基因表达系统及技术

基因重组技术生产胰岛素

4. 质粒的拷贝数
增加mRNA数量，提高核糖体与mRNA的结合速度
（1）强启动子提高转录效率；
（2）使用高拷贝表达载体。
可调控的诱导型复制子
宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制
宿主大量生长后，诱导载体质粒复制，增加拷贝数
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5. 宿主菌的选择表达载体与宿主相互匹配
6. 培养条件优化
5’-UAAGGAGG-3’ > 5’-AAGGA-3’
③ SD序列后面的4个碱基
5’-AGGAGGU-3’ ？？？？
如果是A（T），翻译效率最高；如果是G（C），效率只有50%或25%。
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（2）起始密码AUG
AUG左侧的三个碱基也有影响 -半乳糖苷酶的mRNA中：
AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效；
（1）培养基
（2）环境因素（3）诱导时间和剂量
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七、原核细胞表达的缺陷
1、缺乏翻译后蛋白质的加工修饰系统，如糖基化、氨基酸修饰等。
2、原核表达外源蛋白常以包涵体形式存在，必须经过变性、复性处理才能获得有生物活性的蛋白，并且其表达量非常低。
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七、原核细胞表达的缺陷
肠杆菌最有效的翻译终止序列。
（3）密码子的选择 ① 受体菌中共表达稀有密码子tRNA基因 ② 将稀有密码子改为偏爱密码子
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3. 提高目的产物稳定性防止被宿主的酶降解。
（1）表达分泌蛋白
外膜内膜
细胞质
染色体
周间质
质粒
“外排”：蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。 “分泌”：蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。

大肠杆菌表达系统

大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。

表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。

大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。

大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。

据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。

与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。

常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。

该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。

大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。

宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。

其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。

基因表达谱数据分析技术

第18卷第6期微阵列技术[1-3]的到来对生物学和医学来说是一场革命，通过它可以同时观测成千上万个基因的表达水平，从而能够在基因组水平上以系统的、全局的观念去研究生命现象及其本质。

还可以根据基因在不同条件下表达的差异性来进行复杂疾病诊断、药物筛选、个性化治疗、基因功能发现、农作物优育和优选、环境检测和防治、食品卫生监督及司法鉴定等，因此对基因表达谱的研究具有重要的理论价值和应用意义。

微阵列基因表达数据具有维数高、样本小、非线性的特点，这对一些传统的机器学习方法提出了新的挑战，对其数据的分析已成为生物信息学研究的焦点。

1基因表达数据采集基因表达数据采集可分为三个步骤：微阵列设计、图像分析和数据获取、过滤、标准化。

基因芯片（gene chip ），简称为微阵列,就是指固着在载体上的高密度DNA 微点阵，具体地说就是将靶基因或寡核苷酸片段有序地、高密度排列在玻璃、硅等载体上。

mRNA （信使核糖核酸）的表达水平的获得是通过选取来自不同状态的样本（如正常组织与肿瘤组织、不同发育阶段组织，或用药之前与用药之后组织等，一种称为实验样本，另外一种称为参考样本），在逆转录过程中,实验样本和参考样本RNA （核糖核酸）分别用不同的红、绿荧光染料去标记，并将它们混合，与微阵列上的探针序列进行杂交，经适当的洗脱步骤与激光扫描仪对芯片进行扫描，获得对应于每种荧光的荧光强度图像，通过专用的图像分析软件，可获得微阵列上每个点的红、绿荧光强度（Cy5和Cy3），其比值（Cy5/Cy3）表示该基因在实验样本中的表达水平。

在通常情况下，考虑Cy5和Cy3的数值时，还应考虑相应的背景数值，如果微阵列上某个基因的Cy5或Cy3数值比相应的背景数值低，则该基因的表达水平无法确定。

为了方便数据处理，常孟令梅等：一种基于DCT 变换的图像认证算法文章编号：1005－1228（2010）06－0017－03基因表达谱数据分析技术刘玲（江苏财经职业技术学院，江苏淮安223001）摘要：人类基因组计划的研究已进入后基因组时代，后基因组时代研究的焦点已经从测序转向功能研究，主要采用无监督和有监督技术来分析基因表达谱和识别基因功能，通过基因转录调控网络分析细胞内基因之间的相互作用关系的整体表示，说明生命功能在基因表达层面的展现，对目前基因表达谱数据分析技术及它们的发展，进行了综述性的研究，分析了它们的优缺点,提出了解决问题的思路和方法，为基因表达谱的进一步研究提供了新的途径。

CRISPR-Cas技术

基因敲出：如向受精卵中注射Cas9mRNA和 sgRNA、构建gRNA-Cas质粒结合非同达调控：改造成转录激活因子、转录抑制因子等调节蛋白对基因表达进行调控。如使Cas9两个活性位点突变形成dCas9，dCas9不切割DNA，而是引导抑制因子或转录因子的结合到靶位点上，从而达到抑制基因的表达或激活基因的表达。目标位置可以是启动子区域、调控区域或早期编码区域。
在真核生物中DSB （DNA双链切口）可被两种不同的机体自身修复机制修复DSB——非同源性末端连接（NHEJ）和同源重组（ HDR）进行修复。NHEJ能够高效地引入不同长度的插入或缺失突变（indel），产生由于移码突变而导致的基因功能受损，多用于细胞或动物模型中的基因敲除、功能基因组的筛查、转录调控和基因沉默的研究；HDR以DNA结构的同源性为基础，修复会带入特定位点的突变或在外源DNA供体模板存在下对靶点形成可预测的插入.此外还有一种微生物学介导的末端连接，这种在实验中比较少应用。除了DSB，实验时也能利用Cas9突变的“切口酶”形成单链切口（Nick），可通过同源重组（ HDR）进行修复，以完整的链为模板修复缺口。
基于CRISPR-Cas基因保守型和位点构成的不同，可分为TypeⅠ、TypeⅡ 、TypeⅢ三种类型。 TypeⅠ和Ⅲ 行较为复杂，Ⅰ类的特征蛋白是Cas3，在细菌和古生菌中都有。 Ⅲ类的有Cas6和Cas10两种酶。 TypeⅡ系统较简单只存在与细菌，主要是 Cas9酶介导降解外源基因和crRNA的成熟。 CRISPR-Cas系统目前广泛应用，由系统 Ⅱ改造而的，为第三代人工核酸内切酶，比第一代（ZFN）和第二代（TALEN）的人工核酸内切酶操作更加简单、修饰更为精确、且成本低。
实验思路

原核表达技术

原核表达技术原核表达技术是一种基因工程的方法，用于在原核生物（如细菌）中表达外源基因。

它是研究生物学、医学和工业应用的重要工具。

原核表达技术的发展使得我们能够更好地理解基因的功能和调控机制，同时也为蛋白质的生产和应用提供了一种高效可行的方法。

在原核表达技术中，常用的载体是质粒。

质粒是一种环状的DNA分子，能够在细菌中自主复制和表达外源基因。

通过将目标基因插入到质粒的适当位点上，可以利用细菌的表达系统来合成目标蛋白质。

质粒通常包含有启动子、转录终止子、选择性标记基因等功能元件，以便实现基因的高效表达和筛选。

在原核表达技术中，选择适当的宿主菌株也是至关重要的。

常用的宿主菌包括大肠杆菌（E. coli）和酵母菌等。

这些菌株具有良好的生长特性和表达系统，能够提供高效的表达平台。

另外，在选择宿主菌株时还需要考虑到目标蛋白质的特性和表达需求，以确保表达系统的稳定性和产量。

原核表达技术的关键步骤包括基因克隆、转化、筛选、表达和纯化等。

首先，通过PCR等方法将目标基因扩增得到目的片段，并将其插入到质粒的适当位点上。

然后，将重组质粒导入宿主菌株中，使其发生转化。

接下来，通过选择性培养基或标记基因进行筛选，以得到含有目标基因的菌落。

随后，利用诱导剂等方法激活表达系统，使目标蛋白质开始合成。

最后，通过离心、柱层析等手段对目标蛋白质进行纯化和分析，以得到纯度较高的产物。

原核表达技术具有许多优势。

首先，宿主菌株的生长速度快，表达系统稳定，能够提供高产量的蛋白质。

其次，原核表达系统相对简单，易于操作和优化。

此外，原核表达技术还可以用于蛋白质的定点突变、标记和修饰等研究，为蛋白质工程和功能研究提供了重要手段。

然而，原核表达技术也存在一些限制。

首先，由于原核生物的不同表达机制和翻译机器，某些复杂的蛋白质可能无法在原核系统中正确折叠和修饰。

其次，质粒的稳定性和复制效率可能受到限制，影响表达产量。

此外，一些蛋白质可能具有毒性，对细菌的生长和表达产生负面影响。

目的基因在宿主细胞中的表达

T7噬菌体启动子表达载体系统：
T7噬菌体RNA 聚合酶活性很高，合成mRNA的的速率相当于大肠杆菌RNA 聚合酶的5倍。
外源目的基因在原核细胞的表达形式
包涵体：是外源基因的高表达蛋白在原核细胞中积累，并致密地聚集在一起形成的一种水不溶性蛋白质结构。易于分离纯化。具有正确的氨基酸序列，但因其空间构象错误，故一般无生物学活性。融合蛋白：将外源目的基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白称为融合蛋白。具有稳定性好、表达效率高、较易于分离纯化的优点。
考虑外源目的基因的组成。主密码子和罕用密码子。
常见的原核细胞表达载体系统 Plac 启动子表达载体系统：以大肠杆菌乳糖操纵
子调控机制为基础设计和构建的表达系统。
PL 和PR启动子表达载体系统：
PL 和PR启动子是大肠杆菌λ 噬菌体中控制早期转录的启动子， PL 和PR 表达载体系统是该启动子构建的高效表达载体。
表达载体和受体菌
• GS115： Mut+ ， His• KM71： Muts， His• SMD1168： Mut+， His-，蛋白酶缺陷型 • pPIC3.5K：5’ AOX1，MCS，TT，3’ AOX1，His4，
Kanr， ampr，
• pPIC9K：
5’ AOX1，MCS，TT，3’ AOX1，His4，ampr， Kanr，Sig， 5’ AOX1-MCS-TT的两端为BglⅡ和BamHⅠ
在原核细胞中高效表达目的基因高效表达目的基因的基本策略优化表达载体的构建提高稀有密码子的表达频率构建基因高表达受体菌提高外源基因表达产物的稳定性优化工程菌的发酵过程
• 优化表达载体的构建

原核表达系统

05
原核表达系统的研究进展
研究现状
基因克隆技术
随着基因克隆技术的发展，越来越多的基因被成功克隆并用于原核表达系统中，为生物制品的制备提供了更多选择。
表达载体构建
原核表达系统中的表达载体是关键因素，目前已经构建了多种高效表达载体，能够实现外源基因的高水平表达。
宿主菌选择
宿主菌的选择对原核表达系统的表达效果至关重要，经过不断筛选和改良，已成功应用于生产实践的宿主菌种类不断增加。
通过原核表达系统可以大量制备蛋白质，用于研究蛋白质之间的相互作用和复合物组装。
蛋白质工程改造
利用原核表达系统可以对蛋白质进行体外进化、定向改造等，提高蛋白质的特性和功能。
在生物科学研究中的应用
蛋白质组学研究
生物信息学研究
原核表达系统可用于蛋白质组学研究，大量制备蛋白质并进行分析，揭示蛋白质的结构和功能。
原核表达系统
目
CONTENCT
录
• 引言 • 原核表达系统的基本原理 • 原核表达系统的应用 • 原核表达系统的优缺点 • 原核表达系统的研究进展 • 结论
01
引言
主题简介
原核表达系统是一种利用原核生物（如细菌）作为宿主细胞进行目的基因表达的技术。
它具有操作简便、成本低廉、表达量高等优点，广泛应用于基因工程、蛋白质工程等领域。
翻译过程中，宿主菌的核糖体识别mRNA上的起始密码子，开始翻译目的基因，合成蛋白质。
通过调控启动子和终止子等元件，可以控制目的基因的表达水平和方向。
03
原核表达系统的应用
在生物制药领域的应用
80%
生产重组蛋白药物
原核表达系统可用于生产重组蛋白药物，如胰岛素、生长激素等，用于治疗各种疾病。