qPCR 样本处理(1)--------人外周血淋巴细胞RNA的提取方法
血液RNA提取
血液RNA提取完全可以,我曾经全血标本6个小时后分离白细胞提RNA,结果很好.因为你提的是白细胞内的RNA,因而在细胞没破损前,一般情况下不会出现RNA的降解,当你开始加TIIZOL时,你的所有器材的处理尤其重要,因而放心的做吧,本人长期从事白血病融合基因的检测，曾经使用4度保存3天的血液进行RNA提取，效果同样非常满意，目前使用的一次性耗材基本上不用DEPC水处理，只要注意规范操作，按TIIZOL说明书操作，提取的RNA 质量同样非常的高。
附上本试验室的简易操作程序：1．外周血及骨髓（抗凝）利用淋巴细胞分离液分离单个核细胞（1）外周血送检需5-10ml抗凝血，骨髓需1-3ml抗凝，常温送检(样本量根据单个核细胞的数量来确定，一般需要5x106单个核细胞以上)。
（2）加入等体积无菌PBS于外周血及骨髓中充分混合，形成细胞悬液；（3）加入5ml淋巴细胞分离液于另一离心管。
（4）吸取5ml细胞悬液沿管壁轻轻加入到淋巴细胞分离液表面（注意勿与淋巴细胞分离液混合）。
离心1500rpm 20min。
（5）用吸管轻轻吸出界面层（白膜）中的MNC入另一离心管中。
无菌冷PBS洗2次，最后1次洗涤可以将细胞悬液移入EP管中，离心去上清直接或加入TRIzol混匀后-70℃冻存，或直接提取RNA（可以先进行细胞计数以保证细胞数）。
2．利用Trizol的方法提取细胞总RNA（参照Invitrogen公司Trizol说明书）以下步骤要严格防止RNA酶降解RNA，所使用的离心管和枪头要用0.1% DEPC水处理24h，然后高压灭菌并烤干。
尽量快地进行操作，减少RNA降解。
（1）先加1ml Trizol于1×107细胞中，若冻存细胞直接加入Trizol，不需解冻，吹打裂解后室温静置5-10min。
（可-70℃，1月）（2）加入0.2ml氯仿（三氯甲脘），剧烈震荡（vigorously）15s，室温静置2-3min。
RNA提取步骤
RNA提取步骤RNA（Ribonucleic Acid，核糖核酸）是细胞中一类重要的生物大分子，承担着重要的遗传信息传递和蛋白质合成的功能。
RNA提取是研究RNA生物学功能的基础，下面是RNA提取的基本步骤。
1.样本选择和收集：样本的选择和收集是RNA提取的第一步。
样本可以是任何含有RNA的细胞、组织或体液，如细菌、真菌、动物和植物组织。
在选择样本时，应注意保持样本的完整性和纯度，以最大限度地保留RNA的完整性。
2.细胞或组织破碎：细胞或组织破碎是RNA提取的关键步骤。
破碎细胞可以释放细胞质中的RNA，并使其易于提取。
通常有以下方式实现细胞或组织的破碎：-机械破碎：使用搅拌器或超声波浸没仪等设备将细胞或组织破碎。
-化学破碎：使用化学溶解剂如含有离子的缓冲液等破碎细胞。
-酶解：使用蛋白酶等酶类分解细胞或组织。
3.细胞或组织的裂解：细胞或组织裂解是破裂细胞膜和核膜，使RNA释放出来的步骤。
细胞或组织的裂解可以采取以下方法：-物理方法：如超声波、高温或高压等。
-化学方法：如使用制备裂解液溶解膜。
-酶解法：如使用蛋白酶等酶类裂解细胞膜。
4.RNA的纯化：在RNA提取过程中，纯化RNA以消除DNA、蛋白质和其他杂质是非常重要的。
以下是常见的纯化步骤：- DNase处理：用于降解DNA并消除其对RNA的干扰。
-蛋白酶处理：用于降解蛋白质并消除其对RNA的干扰。
-异丙醇沉淀：用来沉淀RNA，将其分离出其他溶液中的杂质。
-高盐沉淀：用来消除RNA的杂质。
5. 经过上述步骤后，可以使用RNA作为后续实验的模板，如逆转录PCR（Reverse Transcription PCR）进行mRNA的合成和扩增、Northern blotting进行RNA的检测等。
在RNA提取过程中，需要注意以下几点：-提取操作应注意消除污染源，严格遵守无菌技术，避免RNA的降解和污染。
- 所有操作和提取溶液都应严格遵守操作规范，使用无RNase的耗材和试剂。
临床PCR检验标本的采集、处理、保存及核酸提取方法-文档资料
江西省肿瘤医院 陈文学
2021/4/6
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检验误差的发生率
1997年，一位意大利著名检验专家对急诊检验 误差发生的种类和发生率进行了统计。结果显 示，约有68.2%的检验误差发生在检验前期， 而来自检验中期和检验后期的误差率分别为 13.3%和18.5%。
50ul痰
6000g离心10分钟，弃上清
加入裂解液50ul，60℃温育30min
90℃温育30min 加入Tris-HCl中和以上反应混合物
取5ul用于PCR检测
2021/4/6
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痰标本处理中要注意的问题
痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情 况下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN） 方法提取。采用这种方法提取，有可能会 在提取过程中，出现一种可修饰DNA的酶， 在最后一步提取中，与核酸一起洗提出来， 从而抑制其后的扩增。
在PCR主反应混合液中，加入α-酪蛋白 （alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类 抑制物产生的效果。
2021/4/6
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棉拭子
在使用PCR方法检测性病病原体时,临 床标本一般为棉拭子,可将棉拭子置于 适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温 静置5～10分钟,待大块状物下沉后,取 上清立即离心,其后的沉淀即可用于 DNA提取。
20000g室温离心10-15min，弃上清 加入5倍10%chelex-100，混匀，90℃温育40min
20000g室温离心5min取5ul用于PCR扩增
2021/4/6
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痰标本处理简单模式
试剂：（1）裂解液:含终浓度0.1 mol/L NaOH、50μg蛋白 酶K和0.05% Triton X-100
组织、细胞提取RNA步骤、方法、所需材料及RT-PCR步骤
组织、细胞提取RNA步骤、方法、所需材料及RT-PCR步骤RT-PCR步骤Rt-PCR实验步骤可参考附件一、实验器具与材料1、移液枪:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl2、吸头：1 ml、200μl、20μl3、匀浆管：5ml4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个5、EP管：1.5ml、200μl、100μl6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）、1个125ml 的白色试剂瓶（放无水乙醇）7、量筒：50ml、250ml、500ml8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、试管架：5ml、1.5ml、20μl10、盐水瓶：250ml、500ml各两个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水11、铝制饭盒：4个12、塑料小饭盒：1个13、大瓷缸：2个14、锡箔纸：2卷15、卷纸：2卷16、三角烧瓶：带盖，稍大二、实验器具的处理与准备1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）三、试剂配制1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2、75%乙醇：用无水乙醇加DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压）3、异丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、琼脂糖四、几种缓冲液的配制1、电泳缓冲液：Tris 54g硼酸 27.5g0.5M EDTA 20ml？PH：8.0蒸馏水 1000ml5×TBE （贮存液）再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液+450ml水-→500ml工作缓冲液2、上样缓冲液：0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF30%甘油6×缓冲液，4℃保存五、琼脂糖凝胶的配制：1、1.0%：1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂糖冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。
QPCR步骤（1）
QPCR步骤（1）展开全文QPCR（枪头和离心管均无RNA酶)提取细胞RNA1. 细胞长满80%，弃培养基，冰PBS洗涤细胞2次空干（用枪吸尽PBS)2. 加1ml冰TRizoL（大皿1.5ml 中皿1ml 六孔板500ul）,吹打使细胞完全脱落，吸入1.5ml EP管(无酶)3. 加氯仿200ul,漩涡混匀器振荡15秒，室温静置5分钟4. 4℃ 12000rpm 5分钟5. 吸取上层水相（勿吸入中间层）0.5-0.7ml移至另一1.5ml离心管中，加异丙醇0.5-0.7ml（1:1加入）6. 充分混匀，冰盒上静置10分钟， 4℃ 12000rpm 30分钟7. 弃上清,加75%冰乙醇（DEPC水）1ml, 颠倒混匀数次8. 4℃ 12000rpm 5分钟9. 弃上清, 吸干, 加DEPC处理去离子水10-20ul （视沉淀大小而定)10. 测浓度（取5ul作RNA电泳，5ul作RNA定量，余-80℃冰箱保存）RNA鉴定：在紫外分光光度仪上测定RNA OD260/OD280均在1.8～2.0之间，表明抽提RNA纯度良好。
反转录反应：1.去除基因组DNA：(0047A)按下列组成配制反应混合液（冰上进行）：试剂加入量→离心→PCR 仪（42℃ 2min 4℃ hold）2.反转录反应：(037) 按下列组成配制反转录反应液（冰上进行）：→离心→PCR 仪（42℃ 15min85℃ 5s 4℃ hold 得到的cDNA 于-20℃保存PCR 反应：采用Real-time PCR 技术分别检测各基因表达丰度。
所有操作均在冰上完成，以β-actin 为内参基因，引物均由上海生工设计并合成。
每组设置3个复孔，不同标本的相对表达定量（RQ ，Relative Quantity ）值RQ=2-△CT 。
△Ct=目的基因Ct 值-内参基因Ct 值。
详细步骤如下：gDNAEraser 1μl 5×gDNAEraserBuffer 2μl总RNA ≤1μg RNase Free 水 补足至10μl试剂 加入量PrimeScript RTEnzymeMixI 1μl 5×PrimeScript Buffer 2（for RealTime ） 4μlRT PrimerMix 1μl RNase Free水 4μl按下列组成配制PCR反应液：试剂加入量TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）5μlR O X R e f e r e n c e D y e I I（50×）0.2μlPCR Forward Primer（10 μM）0.4μlPCR Reverse Primer（10 μM）0.4μlD N A模板1μlR N a s e F r e e水3μl使用ABI 7500 Real-Time PCR仪按以下条件进行PCR反应：95℃ 30sec预变性 1cycle 95℃ 5sec 60℃ 34sec PCR反应 40cycles。
qPCR操作步骤
QPCR（Real-time Quantitative PCR Detecting System）即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统。
标准的两步法：RNA提取→随机引物反转录→反转录产物10倍稀释→real-time PCR.注意：1 高质量的RNA获取，这里的高质量不是强调RNA降解，而是强调RNA 的纯度，不能含有基因组DNA,以及其他杂质污染。
基因组DNA的存在会导致定量偏高，给你错误的结果，所以一般用于定量PCR的RNA必须使用DNase处理，消除DNA污染。
而RNA中的杂质的污染会限制real-time PCR的反应，导致扩增失败，给你假阴性的结果。
RNA的降解不是关键，一个是因为定量PCR的引物扩增目的长度本身很短，150-250个bp，并不用于扩增目标基因的全长。
此外是因为存在内参基因，所以RNA降解会通过内参基因的测定来平衡。
毕竟一旦发生降解，所有的RNA以同样的速度降解，而相对比率不会改变。
2 减少加样误差，在使用SYBR Green MIX的时候，一定要先按照反应的量（比如8个孔）把所有的试剂一次性配成MIX然后分装，留出5微升的反应体系给模板，使用5微升是因为只有5微升以上，加样枪的误差才会比较小，如果你仅仅是吸取一微升的话，手重一点或者轻一点都会造成极大的加样误差，严重影响你的定量精确度。
3 选择合适的内参基因，一般用于定量PCR的内参基因有好几种，但却没有完全通用的内参基因。
具体到不同来源的细胞，比如不同组织来源，或者是动物等等，内参基因会有差异，最好的办法是，在你的样品上先测试内参基因，找到变化最小，最稳定的一个。
4 合适的引物设计，避免出现引物二聚体，非特异性扩增等。
Q-PCR实验流程：一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。
②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。
RNA提取操作流程
RNA提取操作流程1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。
混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定A260下读值为1表示40 ?g RNA/ml。
样品RNA浓度(?g/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 ?g/ml。
具体计算如下：RNA溶于40 ?l DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495?l的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 ?l，剩余RNA总量为：35 ?l × 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
从外周血淋巴细胞中提取RNA
从外周血淋巴细胞中提取RNA
实验概要
本实验从外周血淋巴细胞(PBls)中分离得到RNA样品。
实验步骤
1．收集新鲜人血液并立即用Ficoll分离白细胞。
2．用冰冷PBS洗涤外周血淋巴细胞3次。
3．在50ml塑料离心管中收集外周血淋巴细胞，并加入7ml裂解缓冲液(可溶解达到5×108个外周血淋巴细胞)，然后剧烈涡旋振荡以溶解细胞。
4．加入7体积(49m1)4mol/L氯化锂，4℃孵育15～20小时(过夜)。
5．将悬液转移到30mlCorex管内，在吊桶式转头内4℃离心2小时，6500r/min。
6．弃去上清，并用Kimwipe擦拭试管口。
用3mol/L氯化锂(大约15ml)重悬，收集沉淀.将沉淀重悬液离心，6500r/min1小时。
7．弃去上清，用2m1RNA溶解液溶解沉淀。
在-20℃下，彻底冷冻悬液。
8．复溶悬液，每10分钟涡旋20秒，共45分钟。
9．用等体积酚抽提1次，并用等体积氯仿抽提1次。
10．加入1/10体积的3mol/L乙酸钠，pH 4.8和2体积一20℃乙醇。
彻底混合溶液，并在-20℃下孵育过夜。
11．在吊桶式转头内离心RNA，12000r/min30分钟。
用0.2m1DEPC处理水重悬沉淀。
将溶解的DNA转移至1.5m1微量离心管内，并加入1/10体积3mol/L乙酸钠，pH 4.8和2体积-20℃乙醇，重新沉淀。
并以乙醇沉淀物形式保存RNA，直至准备使用时。
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人外周血淋巴细胞RNA的提取方法
一、采集血样，室温保存。
使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。
一般使用EDTA或肝素抗凝均可；血量一般为1ml；一般地，1ml外周血中含有大约1-2*10^6个单个核细胞（PBMC，即淋巴细胞核单核细胞）。
二、提取淋巴细胞。
取1.5ml 无菌无酶的离心管，为管1，先加入500ul淋巴细胞分离液；另一个1.5ml 无菌无酶的离心管中，装有500ul血样的真空管和500ul PBS（磷酸盐缓冲液），1：1混匀的混合物，共1ml。
然后缓慢把混匀的血样PBS混合液加入到有淋巴细胞分离液的管1中，注意要缓慢，使血样尽量位于提取液上层，不能太用力让血细胞扩散到下层，就没办法离心分层了。
（这一步的操作应该尽量快速的完成，因为时间长了，红细胞就会在重力作用下沉降，混入到提取液中，对后面的离心造成影响）然后离心。
1500rpm,15min,20摄氏度。
说明：
1、从采集血样到开始实验的时间最好不超过4小时。
实验过程中一直保持室温条件，一般20摄氏度比较适中，因为细胞的最适温度是体温37摄氏度，但是温度降低又可以降低细胞的代谢，两者有些矛盾，所以取中间温度比较理想。
2、关于淋巴细胞分离液的注意事项：启封后应置4℃保存避免微生物的污染；分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室温时，摇匀后使用；整个分离过程中，温度应控制在18-28℃且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量；未启封前在18-25℃避光保存，启封后置4℃保存，本品为真空包装，未启封前置于10℃以下易出现白色结晶，影响分离效果。
（各种淋巴细胞分离液的保存温度不完全一致）
淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂，为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液，主要成分是葡聚糖与泛影酸葡甲胺。
适用于人淋巴细胞和大多数哺乳动物细胞的分离纯化，能除去红细胞和死细胞碎片，所获得的PBMC可进一步用于原代培养或流式细胞分析。
最常用的细胞分离液有Ficoll和Percoll。
3、转数为1500rpm，时间范围为15分钟，温度为室温20摄氏度。
推荐两步离心法：首先用1500rpm/min 离心15min，如果白膜层足够一步就结束，如果发觉细胞不够，说明该病人的淋巴细胞比重较低，再重新用1500rpm /min离心15min。
三、离心后，分四层。
淋巴细胞位于第二层（从上到下），呈白蒙蒙的一薄层。
用移液器（200ul档）吸取分离液层中的淋巴细胞，这里技巧性比较强，需要多次练习才能比较熟练的把淋巴细胞吸的比较完全，大约可得到400ul的液体。
把吸取的淋巴细胞溶液装入另一无菌离心管中。
加入1mlPBS缓冲液到离心管中，1500r,15min，20摄氏度。
把离心后的上层液体倒掉，重复离心步骤至液体无明显红色（即红细胞数量很少），淋巴细胞位于离心管底的一小点白色的物质，一般会混有少量红细胞，尽量避免。
说明：
1、洗涤后离心的条件，通常用1500rpm就足够了，太高了容易把细胞离死。
时间为15min，温度还是室温20摄氏度。
2、离心后，看到淋巴细胞中混有少量红细胞，在这个实验中问题不大。
3、洗涤液的选择也是平衡盐溶液即可，作用主要是去除淋巴细胞中的血浆蛋白和血小板，红细胞很难去掉。
一般洗涤液PBS用3ml即可。
四、用Trizol reagent 裂解淋巴细胞，提取RNA。
在离心管中加入1ml Trizol试剂，可以裂解除RNA 以外的其他大分子物质，细胞膜，细胞器等。
这个东西有致癌、致畸性，要带口罩，小心操作。
用加液枪吹打离心管底部的淋巴细胞团块，把其打散。
一般至少吹打30-60次，主要目的是把其打散，让Trizol
试剂充分裂解淋巴细胞。
把吹打之后的液体转移到冻存管中，标记，浸泡进液氮（这一步的目的是快速冻存mRNA），一到两小时以后，转存在 -80摄氏度冰箱中。
五、外送
说明：
1、TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。
它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
2、在TRIZOL中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。
而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。
玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。
塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
当TRIZOL用量少于2-ml时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管。
3、最后用于装裂解细胞的冻存管请购买无菌无酶的冻存管。
BioTNT 相关产品：
1、淋巴细胞分离液，200ml，130元；
2、10×PBS, 250ml，BioTNT，60元；
3、Trizol，100ml，invitrogen，1600元；（BioTNT提供分装产品，400元/20ml）
4、1.5ml冻存管，无色可立，已灭菌，有盖，Axygen，100支/包，135
5、无菌RNase-free eppendorf管(1.5ml)，Axygen，1000支/包，91。