的方法实现ＰＴＤ与ＰＡＰ的基因重组。
同时引入在两个引物（Ｐ１和ＩＣ。
２）中分别构建原核大肠杆菌表达中所需的ＢａｍＨＩ和ＰｓｔＩ酶切位点。
具体步骤详见图１。
ＰＴＤ－ｐｒｉｍｅ吖ＣＧ曼昼盘里￡９＿岫ＨＤＡＴＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＧＴＧＡＡＴＣＣＡＡＴｅＡＴＣＴＡＣＡＡＴＧ）ＰＴｎＰＡＰ图１．ＰＴＤ－ＰＡＰ的合成模式图通过ＰＣＲ扩增，用ＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ加Ａ后电泳得到了约８００ｂｐ的扩增片段。
回收后的片段与ｐＰＧＥＭ－ＴＶｅｃｔｏｒ连接。
转入大肠杆菌ＤＨ５Ｑ中，经蓝白筛选，选取白色菌落行ＰＣＲ鉴定见可扩增出约８００ｂｐ的片段；提取ＰＣＲ阳性菌株的质粒，经ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ双酶切，电泳示可约８００ｂｐ和３Ｋｂ处两条条带（见图２）。
株的质粒，经ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ双酶切，电泳示可约１Ｋｂ和３Ｋｂ处两条条带（图４）。
图４ｐＰＧＥＭ—ＴＶｅｃｔｏｒ／ＴＡＴ－ＰＡＰ重组体酶切图示：１．分子量标准为ＢＬ２０００：２．酶切片段。
图中可见酶切下略大于１Ｋｂ片段，相当于Ｔａｔ加上ＰＡＰ序列的大小，支持二者重组成功。
将酶切鉴定阳性菌株质粒测序示ｒＩ钒序列和ＰＡＰ序列正确连入ｐＰＧＥＭ．ＴＶｅｃｔｏｒ中。
１．３．２Ｔａｔ与ＰＡＰ的基因重组体中Ｔａｔ显性负突变体的构建前期的工作共获得的ＨＩＶ的Ｔａｔ显性负突变体共六个：ｐＭｌ：Ｃｙｓ２２＋Ｇｌｙ；ｐＭ２：Ｈｉｓ３３／Ｃｙｓ３４一Ａｌａ／Ｓｅｒ；ｐＭ３：Ｔｈｒ４０／Ｌｙｓ４１一Ａｌ矶～ｌａ；ｐＭ４：Ｌｙｓ５０一ＳＴＯＰ；ｐＭ５：Ａｒ９５２一Ｌｅｕ；ｐＭ６：Ｔｈｒ４０／Ｌｙｓ４１／Ｃｙｓ５０一Ａｌａ／Ａｌａ／ＳＴＯＰ。
之后验证了突变Ｔａｔ对ＨＩＶ－１Ｔａｔ活性的影响：结果说明不同Ｔａｔ突变蛋白都对正常Ｔａｔ有一定程度的抑制作用，其中以ｐＭ５最大，达８５％，另外ｐＭ３可达４０％。
麻疯树JcFAD7基因启动子克隆及植物表达载体构建
麻疯树JcFAD7基因启动子克隆及植物表达载体构建曾玲;吴平治;魏倩;姜华武;吴国江;李美茹【摘要】利用TAIL-PCR技术成功克隆了麻疯树JcFAD7基因起始密码子的上游1 926 bp序列.利用生物信息学手段对其序列特征和潜在的调控元件进行分析表明,该序列含有4个TATA-box和6个CAAT-box.还包含光响应元件、MYB结合位点、不同的激素反应元件以及各种胁迫响应元件,说明JcFAD7的表达可能受多种因素的调控.将启动子连接到pB1101.1载体,成功构建了驱动报告基因GUS的植物表达载体.为阐明麻疯树不饱和脂肪酸的合成代谢过程和植物生长发育的调控机理奠定了基础.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2010(037)009【总页数】4页(P177-180)【关键词】麻疯树;ω-3脂肪酸脱氢酶;三烯脂肪酸;启动子【作者】曾玲;吴平治;魏倩;姜华武;吴国江;李美茹【作者单位】中国科学院华南植物园植物资源保护与可持续利用重点实验室,广东,广州,510650;中国科学院研究生院,北京,100049;中国科学院华南植物园植物资源保护与可持续利用重点实验室,广东,广州,510650;中国科学院研究生院,北京,100049;中国科学院华南植物园植物资源保护与可持续利用重点实验室,广东,广州,510650;中国科学院研究生院,北京,100049;中国科学院华南植物园植物资源保护与可持续利用重点实验室,广东,广州,510650;中国科学院华南植物园植物资源保护与可持续利用重点实验室,广东,广州,510650;中国科学院华南植物园植物资源保护与可持续利用重点实验室,广东,广州,510650【正文语种】中文【中图分类】Q785高等植物的叶绿体膜具有含量非常高的三烯脂肪酸（tienoic fatty acids，TAs），如亚麻酸（C18:3）和十六碳三烯脂肪酸（C16:3）。
这些三烯脂肪酸和双烯脂肪酸占据了植物叶片和根部脂类总脂肪酸的70%以上。
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草杆 菌 来 源 的 该基 因序 列相 同 ， 粗提 酶 液 比活 力 高达 ３ ５ ｍｇ 结 论 运 用 分 子 生 物 学技 术 获 得 葡 萄 糖 脱 氢 酶 且 ７ Ｕ／ 。 基 因， 功 构 建 了葡 萄 糖 脱 氢 酶 的 融 合 表 达 栽 体 ， 酶 的后 续 纯化 工作 提 供 了条 件 。 成 为 【 关键 词】 葡糖 脱 氢酶 ； 基 因表 达 ； 枯 草 杆 茵 ； 聚 合 酶链 反 应 Ｄ ：０３ ６ ／．ｓ ．６ ２９ ５ ．０ １０ ．０ 文 献 标 志 码 ： ０Ｉｌ ． ９ ９ｊｉ ｎ １ ７ －４ ５ ２ １ ． ２ ０ ３ ｓ Ａ 文章 编 号 ：６ ２９ ５ （０ １０ －１ ３０ １ ７—４ ５ ２ ｌ ） ２０ ３—２
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【 要 】 目 的 为 方 便 葡 萄 糖 脱 氢 酶 的 纯 化 ， 建 葡 萄 糖 脱 氢 酶 融 合 表 达 栽 体 。 方 法 通 过 聚 合 酶 链 反 应 摘 构 （ Ｃ ） 枯 草 杆 菌 基 因 组 中扩 增 葡 萄 糖 脱 氢 酶 基 因， 源 序 列 比 较 分 析 后 连 接 到 融 合 表 达 载 体 ｐ Ｔ ２ ， 入 Ｐ Ｒ从 与 Ｅ ２ｂ 导 Ｊ １ ９ 导 表 达 ， 定 葡 萄糖 脱 氢 酶 酶 液 比 活 力 。 结 果 构 建 的 葡 萄 糖 脱 氢酶 融合 表 达 栽 体 中 目的基 因序 列 与 枯 Ｍ Ｏ诱 测
Ｌｉ ＺＨＯＵ Ｌｉ ｎ Ｃ ｌｅ ｅｏ ｄｉａ ｃｅ ｃ ｎ ｂ ｒ ｔｒ ｄ ｃｎ Ｊｉｎ ｓ ｉｅ ｓｔ Ｚ ｅ ｊａ ｇ， ｉ ｎ ｓ ｕ， － ｇ（ ｏ ｌｇ ｆ Ｍｅ ｃ ｌＳ ｉｎ ｅａ ｄ Ｌａ ｏ ａ ｏ ｙＭｅ ｉｉｅ， ａ ｇ ｕＵｎ ｖ ｒｉ ｐｉ ｙ， ｈ ｎ ｆ ｎ Ｊ ａ ｇ ｕ
检 验 医学 与 临床 ２ １ ０ １年 １月 第 ８卷 第 ２期
Ｌ ｂＭｅ ｉ，ａ ｕ ｒ ０ １Ｖｏ． ， ． ａ ｄＣｌ Ｊｎ ａｙ２ １ ， １８ Ｎｏ ２ ｎ
・
・
１３ ・ ３
论 著 ・
葡 萄 糖 脱 氢 酶 融合 表 达 载 体的 构 建
戴锦 程 ， 韩 菲 ， 王 岩 ， 戴 榴 ， 丽 萍（ 苏大 学基 础 医 学与 医学技 术 学院 ， 周 江 江苏镇 江 ． １ ０ ３ ２２ １ ）