原核表达讨论200910
原核表达困难解决
原核表达：遇到瓶颈怎么办我想表达遇到的第一个瓶颈估计就是为什么我的外源片段插到载体里面，PCR鉴定没问题，双酶切也OK，可是就是不见表达。
一般我们是如何判断没有表达呢？大多都是首先进行SDS-PAGE。
在跑胶的时候一定要设对照，比较严谨的电泳对照，应该是：Marker，标准品阳性对照（如果有，且打算做Western的话），以及空白载体（诱导）和重组载体（不诱导）2个阴性对照，再加上诱导不同时间的表达结果。
Marker用于判断条带大小，标准品用于判断Western体系包括抗体显色剂和操作的可靠性，以及精确判断大小；空白载体（诱导）负对照有助于判断在非诱导条件下的本底表达；而重组载体（不诱导）负对照则有助于判断诱导的效果以及排除诱导剂对宿主菌潜在的干扰，或者是区分细菌内源和外源表达产物——偷懒可不是好习惯，会影响结果判断。
注意，接种表达和接种做感受态都类似，一定要用挑单克隆、加足量抗生素、过夜培养的新鲜菌液转种最好，在筛选压力下生长旺盛的种子液远比经过4℃保存的菌液要好得多，也许是因为保存时间长会导致抗生素失效部分细菌丢失质粒或者其他变化。
反正就是一种经验做法。
跑SDS-PAGE的话可以用考马斯亮兰染，它灵敏度在100ng左右；但是不能跟着做Western了。
银染的灵敏度在0.1～1 ng；有钱还可以用Sypro Red，灵敏度高还可以继续做Western。
WesternBlot是蛋白质定性和半定量的最通用的技术，具体细节可参考生物通WesternBlot技术专题，我们有详细介绍的。
在做过Western Blot仍没有检测到表达带，那么就要开始进行下一步的分析了。
首先，看看载体的多克隆位点和片断插入的序列，是否有因为酶切连接而意外引入了转录终止信号。
有时载体几经多个实验人员的周转，反复插入片断，或者是粘端相同的不同酶切片断之间的连接，会意外在启动子后面带入终止位点，特别是用到XbaI之类的酶要小心。
大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验一般分为以下几个步骤：
1. 构建表达载体：将待表达的基因克隆到适当的表达载体上,如常用的pET、pGEX等载体中。
2. 转化大肠杆菌：将表达载体转化到大肠杆菌细胞中。
可以通过化学方法、电转化、冷冻复苏、热激转化等方法进行。
3. 诱导表达：在大肠杆菌细胞进行生长至适当时期后,添加适宜浓度的诱导剂,如IPTG等,诱导待表达基因蛋白的合成。
4. 细胞收获和破碎：诱导一定时间后,收获大肠杆菌细胞并进行破碎,以获得待表达蛋白。
5. 蛋白提取：对细胞破碎物进行离心、超滤等步骤,去除残余细胞构成和杂质,得到含有待表达蛋白的上清液。
6. 纯化和分析：将上清液进行分离、纯化、鉴定,以确定表达蛋白相应的分子量、酶活性等。
在以上步骤中,实验者需要进行质控和评估,确认实验步骤是否正确和表达蛋白是否达到预期,以确保实验结果的可靠性和准确性。
目的蛋白的原核表达
目的蛋白的原核表达
目的蛋白的原核表达是一种常见的蛋白质表达方式，它可以通过大量的原核细胞来生产大量的目的蛋白。
这种表达方式具有高效、简便、成本低等优点，因此被广泛应用于生物医学研究、工业生产等领域。
在目的蛋白的原核表达中，最常用的表达系统是大肠杆菌表达系统。
这种表达系统具有许多优点，如生长速度快、易于培养、表达效率高等。
此外，大肠杆菌表达系统还可以通过改变表达载体、调节培养条件等方式来优化表达效果。
在进行目的蛋白的原核表达时，需要选择合适的表达载体。
常用的表达载体有pET、pGEX、pMAL等。
这些表达载体都具有不同的特点，可以根据需要选择合适的表达载体。
例如，pET表达载体适用于表达具有标签的蛋白，pGEX表达载体适用于表达具有谷氨酸-S-转移酶标签的蛋白，pMAL表达载体适用于表达具有麦芽糖结合蛋白标签的蛋白。
在进行目的蛋白的原核表达时，还需要考虑到表达条件的优化。
例如，可以通过调节温度、添加诱导剂等方式来提高表达效率。
此外，还可以通过改变培养基成分、添加辅助蛋白等方式来优化表达效果。
目的蛋白的原核表达是一种高效、简便、成本低的蛋白质表达方式。
在进行目的蛋白的原核表达时，需要选择合适的表达载体、优化表
达条件，以提高表达效率和表达质量。
这种表达方式在生物医学研究、工业生产等领域具有广泛的应用前景。
【关于优化原核表达的一些总结】
我认为，进行原核表达条件优化主要应注意以下几方面：1．密码子最优化（codon of optimization）：大肠杆菌某些核糖体蛋白质中的使用频率不同，有最佳密码子（optimal codons）或偏爱密码子（preferred codons），稀有或利用率低的密码子（rare or low-usage codons）。
大肠杆菌稀有密码子主要有ATA，CTA，CCC，ACG，CGA，CGG，AGG，GGA，GGG等。
另外，大肠杆菌偏爱的终止密码子为UAA，而哺乳动物偏爱的终止密码子为UGA。
同时，终止密码子的下游碱基对翻译有效终止有影响，大肠杆菌中UAAN，N的影响力次序为：U>G>A，C；哺乳动物中UAGN，N的影响力次序为：A，G>>C，U。
我用的pET-43.1，先用宿主菌BL21（DE3），没有目的带出现，后改用RosettaBlueTM（DE3），目的蛋白表达效率达50%以上，并且是可溶的。
2．启动子是DNA链上RNA聚合酶的识别位点和结合位点，外源基因表达的理想启动子是可以指导高效转录，保证目的基因高效表达的启动子。
乳糖启动子是最常用的启动子，但容易引起外源基因的渗漏表达，对细胞的生长产生毒害作用；其他从乳糖启动子构建而来的启动子，多用IPTG诱导，IPTG对菌体也有毒害作用。
若IPTG对宿主菌有毒，可以同时加入IPTG和乳糖诱导表达，这样可减少IPTG的浓度。
若目的蛋白有毒，可用Invitrogen公司的pLEX系统等。
3．培养基的成分：用M9ZB和NZCYM培养基培养细菌，增加细菌质粒拷贝数；用LB培养基表达外源蛋白，提高蛋白表达量。
【毒性较大蛋白表达条件优化】：１）一般发酵时高温、高浓度诱导剂（ＩＰＴＧ）有利于表达表达包涵体形成，减少毒性。
２）加大氨苄的浓度（可达400mｇ／ｍｌ）并提高培养基中葡萄糖浓度（可达0.5％）有利于稳定表达，并要及时补充葡萄糖使其浓度维持在0.5％。
跨膜结构域多的蛋白原核表达-概述说明以及解释
跨膜结构域多的蛋白原核表达-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述：蛋白质是生物体内一种重要的大分子有机物，广泛参与了生命体的各种生物学功能。
蛋白质的功能主要取决于其结构，而跨膜结构域是其中一种重要的结构类型，在细胞膜上具有关键的生物学功能。
跨膜蛋白具有许多重要的生物学功能，包括传输物质、细胞信号传导以及细胞识别与黏附等。
因此，对跨膜蛋白的研究具有重要的意义。
本文将重点介绍跨膜结构域多的蛋白原核表达的相关内容，包括跨膜蛋白的结构特点、原核表达的意义以及原核表达技术的应用。
通过对这些内容的深入探讨，可以更好地理解蛋白质的生物学功能及其在生物体内的重要作用。
1.2 文章结构文章结构:本文共分为引言、正文和结论三个部分。
在引言部分中，将介绍文章的概述、结构和目的。
在正文部分，将分别讨论蛋白质的跨膜结构域、蛋白原核表达的意义以及蛋白原核表达技术。
最后在结论部分，总结本文的主要内容，并对未来的研究方向进行展望，最终得出结论。
整个文章结构清晰，逻辑性强，旨在全面探讨跨膜结构域多的蛋白原核表达的相关内容。
1.3 目的本文的主要目的是探讨跨膜结构域多的蛋白在原核表达中的重要性和应用。
我们将深入研究蛋白质的跨膜结构域特点，探讨蛋白在细胞膜中的重要功能和生物学意义。
同时，我们将介绍蛋白原核表达技术的原理和方法，探讨如何有效地表达跨膜结构域多的蛋白，并讨论其在生物学研究和应用领域中的潜在应用价值。
通过本文的研究，我们希望对跨膜结构域多的蛋白原核表达有一个全面深入的了解，为相关领域的研究和应用提供一定的参考和指导。
2.正文2.1 蛋白质的跨膜结构域蛋白质是生物体内最重要的分子之一，它们在细胞中扮演着多种重要的功能角色。
其中，跨膜蛋白质是一类质膜跨越生物膜的蛋白质，在细胞膜上起着特殊的功能。
跨膜蛋白质通常包含一个或多个跨膜结构域，这些跨膜结构域可以让蛋白质在细胞膜上穿过，从而实现其特定的功能。
跨膜结构域的结构多样性很大，可以分为α螺旋、β折叠等结构类型。
原核表达的注意事项
原核表达本贴非原创，特声明。
PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中到正确的读码。
②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。
在编码区中找到翻译起始密子与终止密码子（cDNA）。
2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS和partial CD 是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，parti CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。
是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。
做单抗也可以，同样道理，筛出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。
（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。
原核表达及检测
原核表达及检测摘要：本实验采用IPTG诱导GFP在大肠杆菌中的表达，表明随着时间的推移GFP的表达量越来越多。
随后用SDS-PAGE检测蛋白纯化情况关键词：原核表达SDS-PAGE凝胶电泳广义的原核表达，是指发生在原核生物内的基因表达。
狭义的原核表达，常出现于生物工程中。
是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。
一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株。
如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。
因为只有融合体蛋白才具有生物活性，所以还要进行融合体/包涵体检测。
选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。
绿色荧光蛋白( green fl uorescent protei n, GFP)是238个氨基酸组成的单体蛋白, 其分子量为27kDa 。
1974年由Morie等从海洋生物水母中分离出来[ 1], 并且Prasher等在1992年从水母Aequoreavictoria中成功克隆出了GFP的cDNA[ 2 ]。
GFP作为一种新的报告基因,与以往lacZ、CAT等报告基因相比, 有很多无可比拟的优越性: GFP不具有种属依赖性, 在多种原核和真核生物细胞中都表达;荧光强度高, 稳定性高; 不需要反应底物与其他辅助因子,受蓝光激发产生绿色荧光, 尤其适用于体内的即时检测; 另外GFP分子量小,易于融合, 适用于多种转化方式,对受体无毒害,安全可靠; 并且通过替换一些特殊氨基酸,可以使之产生不同颜色的光,从而适应不同的研究需要。
SDS-PAGE的原理：组成蛋白质的氨基酸在一定pH的溶液中会发生解离而带电，带电的性质和带电量的多少取决于蛋白质的性质及溶液的pH值和离子强度。
聚丙烯酰胺凝胶在催化剂过硫酸铵（简称Ap）和加速剂N,N,N’N’-四甲基乙二胺（简称TEMED）的作用下，聚合形成三维的网状结构。
原核表达系统
-原核表达系统一．表达系统：基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。
据受体细胞的不同可分为：1．原核表达载体系统：将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达合成基因产物的体系。
2．真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达。
二．原核生物基因结构和表达特点1．原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。
2．原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。
（图）多顺反子mRNA（polycistronic mRNA）：即可作为两个或多个肽链翻译模板的mRNA。
3．一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统。
4．原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。
操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。
1）原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。
共同协调作用，完成某一多肽的表达调控。
2）包括调控区：调节基因，启动基因，操作基因。
结构基因：5．原核生物中参与转录的基因结构：1）启动子：是DNA上的一段序列，是RNA聚合酶识别并结合部位。
各种不同的原核细胞其启动子各有不同，但均含有下列两个高度保守区（富含AT：易变性解离为单链，为RNA合成提供模板）（1）TATA box（-10区，pribnow box）：转录启始点上游10bp处一段富含AT的碱基TATATTA（2）-35区：长度和顺序个体间差别很大，富含AT是RNA聚合酶识别位点。
转录的启始：RNA聚合酶首先识别启动子的-35区并结合至启动子上，然后开始滑向转录起始点，到-10区时，RNA聚合酶与启动子结合更牢固，并继续向前滑行，大约6-7bp后开始转录（转录起始位点）。
即RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不转录（图）。
各种启动子启动转录能力不同。
启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列。
原核基因表达调控特点
原核基因表达调控特点原核生物是指没有真核细胞核的生物，包括细菌和古细菌。
原核生物的基因表达调控具有以下特点：1. 基因结构简单：原核生物的基因通常由一个连续的DNA片段组成，没有内含子和外显子的区别。
这种简单的基因结构使得原核生物的基因表达调控更为直接和高效。
2. 没有转录因子：转录因子是对基因表达起调控作用的蛋白质，通过结合到DNA上的特定序列来激活或抑制转录过程。
然而，在原核生物中，没有类似的转录因子存在。
原核生物的基因表达调控主要通过DNA序列上的启动子和终止子来实现。
3. 启动子和终止子：在原核生物的基因中，启动子是位于转录起始位点上游的DNA序列，终止子是位于转录终止位点下游的DNA序列。
启动子和终止子的序列特点会直接影响基因的转录活性。
例如，启动子上的TATA盒序列通常是原核生物中的转录起始位点，终止子上的rho独立终止序列可以使转录过程自动终止。
这些序列的存在和特点决定了基因的表达水平和调控方式。
4. 负反馈调控：原核生物的基因表达调控中普遍存在负反馈调控机制。
负反馈调控是指基因产物通过结合到自己的启动子或调控区域上，从而抑制自身的转录活性。
这种调控机制可以使得基因的表达水平保持在一定的稳态，并且对外界环境的变化具有一定的适应性。
5. 调控网络简单：与真核生物相比，原核生物的基因调控网络更为简单。
原核生物中的基因调控主要是单个基因与单个调控元件的相互作用，这种简单的调控网络可以使得基因表达的调控更为精确和高效。
6. 高度节约：原核生物的基因表达调控过程非常节约能量和资源。
由于原核生物基因的结构简单，基因表达调控的过程也相对简单，不需要大量的转录因子和调控蛋白的参与，节约了细胞的能量和物质消耗。
原核生物的基因表达调控具有基因结构简单、没有转录因子、启动子和终止子的作用、负反馈调控、调控网络简单和高度节约等特点。
这些特点使得原核生物能够在复杂的环境中快速适应和响应，保证基因表达的高效和精确。
膜蛋白原核表达
膜蛋白原核表达
膜蛋白是一种广泛存在于生物体内的蛋白质，它们在细胞膜上起着重要的作用。
膜蛋白可以通过原核表达系统进行表达，这是一种常用的蛋白质表达方法。
原核表达系统是指利用细菌等原核生物来表达外源蛋白质的一种方法。
这种方法具有表达效率高、操作简单、成本低等优点，因此被广泛应用于生物医学研究、药物开发等领域。
膜蛋白的表达需要考虑到其在细胞膜上的特殊位置和结构。
在原核表达系统中，可以通过将膜蛋白的信号肽序列与表达载体相连，使其能够正确地定位到细胞膜上。
此外，还需要考虑到膜蛋白的疏水性和复杂的结构，因此需要选择合适的表达载体和表达条件，以确保膜蛋白能够正确地折叠和定位。
利用原核表达系统表达膜蛋白可以为生物医学研究和药物开发提供重要的工具。
例如，可以利用表达的膜蛋白进行药物筛选、疫苗研究等。
此外，还可以通过对膜蛋白的结构和功能进行研究，深入了解其在生物体内的作用机制，为疾病治疗和药物开发提供新的思路和方法。
膜蛋白原核表达是一种重要的蛋白质表达方法，可以为生物医学研究和药物开发提供重要的工具和思路。
在未来的研究中，我们可以进一步探索膜蛋白的表达和功能，为生物医学领域的发展做出更大
的贡献。