怎样提取脐血单核细胞的
外周血单个核细胞的分离方法
外周血单个核细胞的分离方法哎呀，朋友们，今天咱们聊聊一个特别有意思的话题——外周血单个核细胞的分离方法。
你可能会问，啥玩意儿？简单来说，就是从咱们的血液里找出一种特别的细胞。
想象一下，这就像在一个巨大的水果市场里，找出你最爱的苹果那样。
1. 什么是外周血单个核细胞？1.1 首先，得跟你解释一下这东西。
外周血单个核细胞，顾名思义，就是咱们血液里的一种细胞，单核的，也就是没有太多复杂的结构。
这些细胞可是咱们身体的宝贝儿，它们能做很多重要的工作，比如免疫应答啊、修复组织啊，所以咱们得小心翼翼地对待它们。
1.2 好了，听上去有点复杂，其实操作起来也没那么难。
咱们只需要用一些科学的工具和方法，就能把这些细胞从血液里分离出来。
这个过程不仅能帮助研究人员更好地了解身体的各种反应，还能在医学上发挥大作用呢。
2. 如何进行分离？2.1 让咱们来聊聊具体的操作步骤吧。
首先，得抽取血液。
哎，这步最让人感到心慌，想象一下那根针头，还是尽量别多想了。
不过别担心，这步过了之后，就进入了最有趣的环节——分离。
血液被抽出来之后，就像把你最喜欢的食材从锅里捞出来一样，要把那些外周血单个核细胞找出来。
2.2 这个过程主要用到的工具叫做离心机。
离心机就像一个超级旋转的机器，把血液转得飞快。
在这高速旋转的过程中，血液里的各种成分会被分离开来，就像咱们在清理菜市场时，把苹果和香蕉分开一样。
离心之后，血液中的细胞就会被分成几层，最上面一层就是咱们的目标——外周血单个核细胞。
2.3 之后，拿到这些细胞，就得用到一些特殊的试剂进行进一步处理。
想象一下，你拿到了一大袋苹果，接下来要把它们洗净、切片，这样才行。
细胞也是一样，需要经过处理和清洗，才能保证它们的纯净和活力。
3. 实际应用3.1 分离出来的外周血单个核细胞可是用途广泛。
比如说，它们在医学研究中，能帮助科学家们了解各种疾病的成因，还能用来开发新的治疗方法。
就像你买了一台新玩具，得先拆开看看里面的零件一样，这些细胞就是研究中的“零件”，帮助咱们了解身体的奥秘。
血细胞分离培养方法和步骤-2
血细胞分离培养方法和步骤-2收集浑浊带分离获得的淋巴细胞，用无钙、镁离子的PBS洗3次后，再用培养基洗1次后计数，分瓶培养。
此法分离获得淋巴细胞纯度高。
分离液的制备：9% Ficoll（20℃下相对密度约1.020）24份与33.4%泛影葡胺（用泛影钠或Conray400也可，在20℃下相对密度约1.200）10份混合后，将其相对密度调至1.077金额可获得淋巴细胞分离液，于12 1℃高压蒸汽灭菌30min，室温保存备用。
若配制高相对密度的分离液用加入高浓度泛影葡胺来调整，若配制低相对密度的分离液用稀释的F icoll来调整。
（二）淋巴器官中淋巴细胞的分离：从脾脏、淋巴结、扁桃体或胸腺等器官中制备淋巴细胞悬液，在免疫学研究中是经常用到的。
方法如下。
无菌取上述淋巴器官，若为扁桃体，应将扁桃体在剥离外表的结缔组织和血块后，在含高浓度抗生素的洗液中4℃浸泡2-4h，以防污染。
将淋巴器官剪成碎块，用镊子压挤碎块，或在金属丝网上研磨，用洗液冲洗，或用玻璃匀浆器研磨，制成悬液。
自然下沉10min后，吸取上层细胞悬液，弃去下层沉淀的组织块，1500 r/min离心，取沉淀物，用无钙、镁离子的PBS洗2次后，混悬于培养基中，分瓶培养。
用上述分离法所获得的拎包细胞，可用于白细胞黏附移动试验、转化试验、细胞毒试验，同时可用于细胞因子的诱生和制备，或扩增外周血造血细胞、树突细胞、淋巴因子激活杀伤细胞(LAK细胞)、Tδ细胞等，供细胞移植用。
（三）人脐带血细胞分离培养：人脐带血来源方便，采集容易，对母婴均无伤害。
近年来研究表明，脐带血的血浆中富含许多高水平的造血活性物质，具有刺激和促进骨髓造血干/祖细胞增殖、分化和再植能力的功能，是造血生长因子的重要来源。
脐带血中富含类似于骨髓的造血干细胞，其中CFU-G、BFU-E、CFU-GM近似或高于正常成人骨髓和外周血中的造血干/祖细胞，比骨髓更原始，具有很强的自我复制和再植能力。
单核细胞处理过程
单核细胞处理过程以下将详细介绍单核细胞的处理过程，主要包括细胞分离、纯化和保存等步骤。
1. 细胞分离：单核细胞通常从外周血、骨髓或者组织中获得。
对于外周血单核细胞的分离，常用的方法有密度梯度离心和磁珠分离。
密度梯度离心是通过在离心过程中离心介质的密度差异，将单核细胞分离出来。
常用的离心介质如Ficoll-Hypaque。
磁珠分离是通过将针对单核细胞特异性抗体（如CD14抗体）结合在磁珠上，然后将其与细胞混合，利用磁力将单核细胞与其他细胞分开。
2.细胞纯化：分离得到的单核细胞通常含有其他细胞类型的污染物，如红细胞、淋巴细胞和血小板。
为了提高单核细胞的纯度，可以使用巨噬细胞亲和柱或负选择方法进一步纯化。
巨噬细胞亲和柱是一种利用巨噬细胞表面表达的特定受体与抗体结合的纯化方法。
常用的巨噬细胞亲和柱有CD14柱，可以高效地将单核细胞纯化。
负选择方法则通过使用针对非单核细胞特异性抗体和磁珠结合，将非单核细胞选择性地去除。
3.细胞保存：为了进行后续的实验操作或长期保存，单核细胞需要被储存。
常用的保存方法有冷冻和低温保存。
冷冻保存是将单核细胞在冷冻液中快速冷冻并保存在液氮或者低温冰箱中。
常用的冷冻液为含有10%二甲基亚砜（DMSO）和90%胎牛血清的培养基。
低温保存是将单核细胞在低温液态氮中保存，可以避免冷冻和解冻过程对细胞的损伤。
4.细胞培养：单核细胞可以通过培养来进一步研究其生物学特性和功能。
常用的培养基为RPMI1640，其中添加胎牛血清、抗生素和细胞增殖剂等。
为了促进巨噬细胞的分化，还可以添加刺激因子，如大肠杆菌脂多糖（LPS）。
培养过程中，需要定期更换培养基并观察细胞的生长情况。
5.细胞实验：处理得到的单核细胞可以用于各种实验，如流式细胞术、酶联免疫吸附实验（ELISA）和功能实验等。
例如，流式细胞术可以用于检测单核细胞表面分子的表达水平，从而研究其分化和激活状态。
ELISA可以用于检测细胞培养上清液中的细胞因子水平。
外周血单个核细胞的分离方法
外周血单个核细胞的分离方法外周血单个核细胞的分离方法，听起来好像很高大上，其实咱们日常生活中也会遇到这种情况。
比如说，你想给你家小狗做个血液检查，看看它身体有没有问题，这时候就需要分离出它的外周血单个核细胞，然后送到实验室进行检测。
那么，这个过程到底是怎么实现的呢？别着急，我这就给你一一道来。
我们需要收集小狗的血液。
这个过程很简单，只需要用一根针头把小狗的静脉扎破，让它的血液流到一个容器里就可以了。
为了避免小狗疼痛，我们可以给它打一针麻醉剂，让它在睡梦中完成这个过程。
这样一来，我们就可以得到新鲜的小狗血液了。
接下来，我们需要把这些血液中的红细胞和白细胞分离出来。
这个过程叫做血液学的“洗涤”。
我们可以把小狗的血液放到一个大桶里，然后加入一些特殊的化学物质，让红细胞和白细胞自动分开。
这个过程可能需要几个小时，但是最终我们会得到两层液体：上面是淡黄色的透明液体，里面主要是血小板和各种细胞碎片；下面是深红色的血浆，里面主要是各种白细胞。
现在，我们已经得到了外周血单个核细胞。
这些细胞是一种特殊的白细胞，它们可以帮助我们了解小狗的身体状况。
但是，我们还需要把这些细胞从血浆中提取出来。
这听起来好像很难办到，但是实际上也很简单。
我们可以用一种叫做离心的方法，把血浆放在一个高速旋转的容器里，让血浆中的细胞被离心力甩到容器的壁上。
这样一来，我们就可以得到一层薄薄的血浆膜，里面包裹着各种细胞。
我们需要把这些细胞进一步分离。
这个过程叫做细胞学的“染色”。
我们可以用一种叫做吉姆萨染色液的特殊液体，给血浆膜上的细胞染上不同的颜色。
这样一来，我们就可以清楚地看到各种细胞的结构和功能了。
这个过程可能需要几小时甚至几天的时间，但是最终我们会得到一张精美的细胞图谱，上面记录着小狗身体内各种细胞的数量和状态。
通过以上步骤，我们就成功地分离出了小狗的外周血单个核细胞。
虽然这个过程看起来很复杂，但是实际上只要掌握了正确的方法和技巧，就可以轻松地完成。
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准
人外周血单个核细胞的采集、分离和保存标准全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）的采集、分离和保存是在医学研究和临床诊断中非常重要的步骤。
PBMCs是一类具有免疫功能的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞，能够在机体的免疫应答中发挥重要作用。
为了保证试验结果的准确性和可靠性，对PBMCs的采集、分离和保存必须按照相应的标准进行操作。
一、采集1. 选择合适的采集方法：一般常用的采集方法包括静脉抽血和手指取血等，静脉抽血常用于采集较多血液量的情况，手指取血则适用于采集少量血液的情况。
2. 确保采集操作标准化：在采集PBMCs的过程中，应该遵守严格的消毒和无菌操作规程，以防止细菌和病毒的污染。
3. 采集完整的血液样本：为了确保PBMCs的纯度和稳定性，应该尽量避免气泡和血细胞破损导致的RNA降解等情况。
二、分离1. 使用适当的分离方法：一般常用的PBMCs分离方法包括密度梯度离心和磁珠分选等，密度梯度离心适用于分离较大量的PBMCs，磁珠分选则适用于分离特定类型的细胞。
2. 选择合适的分离液：密度梯度离心中一般使用的分离液包括Ficoll和Percoll等，磁珠分选中则需要选择特定的磁珠标记物。
3. 保证分离效率和纯度：在PBMCs的分离过程中，应该确保细胞的分离效率和纯度，避免细胞的损失和杂质的混入。
三、保存1. 选择合适的保存条件：PBMCs的保存条件包括温度、储存液和容器等要素，应该选择适合PBMCs存活的条件进行保存。
2. 快速冻存PBMCs：为了避免细胞的降解和失活，应该在采集和分离PBMCs后尽快将其冻存。
3. 定期监测保存效果：在存储PBMCs的过程中，应该定期监测PBMCs的存活率和纯度，以确保PBMCs的质量和稳定性。
对于人外周血单个核细胞的采集、分离和保存，在操作的过程中应该严格按照相应的标准进行，以确保PBMCs的质量和稳定性，为后续的研究和临床应用提供可靠的基础。
外周血单个核细胞的分离
实验二十四外周血单个核细胞的分离(Separation of mononuclear cell in peripheral blood)免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。
外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。
此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。
【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。
市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20℃密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.050～1.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.080～1.110。
将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。
【主要试剂和器材】1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度为1.077±0.001。
2.5g/L台盼蓝。
3.250U/ml肝素溶液用Hank,s液配制。
4.Hank,s液。
5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。
6.水平离心机、显微镜。
【操作方法】1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。
再加入等量Hank,s液混匀。
2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。
稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。
3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。
4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。
脐带血采集操作规程
脐带血采集操作规程脐带血采集操作规程1. 简介脐带血采集是一种新兴的干细胞采集方式，通过采集新生儿脐带中的干细胞，可以用于治疗多种疾病，如血液系统疾病、免疫系统疾病以及某些遗传性疾病等。
脐带血采集操作规程对于确保采集的过程安全、有效非常重要。
2. 准备工作2.1 确认采集地点：脐带血采集室应具备干净、安静的环境，避免外界干扰和交叉感染。
2.2 准备所需材料：脐带血采集所需材料包括无菌手套、无菌手术巾、一次性无菌注射器、脐带血采集袋、抗凝剂以及标签等。
所有材料应提前准备并确保无菌。
3. 操作步骤3.1 术前准备：医务人员应穿戴好无菌手套，将所需材料摆放在操作台上，检查脐带血采集袋、注射器等是否完好并符合规定。
3.2 分娩后操作：待新生儿脐带脱离胎盘后，医务人员应立即进行脐带血采集。
首先用无菌手套包住新生儿脐带，将其从胎盘上剪断，并以无菌手术巾清洁脐带血采集点，以避免污染。
3.3 血液采集：使用无菌注射器将脐静脉血抽取到脐带血采集袋中。
在采集过程中，医务人员需要注意避免空气进入采集袋，以免对血液质量产生影响。
血液采集量应达到标准要求。
3.4 抗凝剂添加：在血液采集完成后，医务人员应立即将抗凝剂按照规定比例添加到采集袋中，以防止血液凝固。
3.5 标签签名：医务人员应在采集袋上正确填写患者的信息，并签名确认采集操作的完成。
4. 安全注意事项4.1 无菌操作：医务人员需遵循无菌操作规程，保证所使用的材料和工具无菌，以避免感染风险。
4.2 避免交叉感染：在脐带血采集过程中，医务人员应遵守洗手消毒规范，并确保操作环境清洁。
4.3 注意血液采集量：血液采集量应符合标准要求，过多或过少都可能对后续的干细胞应用产生影响。
4.4 心理护理：由于脐带血采集是在新生儿出生后进行的，医务人员应与家属充分沟通，提供心理支持。
5. 对脐带血采集的观点和理解脐带血采集作为一种新兴的干细胞采集方式，具有许多优势。
首先，脐带血采集简单方便，不需要进行手术切取，对新生儿和母亲无损伤。
外周血单个核细胞的分离方法
外周血单个核细胞的分离方法嘿，伙计们，你们有没有想过，为啥我们身体里的那个小不点——单核细胞，能帮我们搞定那么多问题？今天咱们就来聊聊这个“超级英雄”——外周血单个核细胞是怎么被我们驯服，变成治疗战场上的得力助手的。
咱们得了解单核细胞是什么。
它就像是个小卫士，专门负责保护我们的血液不受细菌和病毒的侵害。
想象一下，如果单核细胞是个战士，那它们肯定是那种冲锋在前、不畏艰险的勇士。
不过，这些勇士可不是随便就能招募的哦！你得先让它们从血液中跳出来，这就像是一个魔法咒语——那就是分离技术。
那么，如何让这些勇士跳出来呢？这就要靠咱们的分离技术了。
简单来说，就是通过一些巧妙的方法，把单核细胞从其他细胞中“揪”出来。
这个过程就像是在玩捉迷藏，你藏好了，我找到了你。
这里的“藏”和“找”可不是真的躲猫猫哦，而是利用物理或化学的方法，让单核细胞乖乖地待在一个地方，而其他细胞则四处游荡。
接下来，咱们来谈谈分离技术的几种常见方式。
第一种是密度梯度离心法，就像是一个神奇的过滤器，根据不同密度的物质沉降速度不同，让单核细胞“跳”到最上层。
第二种是免疫磁珠法，就像是一个聪明的小助手，用一种特殊的磁性物质吸引那些带有特定标记的单核细胞。
第三种则是流式细胞分选技术，就像一个魔法师，通过观察细胞表面的标记，精准地“召唤”出我们需要的单核细胞。
这些方法各有千秋，但最终的目的都是为了让我们能够轻松地找到那些勇敢的单核细胞战士们。
想象一下，如果我们的身体里有一支训练有素的军队，随时准备为我们排忧解难，那该有多好！当然啦，虽然我们现在有了这些分离技术，但要想真正成为治疗战场上的得力助手，还需要不断地学习和进步。
就像那些单核细胞战士们一样，我们要不断学习新的技能，提高自己的战斗力，才能更好地保护我们的健康。
我想说，单核细胞战士们虽然只是身体里的一小部分，但他们却承担着保卫我们健康的重任。
我们应该珍惜他们，爱护他们，同时也要感谢那些伟大的分离技术，让我们能够更加便捷地接触到这些英勇的战士。
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怎样提取脐血单核细胞的（明胶法）分离脐血单个核细胞。
我们现在总结出最好的方法是按以下步骤1)先用生理盐水配3%的明胶，高压后用之前再溶化，至37度左右，与脐血等量混合，约30分钟，取上清液2)2000rpm 离心，浓宿细胞3)用10ml离心管，加入4ml左右的Ficoll分离液后，加浓缩细胞液，2000rpm 离心，4)取中间的白膜层，即为单个核细胞此法是经过我室多种方法的比较后得出的。
不会丢失单个核细胞。
3%明胶和HES的作用应该是一样的，均可加速红细胞沉淀。
明胶的作用就是沉淀大量的红细胞. 平均约50ML的脐血最终可以得到单个核细胞2X10E8个细胞这个数量级我想不管做什么实验都足够了.丢失的细胞约1X10E6,几乎不会损失. 随脐血应用范围的逐渐扩大,脐血库的建立事在必行。
减小脐血体积最简单的方法是在冻存前去除红细胞。
研究发现,明胶沉降法的造血祖细胞回收率较高,同时可去除超过95 %的红细胞。
Pick 等[[ 8 ] Pick M, Nagler A , Grisaru D , et al . Expansion of megakaryocyte progenitors from human umbilical cord blood using a new two2step separation procedure[J ] . Br J Haematol ,1998 ,103 (3) :639 - 650. ]设计了一种新的两步法。
第一步,用明胶去除大部分红细胞, 第二步,用Ficoll 去除残余的红细胞和中性粒细胞。
结果发现,与单用明胶相比,采用明胶+ Ficoll 法在几乎完全去除红细胞的同时,对CD34 + 细胞没有太大影响,而且巨核系祖细胞得到了富集。
本实验采用这种方法效果较好第十八章血细胞分离技术(Separation technique of the blood cell) 一,原理在体外进行细胞免疫检测时,首先必须进行淋巴细胞的分离.分离淋巴细胞的方法很多,但不管采用哪种方法,均要求分离的淋巴细胞纯度高,产量多,而且不丧失活性,同时也要求分离技术简单,操作方便. 外周血液中红细胞和白细胞的比例在几百甚至上千比一,两类细胞的大小和密度不同,其沉降速度也就不同.红细胞的自然沉降率较快,加入高分子量的聚合物,如明胶,右旋糖酐等还可以加速其凝聚.利用自然沉降法,密度梯度离心法或二者结合,可以将淋巴细胞从血液中分离出来.这种分离出的淋巴细胞一般包括单核细胞.除去单核细胞,可以利用单核细胞的吸附功能,如铁颗粒,玻璃面或尼龙网等,除去(或分离)单核细胞,从而提纯淋巴细胞. 二,采血(一)材料与试剂 1.抗凝剂(1)肝素:肝素是含硫酸基的粘多糖,常用其钠盐或钾盐,它能阻止凝血酶原转化为凝血酶,进而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白,从而阻止血液凝固.常用的肝素溶液浓度为1 000U/ml,市售肝素多为100U~126U/mg. (2)乙二胺四乙酸(EDTA):是一种螯合剂.用生理盐水配制成4%的溶液备用. (3)阿氏液(Alsever 液),配方如下: 枸橼酸钠(Na3C6H5O7·5H2O) 0.80g 枸橼酸0.0325g 葡萄糖 2.05g 氯化钠0.42g H2O 加至100.00ml 混匀溶解后,114.3℃高压蒸汽灭菌10min备用. 阿氏液中既含有枸橼酸钠抗凝剂,又含有细胞生存的营养,所以它既可做抗凝剂,又可做血细胞的保存液. 2.针头根据不同动物和采血部位,采用不同型号的针头,用前必须灭菌或消毒. 3.采血容器注射器或三角瓶等. 4.采血动物. (二)操作方法 1.采血法各种动物采血方法不一.马,牛,羊等大动物一般从颈静脉采血,猪从颈静脉,前腔静脉或耳静脉采血,家禽由翼下静脉或心脏采血,兔由心脏或耳静脉采血,犬由颈静脉或四肢静脉采血,豚鼠由心脏采血,小白鼠则可断尾或剪断腋下血管或剪断眼球采血. 2.抗凝采集血液最关键的问题是抗凝,采用什么方法进行抗凝,则根据实验的要求和条件而定.最常用的方法如下: (1)肝素抗凝:采血时,使每ml血液含15U~20U 肝素即可.计算采集的血液量,按1 000U/ml的量加入肝素,直接放入采血容器中,采血时,边采血边轻轻摇动,使抗凝剂和血液混匀.对于采少量的血液或小动物采血,可直接用注射器抽取一定量的肝素液,再采血直接抗凝. (2)EDTA抗凝:采血前,用灭菌生理盐水将EDTA配制成4%溶液,然后按预采血液的量,以每ml血液加入1mg~2mg的EDTA的液体量于采血容器内.采血,并不断摇动采血容器,使之混匀. (3)玻璃珠法:预先将适量的玻璃珠(根据采血量多少而定)清洗后,装入采血容器中,灭菌后备用.采血过程中,边采边摇采血瓶,以使小玻璃珠在血液中滚动,以机械地除去纤维蛋白,使血液不能凝固.本法虽较麻烦,但对淋巴细胞的活性影响最小,且可减少血小板的混杂. (4)阿氏液采血:以阿氏液和采血量以1∶1比例采集血液,边采边轻轻摇动采血瓶,使之混匀.用阿氏液采血,除了抗凝外,多用于红细胞的保存.一般在4℃条件下,阿氏液中保存的红细胞2周其活性和特性不变. 三,红细胞的分离技术(一)材料与试剂 1.肝素等抗凝剂2.3%明胶液取明胶3g,溶于0.9%灭菌盐水100ml中,114.3℃灭菌10min,冷却后4℃冰箱保存.临用时,37℃预热10min. 3.阿氏液(二)操作方法 1.采血抗凝,即为红细胞.由于红细胞与白细胞的比例相差悬殊,一般白细胞混杂在其中,忽略不计. 2.根据红细胞的用途,可做进一步的处理.如计算红细胞,可直接稀释计数.如需做补体结合反应,或其它溶红细胞反应,则需将红细胞进行充分的清洗,以除去附着在红细胞膜表面的血浆.一般用等渗的稀释液连续清洗,2 000r/min离心10min,重复3~4次. 3.如需储藏备用,则以阿氏液做抗凝剂采血,混匀后置4℃冰箱保存,可保存2周,其活性尚可. 四,淋巴细胞的分离技术(一)材料与试剂 1.淋巴细胞分层液有两种: (1)聚蔗糖—泛影葡胺液:聚蔗糖(polysucrose solution),商品名Ficoll,分子量400 000,多配制成40±1%(W/V)水溶液,也有干粉出售.应用时,用蒸馏水配制9%溶液.泛影葡胺溶液(Meglumini diatrizoici),商品名Vrografin,结构式为3,5—二乙酰氨基2,4,6三碘苯甲酸1—去氧—甲氨基山梨醇.含量为60%或75%,每安瓶为20ml装,常用于人的脏器造影.应用时,取60%泛影葡胺原液20ml,加双蒸馏水15.38ml,即为33.9%泛影葡胺. 1.077±0.001聚蔗糖—泛影葡胺的配制: 9%聚蔗糖液24份33.9%泛影葡胺液10份混合即可.必要时,可测比重.需要备用,可用G5漏斗过滤除菌或114.3℃高压灭菌15min,4℃保存.一般可保存3个月. 如要配制不同比例的分层液,可按下列公式计算: 式中dm为分层液的比重,d1和d2分别为9%聚蔗糖和33.9%泛影葡胺的比重,V1和V2分别为它们的体积.如需配制1.077比重的聚蔗糖—泛影葡胺的分层液,则9%的聚蔗糖和33.9%的泛影葡胺的比例应为100∶46.3. (2)泛影葡胺—右旋糖酐(dextran)液34%泛影葡胺液10份60%右旋糖酐液12.5份混合,即为比重1.07～1.09的分层液.分装于棕色瓶中,4℃冰箱保存备用. 2. 3%的明胶液称取明胶3g,溶于0.9%的灭菌生理盐水,终体积100ml,114.3℃高压灭菌10min,冷却后4℃冰箱保存,临用时37℃预热10min.3.Hank's液. (二)操作方法1.取抗凝血,自然沉降,如是马属动物的血液,可直接直立试管架上,让其自然沉降1h,取上层血浆.如是牛,羊血液,由于其血沉速度非常慢,可加等量3%明胶液,混匀后让其自然沉降,1h后取上层血浆. 2.2 000r/min离心10min,弃上清. 3.沉淀用Hank's液混悬后,再2 000r/min离心10min.4.重复步骤3一次,再用细胞营养液将白细胞制成悬液.此液含有整个白细胞群,包括粒细胞,淋巴细胞,单核细胞和部分红细胞.可供白细胞计数用.5.取2ml细胞分层液于离心管内,同时用毛细吸管吸取约2ml的血浆(自然沉降1h的上层血浆)轻轻加入分层液上,直接加抗凝血也可.6.以水平转子离心机2 000r/min离心20min.离心后,可见分成多层,最下层是红细胞,中间层是分层液,最上层是血浆.在血浆层与分层液之间是一薄层较致密的白色层,即为单个核细胞层.7.用毛细吸管插入到单个核细胞层并吸取该层,放入另一试管中.8.以Hank's液洗涤,离心,最后配制成适当的白细胞浓度.必要时可计数. (三)注意事项1.血浆或血液加入分层液中时要小心,缓慢不要打乱液层,不要摇动.也可以将分层液加入到血浆的上层. 2.保持淋巴细胞的活性是非常重要的,所以一般情况下,是现采血,马上进行分离. 3.经过分层液分离的淋巴细胞层,实际上是单个核细胞层,包括单核细胞,不包括粒细胞.欲分离出纯的淋巴细胞,则按下法除去单核细胞,或收获单核细胞. 五,单核细胞分离技术(一)铁粉吸附法 1.材料及试剂(1)铁粉或羰基铁粉(Atomergic chemetals)99%的纯度,颗粒小于60 m(Goodfellow Metals). (2)强磁铁(马蹄形). (3)一块小棒状磁铁(约1cm长). (4)毛细吸管等. 2.操作方法(1)称取一定量的铁粉,一般为10g,用100ml生理盐水洗涤4次,去除任何可溶性有毒物质.在倒去盐水时,用强磁铁吸住铁粉. (2)用50ml生理盐水混悬铁粉.摇匀后,分装于10个瓶中,包扎瓶口,121℃灭菌20min,拿出后立即轻轻摇匀,防止铁粉结块,储藏备用. (3)临用前,倒去瓶中的生理盐水,加入适量的单个核细胞悬液(3ml～5ml,细胞总数为8×107个/瓶).37℃温育45min,中间不时晃动,使铁粉悬浮起来. (4)加入一块小磁铁棒于瓶中,让其吸住铁粉以及附着在铁粉上的细胞. (5)倒出悬液,此悬液主要是淋巴细胞,离心,收集. 在铁粉瓶内倒入一定量的Hank's液,用力振摇后,以强磁铁吸附,几分钟后,倒出液体. (7)2 000r/min离心液体,管底即为单核细胞. (二)玻璃板吸附法将分离的单个核细胞倾于无菌洁净的玻璃平皿内,置37℃30 min～40min,用毛细吸管轻轻吸取悬液,即为淋巴细胞.用适量的Hank's液冲洗平皿,收获即为单核细胞悬液. 六,T淋巴细胞的分离技术(一)原理混合单个核细胞悬液在通过尼龙毛柱时,B细胞,浆细胞,单核细胞和一些辅助细胞被选择性粘附于尼龙毛上,而多数T细胞则通过尼龙毛柱,这是获得富含T细胞群的有效方法. (二)材料及试剂 1.尼龙毛(Femwall Laboratories,LP-1 Leukoqak leukocyte Filters). 2.烧杯,铝箔,漏斗,一次性手套等. 3.装填尼龙毛柱,一次性注射器. 4.取自然沉降的上层血浆,过聚蔗糖—泛影葡胺分层液后,获取的血浆和分层液之间的单个核细胞层. (三)操作方法 1.尼龙毛的清洗与干燥(1)戴上已经洗去滑石粉的一次性手套,将尼龙毛(1包或2包,每包35g)放入烧杯中,加入蒸馏水或去离子水,用铝箔盖上烧杯并煮沸约10min. (2)冷却至常温,倒入漏斗内,使水滴干. (3)重复(1),(2)步骤6次. (4)将尼龙毛摊在铺有纱布的方盘内,37℃温箱干燥2～3天后,贮藏在带盖的方盘内. 2.装尼龙毛柱(1)取50ml玻璃注射器,拔去注射芯,在注射器头上套一段带夹子的胶管. (2)将尼龙毛梳理,并适当折叠,以适应注射器的直径,填入注射器内,约20ml的体积. (3)将填好尼龙毛的注射器连同注射器芯一起包好,高压灭菌. 3.细胞分离(1)将注射器固定在支架上,倒入37℃的细胞培养液,关闭阀门一定时间,然后打开阀门,放掉细胞培养液,以清洗几次尼龙毛,关上阀门. (2)将要分离的细胞液用预先加温的培养液稀释成适当的浓度,约5.00×107个细胞/ml. (3)将细胞液倒入注射器内,使之没过尼龙毛柱.盖上注射器,37℃温育45min 至1h. (4)打开下口,缓慢放流(1滴/min),收集于离心管中. (5)离心,即获所需的T淋巴细胞. 关闭注射器下口,于注射器内加入0.85%冰冷生理盐水,振荡,并套上注射器芯,打开下口,使劲推出注射器内液体,即获得粘附于尼龙毛上的B淋巴细胞,浆细胞,巨噬细胞等. (四)注意事项 1.此种分离法,T淋巴细胞也常有一部分被吸附,吸附的多少与尼龙毛的质量有关,与装柱的松紧也有关系. 2.此法的T淋巴细胞的回收率约20%～30%. 3.用过的尼龙毛可回收,以盐水洗涤,然后浸入0.1Mol/L的HCl中过夜,然后再同前法清洗. · ·。