细胞工程复习

细胞工程复习资料

第一章绪论

一、细胞工程的定义及主要研究内容和领域

细胞工程：是指应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平活细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获得新型生物或特种细胞产品的一门综合性科学技术。

1.以细胞或其组成部分或其构成的组织和器官为操作对象，包括染色体、细胞核、原生质体、细胞、受精卵、胚胎、组织或器官等，还包括了一个例外——转基因动物，它采用了基因工程技术和细胞工程技术，但由于侧重于转基因后对象的培养技术方法上，因此属于细胞工程研究对象。

2. 与基因工程技术密切相结合，但侧重点为培养技术和融合技术等，而不是基因操作技术。

研究内容：

1. 技术范围：动植物细胞与组织培养技术；细胞融合技术；细胞拆合技术；染色体导入技术；胚胎和细胞核移植技术；细胞遗传工程。

2. 研究水平：组织水平；细胞水平；细胞器水平；基因水平。

3. 研究对象：微生物细胞工程；植物细胞工程；动物细胞工程。

主要研究领域：

动植物细胞与组织培养，细胞融合，染色体工程，胚胎工程，细胞遗传工程。

二、细胞工程的重要应用

1.植物细胞和原生质体培养技术可用于:1.农业育种

2.各类植物的离体快速繁殖

3.培养无毒苗

4.长期贮存种子

5.生产次生代谢产物等

2. 动物细胞和组织培养技术可用于:1.细胞产品如活性代谢产物的生产及单克隆抗体（McAb）、疫苗、生长因子等多肽和蛋白质类药物的生产；2.组织和器官培养方面以胚胎干细胞的培养与人工诱导分化最具价值，如器官移植及干细胞法治疗糖尿病等临床应用。

3.细胞融合（cell fusion）：1.动物细胞融合用于单克隆抗体生产2. 利用原生质体融合和培养技术培育新植物3.微生物原生质体融合构建新菌株。（细胞融合是20世纪60年代发展起来的一项细胞工程技术是指两种异源（种、属间）细胞在离体条件下相互接触，从而发生膜融合胞质融合和核融合并形成杂种细胞。它区别于精子和卵子的有性融合过程又称为体细胞杂交。意义：体细胞杂交可以避开生殖细胞受精过程，避免亲缘关系较远的物种间杂交表现出的杂交不亲合或不能受精或胚胎早期败育等状况，从而在亲缘关系更远的物种间实现基因转移，在作物育种和种质创新上有独到的意义和作用.）

4.胚胎工程又叫做发育工程：1. 发挥优良母畜的繁殖潜力，促进家畜改良速度2.保存遗传资源 3. 试管婴儿培育

5.染色体工程：1.多倍体育种（动、植物）：新型农业食品资源、高品质树木培育及水产养殖2. 单倍体育种（植物）：获得纯合二倍体的有效途径 3. 雌、雄核发育：生产单性种群及产生同源型二倍体。（染色体工程是人们按照一定设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体，从而达到定向改变遗传性状和选育新品种的一种技术。广义上讲还应包括染色体内部的部分遗传操作技术，因此也称为染色体操作。意义：染色体工程是基因定位和染色体转移等一些基础研究的有效手段；染色体数目的改变对于动物新品种培育以及植物遗传育种的意义重大，通过人工诱导多倍体和单倍体的生成可以培育出更易适应环境更具优良性状的新品种）

6.细胞遗传工程主要包括克隆和转基因技术。意义和应用：1检验动物细胞全能性2加速动物繁殖、优良育种和保护珍贵动物3. 医药领域

三、细胞工程与其他生物工程的关系

1. 医学

2. 农牧渔业

3. 化工

4. 环境保护

5. 能源（见课本12——16页）

第二章实验室及实验基本操作

一、植物细胞工程实验室的基本组成及设备配置

（一）基本实验室

1准备室准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。

2 接种室接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。为了保持清洁，接种室应防止空气对流。

3 培养室培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。

（二）辅助实验室

1 理化分析室在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。

2 摄影室及暗室其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。

3 细胞学实验室其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。

（一）基本设备配置

1 常规设备：电子天平酸度计纯水器

2 灭菌设备：电热干燥箱大容量高压灭菌器全自动手提式灭菌器Zeiss滤器

3 无菌操作设备：超净工作台

4 培养设备：高效培养架

（二）细胞学研究设备：流式细胞仪倒置显微镜

植物组织培养复合配方培养基基本成分及其作用。

二、植物组织培养复合配方培养基基本成分及其作用

水无机盐（大量元素微量元素）有机成分生长调节物质（激素）其他（琼脂活性炭）

无机盐：

大量元素大量元素使用量一般每升几十至几千毫克。大量元素包括C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。微量元素微量元素的用量一般低于10-5～10-7mol/L。植物所需微量元素有Fe、Cu、Zn、B、Mo、Mn、Co。

例如：N是各种氨基酸、维生素等的重要组成成分，Ca是细胞壁的成分之一，铁锌钼是某些酶的组成成分。如果无机元素供应不足，组织培养材料就会出现一定的缺素症，如：植珠失绿、细胞分裂停止、细胞分化受阻等。

有机物质：作用是促进培养壁报生长和分化所必需的有机碳、氮等营养物质。

糖维生素肌醇腺嘌呤氨基酸其它复合成分

肌醇又称环己六醇，广泛分布在动物和植物体内。最早从心肌和肝脏中分离得到。环己六醇在自然界存在有多个顺反异构体，但有价值的、天然存在的异构体为顺-1 ，2 ，3 ，5-反-4，6-环己六醇即肌肉肌醇，结构式如右，是磷脂的一种－磷脂酰肌醇的组成成分。在糖类的相互转化、维生素和激素的利用等方面具有重要的促进作用。

酰嘌呤的作用首先是skoog和Tsui于1948年发现的，他们在实验室中观察到，使用酰嘌呤能够刺激烟草茎段不定芽的发生。以后的研究表明，酰嘌呤是合成各种细胞分裂素的前体物质之一。外源添加酰嘌呤具有促进细胞自身合成细胞分裂素的功能，有利于细胞的分裂和分化，促进芽的形成和生长。

氨基酸是蛋白质组成成分。常用氨基酸为甘氨酸及多种氨基酸的混合物，如水解酪蛋白，水解乳蛋白等。天然复合物：大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用。由于成分复杂，实验可重复性差，应尽量不用或少用。但有时大胆启用此类物质可能起到意想不到的效果。常用的有：CH（水解酪蛋白）、CM（椰子汁）、ME（麦芽浸提物）、YE（酵母浸提物）、TJ（番茄汁）、香蕉、马铃薯等。

植物激素：生长素细胞分裂素其他

植物激素，是植物新陈代谢中产生的天然化合物，能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许多的生理生化活动，在培养基的各成分中，植物生长调节物是关键物质，对植物组织培养起着决定性作用，它的运用也是植物细胞工程研究的重要的基本方法。

生长素：能促进细胞伸长生长和分裂、诱导愈伤组织形成、促进生根，与一定量的细胞分裂素配合使用可诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长、胚状体的产生等。

细胞分裂素：促进细胞伸长生长和分裂、诱导愈伤组织或器官分化不定芽、解除顶端优势而促进侧芽增殖、抑制离体组织或器官衰老等。

赤霉素类：（GA3）促进诱导形成的不定胚正常发育成小植株。

脱落酸（ABA）：抑制蛋白质合成，抵消和抑制生长素、细胞分裂素和GA发挥作用。ABA诱导休眠，促进衰老和脱落。

琼脂：不提供任何营养成分，是培养材料良好的支持物，并且具有吸附能力，吸附细胞代谢中的一些废物。

三、植物组织培养工作中各种常用消毒灭菌方法。

1 培养基湿热灭菌，即高压蒸汽灭菌或过滤灭菌。

2 玻璃器皿湿热灭菌或干热灭菌，即在烘箱中加热至160℃～180℃40min，或120℃2h。

3 金属用具干热灭菌或浸泡于70﹪酒精后火焰灼烧。

4 操作环境接种室常采用定期熏蒸，熏蒸剂常采用甲醛加高锰酸钾，一般每100ml甲醛加5g高锰酸钾。

第三章植物细胞工程的理论基础

一细胞全能性及其表达

细胞全能性概述：

一个生活细胞所具有的产生完整生物个体的潜在能力称之为细胞的全能性。

正确理解细胞全能性的绝对性与相对性：

不是所有基因型的所有细胞在任何条件下都具有良好的培养反应; 即使对于植物细胞，细胞全能性也并不能意味着任何细胞均可以直接产生植物个体;动、植物细胞全能性的表现程度存在明显差异。

植物细胞按照分裂能力分为三类：

第一类是始终保持分裂能力，从一个周期进入另一个周期的周期细胞。如茎尖、根尖及形成层细胞；第二类是永久失去分裂能力的细胞，即为终端分化细胞。如筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞；第三类是在通常情况下不分裂，但在受到外界刺激后可重新启动分裂的G0细胞。如表皮细胞及各种薄壁细胞。

一个植物细胞向分生状态回复过程所能进行的程度，取决于它已有的分化程度。

根据细胞类型不同从强到弱为：营养生长中心> 形成层> 薄壁细胞> 厚壁细胞(木质化细胞) > 特化细胞(筛管、导管细胞)；

根据细胞所处的组织不同从强到弱为：顶端分生组织> 居间分生组织> 侧生分生组织> 薄壁组织(基本组织) > 厚角组织> 输导组织> 厚壁组织。

细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的，

多数情况下，脱分化是细胞全能性表达的前题，再分化是细胞全能性表达的最终体现。

2、细胞脱分化

培养条件下，使一个已分化细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化。

（1）离体培养下，脱分化过程发生在第一次有丝分裂之前。（2）静止细胞启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要标志。细胞脱分化过程中生理与结构变化：根据细胞脱分化过程中细胞结构发生变化的时空顺序，细胞的脱分化过程可分为3个阶段：第一阶段为启动阶段，表现为细胞质增生，开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白体出现；第二阶段为演变阶段，此时，细胞核开始向中央移动，质体演变成原质体；第三阶段为脱分化终结期，细胞回复到分生细胞状态，细胞分裂即将开始。

细胞脱分化过程涉及到众多相关基因的表达，染色体的解凝聚则有利于这些基因转录。

细胞脱分化与愈伤组织形成：

细胞脱分化是细胞状态的改变，成功的脱分化必然会导致细胞分裂。愈伤组织的形成是脱分化的细胞重新进入活跃分裂的结果，但不是脱分化的过程。于单个细胞而言，分化细胞启动分裂显然发生在细胞完全脱分化之后;在一个细胞群体培养或组织器官培养体系中，有时很难区分细胞脱分化与进入增殖状态的界限。有些外植体的细胞脱分化以后直接形成胚性细胞进而形成体细胞胚；有些外植体某些部位的细胞在重新分裂后直接形成分生细胞团进而形成器官原基。

愈伤组织（callus）指外植体在人工培养基上诱导产生的无序生长的薄壁细胞团。

3、细胞再分化

细胞分化（Differentiation），是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或是潜在发育方式改变的过程。

离体条件下，细胞脱分化以后，无序生长的细胞及其愈伤组织要重新进入有序生长进而才能再生个体，通常把离体培养下的这一过程称为再分化（redifferentiation）。

分化也可以说是相同基因型的细胞由于基因选择性表达所反应的各种不同的表现型。

正确理解细胞细胞分化的本质：

极性与细胞分化

极性（polarity）是植物细胞分化中的一个基本现象。指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构及生理生化上的梯度差异。

细胞脱分化和再分化是离体培养过程中细胞全能性表现的基本过程，了解这一过程的调控机理，最终是为再生个体奠定基础。

生物个体形成是通过形态发生（morphogenesis）实现的，建立在离体培养基础上的形态发生称之为体细胞形态发生（somatic morphogenesis）。

二形态发生

1、器官发生

植物的离体器官发生是指培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。

不定根、不定芽是指在一些非正常发生部位形成的根或芽，离体培养中通常是指从愈伤组织上发生的根或芽。

在自然界，有很多器官发生这样的现象。比如马铃薯的块茎生芽，许多植物的无性繁殖如扦插、嫁接等，均属于器官发生的方式器官发生方式。

器官发生方式

根据起始材料，器官发生方式可分1.先芽后根2.先根后芽3.芽根同步发生（99.9%不成活）

器官发生过程：

（1）经过愈伤组织的器官发生（2）不经过愈伤组织的器官发生

经过愈伤组织的器官发生：

愈伤组织形成→生长中心形成→器官原基及器官形成

不经过愈伤组织的器官发生：

在有些情况下，外植体不经过典型的愈伤组织即可形成器官原基，这一途径有两种情况：

一是外植体中已存在器官原基，进一步培养即形成相应组织器官进而再生植株，如茎尖、根尖分生组织培养。另一种情况是外植体某些部位的细胞在重新分裂后，直接形成分生细胞团，然后由分生细胞团形成器官原基。

这种不经过愈伤组织直接发生器官的途径在以品种繁殖为目的的离体培养中具有重要的实践意义！因为往往通过愈伤组织进行器官分化会发生体细胞变异。

影响因子——起始材料对器官分化的影响

（1）母体植物的遗传基础

（2）外植体的类型及生理状态

不同种属的植物培养效果有较大差异。总体上，被子植物比裸子植物容易培养，被子植物中以茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科及十字花科植物培养成功的报道最多。

同种植物不同品种（基因型）间的培养效果也有较大差异已是不争事实，基因型对于器官分化能力的差异大于愈伤组织诱导的差异。

通常情况下，自然繁殖以无性繁殖为主的植物在培养条件下也有较强的器官分化的能力。

来源于生长活跃或生长潜力大的组织、器官的细胞更有利于培养。

对多年生植物而言，以幼嫩组织为材料无论是诱导还是分化均较容易。

有性繁殖植物在通常情况下以胚或幼嫩果实为外植体较好；一、二年生无性繁殖植物的取材可塑性较大，但仍以自然繁殖器官为外植体易成功。

影响因子——激素对器官发生的影响

离体培养下的器官分化，大多数情况下是通过外源提供适宜植物激素实现。生长素、细胞分裂素、GA3等。离体培养中，外源激素在细胞内的吸收和代谢影响到激素的活性从而影响其培养效果。

生长素/细胞分裂素高有利于根分化

生长素/细胞分裂素低有利于芽分化

生长素与细胞分裂素必须协调使用才能再生正常个体

影响因子——光照对器官分化的影响

光照是离体培养中较复杂的调节因子，光照时间、强度及光质对器官分化均有影响。

离体培养中光照的控制一般是分阶段进行的。诱导培养中通常不给光照或只提供弱的散射光，进入分化阶段后则给予较强的光照。

光照对器官发生的调节可能与其对培养物内源激素平衡的调节有关。

2、体细胞胚胎发生

离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物（不管培养的细胞是体细胞还是生殖细胞），统称为体细胞胚或者胚状体。

其一，体细胞胚是离体培养产物，只限于离体培养范围使用；其二，体细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚；其三，体细胞经过了胚胎发育过程，以区别与离体培中器官发生形成个体的途径。

无融合生殖是无性胚或无性种子的生殖，是不经过雌、雄性细胞融合直接由营养体细胞或未进行减数分裂的大孢子母细胞发育成的无性胚或无性种子，这种无性胚或无性种子具有保持杂合性的特点，因而能够固定杂种优势。这样，把不经过两性细胞融合，仅用无性胚或无性种子繁殖后代的过程称为无融合生殖体细胞胚的形成：

直接途径：体细胞胚从外植体上直接发生：1.诱导阶段 2. 胚胎发育阶段

间接途径：1.经过愈伤组织的体细胞胚形成 2.经过悬浮细胞的体细胞胚形成

体细胞胚的发育与结构特点

结构特点

与器官发生形成个体的途径相比，体细胞胚发育再生植株有两个明显的特点：

一是体细胞胚具有双极性；二是体细胞胚形成后与母体的维管束系统连系较少，即出现所谓的生理隔离现象。

与合子胚比较，体细胞胚在形态结构和生理特性上的特点：

合子胚在胚胎发育完全进入子叶期胚以后，经过一系列的物质积累和脱水就进入休眠，而体细胞胚则直接形成植株，在不同的培养条件和植株种类中，形成植株的胚胎时期有所不同，一般在心形期后的各个阶段均可直接发育成小植株。与相同植物比较体细胞胚的体积明显小于合子胚，在一些贮藏物质的含量上也存在较大差异。并且，体细胞胚不能有明显的脱水干燥过程。合子胚的子叶是相当规范的，可以作为分类的依据，体细胞胚的子叶常不规范。

合子胚在发育初期具有明显的胚柄，而体细胞胚一般没有真正的胚柄只有类似胚柄的结构。

影响体细胞胚发生的因素

激素的调控作用培养基及培养条件的影响基因型的影响

激素的调控作用生长素对体细胞发生具有重要的调控作用,2,4-D是应用最为广泛的生长素，在体细胞胚形成过程中使用浓度具有一定规律；细胞分裂素对体细胞胚发育的影响报道较少，使用浓度一般低于生长素。

第四章植物组织器官培养技术

一植物脱毒与离体无性繁殖技术

意义

1、能够有效地保持优良品种特性；

2、快速繁殖新品种；

3、生产无病毒种苗，防治品种退化；

4、节约耕地，提高农产品商品产出率；

5、便于运输

应用范围：

1.自然无性繁殖极易感染病毒的植物，如马铃薯、甘薯、甘蔗、香蕉、石竹和百合等。

2.有性繁殖变异范围过大而自然条件下又不易无性繁殖的植物如非洲菊、花竹和紫罗兰等。

3.某些难以繁殖或繁殖系数很低的植物，某些需要加速繁殖的特殊基因型如名贵花卉、优良资源、果树芽变体和转基因植物等。

植物茎尖脱毒

茎尖脱毒：病毒在植物体内分布是不均一的，越接近生长点约（0.1-1mm区域），病毒浓度越稀，因此有可能采用小的茎尖离体培养而脱除植物病毒。

1、基本原理

（1）茎尖脱毒是控制植物病毒的有效途径：药物防治病毒效率低，抗病毒育种步履艰难，组织培养的高效隔离防止了病毒的再侵染。（2）脱毒－保持种性－快繁已是一个系统技术，在许多无性繁殖作物的种苗生产上均形成了自己的体系。（3）病毒在植物体内的分布具有不均匀性（4）关于植物分生组织种不带或很少带有病毒的假说：能量竞争传导抑制激素抑制酶缺乏抑制因子

2、基本技术规程

（1）被脱毒植物携带病毒的诊断（2）母体材料的选择和预处理（3）茎尖分生组织培养再生植株（4）脱毒效果检测（5）脱毒苗的保存与繁殖

3、脱毒效果的影响因素

母体材料病毒侵染的程度; 外植体的生理状态; 起始培养的茎尖大小。

离体无性繁殖：是在人工控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖的技术。跟常规繁殖方法相比，它是一种微型且快速的操作过程，因此，有时也称之为微繁、快速繁殖。

植物离体无性繁殖的增殖方式：

芽增殖不定芽增殖体细胞胚增殖愈伤组织增殖原球茎增殖

特点：

芽增值：（1）培养方法简单，能高度保持遗传稳定性，能长期继代繁殖（2）这一繁殖方式一般不需添加外源激素。如果某些植物需要使用激素，一定要严格控制浓度，以防止产生愈伤组织。

不定芽增殖：从现存的芽以外的任何器官和组织上通过器官发生重新形成的芽称为不定芽，特点：（1）

繁殖系数高（2）遗传稳定性较好（3）继代次数有限

体细胞胚增殖：（1）增长率高，胚的双极性免去了生根环节，但胚状体休眠的诱导和解除还难以把握，其成苗率还不高。（2）目前除一些特殊用途外（人工种子），这一技术途径还没有用于植物的快速繁殖。

愈伤组织增殖：成功率高，繁殖系数大，但遗传稳定性较差。对要求遗传稳定性高的作物品种，一般不采用这一途径快繁。

原球茎增殖：细胞或组织培养经原球茎途径分化成植株。大部分的兰花属于这一类型，即兰花的各个部分的离体组织都能诱导形成原球茎，再经培养分化形成植株。原球茎是兰花种子萌发时产生的呈珠粒状、缩短的、类似嫩茎的器官，是兰科植物在诱导时分化出的原初植物形态，具有完整植株的器官雏形，成苗容易。

二花药与花粉培养

概念：

花粉与花药培养是指离体培养花粉和花药，使小孢子改变原有的配子体发育途径，转向孢子体发育途径，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株，并从中鉴定出单倍体植株并使之二倍化的细胞工程技术。

花药培养指把发育到一定阶段的花药接种在人工培养基上，使其发育和分化成为植株的过程。

花粉培养即小孢子培养, 是从花药中分离出花粉粒使之成为分散的或游离的状态，通过培养使花粉粒脱分化进而发育成完整植株的过程。

花药培养属于器官培养范畴；花粉培养也称为小孢子培养,属于细胞培养类型。

一定条件下，花药培养与小孢子培养可以得到再生植株。这样的植株只含有一套染色体，数目和配子体相同，因而是单倍体植株。

单倍体植株经过染色体加倍就成为加倍单倍体植株（DH植株）或称纯合二倍体。

单倍体植物与其二倍体相比较，有三个明显特点：

1.体细胞染色体数减半

2.生长发育弱，体形小，各种器官明显减小

3.雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代

纯合二倍体不仅育性可以恢复且在遗传上是纯合的。加倍单倍体育种（DH育种）技术在植物遗传育种上的价值体现在：

1.加快常规育种速度

常规育种，杂种F2代开始分离，继续自交，通过不断选择和淘汰，一般需到F5～F6代才能得到纯合后代。花药、花粉培养可得到单倍体植株，染色体加倍后即获得纯合二倍体。从杂交到获得纯合株系，只需二个世代。因此，可以缩短育种年限3～4个世代。

2.提高常规育种选择效率

在常规杂交后代中，存在显、隐性的干扰从而影响选择的准确性和效果，在加倍单倍体的后代中只有一种基因型和表现型，不存在显性性状掩盖隐性性状的问题，不良性状在当代即可表现出来，便于淘汰。因此，利用花药培养的单倍体育种技术可提高选择效率。

单倍体途径的应用潜力：－迅速获得纯合型材料，缩短育种年限，提高选择效率－获得育种中间材料－与诱变育种相结合可以提高诱变频率－与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义－作为遗传工程受体更为有效－用作基础遗传研究的各个领域

单倍体植株形成途径：－通过胚状体形成单倍体植株－通过愈伤组织形成单倍体植株

三植物胚胎培养

根据培养中所取外植体部位及取材时期不同，植物胚胎培养包括：胚培养、胚乳培养、胚珠培养以及子房培养。胚珠和子房培养由于取材时期不同，包括受精以后的胚珠子房培养、和未受精胚珠子房培养。植物胚培养的类型、意义

胚培养的类型

1.－成熟胚培养：成熟胚一般指子叶期后至发育完全的胚。培养较易成功，在含有大量元素和糖的培养基上能正常生长成幼苗。

2.－幼胚培养：幼胚是指子叶期以前的幼小胚，由于幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值。因此，其研究和应用越来越深入和广泛。

胚培养在实践中的意义

1.克服杂交育种中杂种胚的早期夭折

2.克服珠心胚干扰，提高育种效率

3. 理论研究领域的应用

幼胚离体培养的生长发育方式：

1. 胚性发育：幼胚接种到培养基上以后，仍然按照在活体内发育方式发育，最后形成成熟胚(有时甚至可能类似种子)，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株，这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将成为一个植株。

2. 早熟萌发：幼胚接种后，离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称之为早熟萌发（未经完成正常的胚胎发育过程而形成幼苗的现象叫早熟萌发）。

3. 愈伤组织：在许多情况下，幼胚在离体培养中首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。

植物胚胎培养：是指使胚或者具胚器官（如子房、胚珠等）在离体条件下发育成幼苗的技术。广义胚胎培养研究还包括胚乳培养和试管受精等技术。

看护培养：用一块愈伤组织或植物离体培养组织看护单细胞使其生长繁殖的一种单细胞培养方法。指用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞,并使其生长和增殖的方法.这个愈伤组织块称为看护愈伤组织。倍性育种

小结：植物脱毒快繁是无性繁殖植物种苗生产的最有效技术

植物花药和花粉培养是创造单倍体的有效途径

植物幼胚培养能够克服杂交育种中杂种胚的早期败育；被子植物胚乳培养可获得三倍体

外植体选择是植物组织培养的基本环节，需根据不同培养目的确定取材原则

培养物增殖方式和植株再生途径直接影响遗传稳定性，应根据培养类型和目的慎重选择

第五章植物细胞培养及次生代谢产物生产

植物细胞培养指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其增殖的技术。

根据培养规模不同----小规模培养、大批量培养

根据培养方式不同----悬浮培养、平板培养、看护培养等

根据培养的目的不同----用于诱变或用于生产次生产物的细胞培养

一悬浮培养

细胞悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。

1. 在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交换，细胞状态可以保持一致

2.有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动研究

3.为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础

以愈伤组织为起始细胞的悬浮培养技术其过程：

愈伤组织诱导→悬浮系的建立与继代培养→细胞生长状态的调控

（一）愈伤组织诱导：要求松散型好、增殖快、再生能力强。外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。1. 选择适宜的植物外植体材料：研究表明，胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体；2. 选择适宜的培养基：较高浓度激素如2,4-D，必要的附加物质如CH等；3. 愈伤组织培养：进行必要的选择和继代。

（二）悬浮细胞系的建立与继代培养：一个成功的细胞悬浮培养体系应当满足3个基本条件：1. 悬浮培养物分散性良好,细胞团较小，一般30～50个细胞以下 2. 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同 3. 生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天便可增加1倍

（三）细胞生长状态的调控：影响悬浮细胞生长的因素：1. 起始愈伤组织的质量 2. 接种细胞密度 3. 培养条件

悬浮培养细胞的同步化：

细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。

饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期；在培养基中加入所缺乏的成分或者将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时细胞分裂又可重新恢复。

抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后即可获得处于同一细胞周期－G1期的同步化细胞。

分选法：是通过细胞体积大小分级，直接将处于相同细胞周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中，则可能保持相同培养体系中的细胞具有较好一致性。

低温处理：冷处理也可以提高培养体系中细胞同步化的程度。Okamura等曾采用此途径使胡萝卜悬浮细胞较好的同步化，而梅兴国等采用6℃低温处理红豆杉细胞也获得较明显的同步化效果。

二单细胞培养

（一）平板培养：是指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。平板培养基上所得到的细胞团是由一个单细胞增殖而来，是优良单细胞株筛选的常用方法。

1单细胞的分离：可采用酶分离法

2单细胞悬浮液的制备：过滤后的细胞经培养基洗涤2次后再调整密度为5x105个/mL左右

3植板：将1份已调整好密度的单细胞悬液与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀的平铺于培养皿中，其厚度约为5mm左右。

（二）看护培养：固体培养基上置入一块活跃生长的愈伤组织；在愈伤组织上放一小片滤纸，待滤纸湿润后将细胞接种于滤纸上；当培养细胞长出小细胞团后将其直接转至琼脂培养基上让其迅速生长。

（三）微室培养：指人工制造一个小室并将单细胞培养在小室少量的培养基中，使其生长增殖的方法。它实际上是一种微量细胞培养技术，主要目的是进行单细胞活体连续观察。

（四）双层滤纸植板培养：Horsch等（1980）将平板培养与饲养层培养技术相结合建立了双层滤纸植板培养方法。

三细胞规模化培养

规模化细胞培养是生产植物次生产物的理想途径：

1. 保护生态环境

2. 提高生产效率

3. 发展新型生物技术产业

植物细胞大规模培养的技术要求：从工程的角度讲必须要进一步研究和开发适宜于植物细胞生长和生产的生物反应器，建立最佳的控制和调节系统。从培养技术方面讲必须满足以下三个条件：1、培养的细胞在遗传上是稳定的，以得到产量恒定的产物；2、细胞生长及产物合成的速度快，在较短时间内能得到较高产量的终产物；3、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能够释放到培养基中。

（二）植物细胞规模化培养体系的建立

种子细胞的选择种子细胞的增殖与放大培养大规模培养体系的建立

（三）生物反应器类型及特点

所谓生物反应器是指高等生物细胞批量化培养的装置及其相应控制系统

植物细胞培养反应器的设计，既要考虑有利于细胞生长，还要考虑有利于产物积累和分离。总体上讲，适合植物细胞培养的反应器应具有适宜的氧传递、良好的流动性和较低的剪切力。

固定化细胞生物反应器

细胞固定化培养优势：

1、可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径并便于调节；

2、细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，有利于次生产物的合成；

3、可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多初生产物而对细胞代谢的反馈抑制，延长细胞生产周期同时可进行连续生产。

细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类：1、包埋式固定化培养系统: 系统支持物多采用琼脂琼脂糖、海藻酸盐、聚丙烯酰胺等2、附着式固定化培养系统: 支持物多采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料

植物细胞固定化细胞生物反应器：

1 填充床反应器：细胞固定于支持物表面或内部，支持物颗粒堆叠成床，培养基在床层间流动。由于颗粒间的挤压容易造成颗粒破碎使填充床阻塞，同时存在混合不均匀、床内氧传递速率低的缺点。

2 流化床反应器：反应器中利用流质的能量使支持物颗粒处于悬浮状态，混合效果较好。但流体的切变力和颗粒的碰撞场造成破损使细胞外流，同时流体力学的复杂性也使其放大困难。

3 膜反应器：采用具有一定孔径和选择性透性的膜来固定植物细胞相比说具有容易控制、易于放大、产物易分离等优点，但由于膜材料的限制，成本较高。

四培养细胞的次生代谢及产物积累

合成生命活动必需物质的代谢过程称为初生代谢，所生成的物质有糖类、脂类、核酸和蛋白质等，这些产物称为初生代谢产物。利用某些初生代谢产物产生的一类与植物生命活动无直接关系的小分子化合物如甙类、生物碱类、萜类、内酯类、酚类化合物等，它们称为次生代谢产物

培养条件下的植物细胞次生产物积累的特性：

1. 生长偶联型产物合成与细胞生长成正比。如长春花属植物中长春花碱的合成、烟草细胞的烟碱合成，及薯蓣属植物中的薯蓣皂甙的合成等；

2. 中间型产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指数生长期或停止生长产物都不合成。蒽醌类物质合成的植物细胞，托品类生物碱类合成的植物细胞等属于此类型；

3. 非生长偶联型产物合成在细胞生长停止以后。紫草宁的合成属此类。

提高细胞次生产物产量的途径：

1、选择适宜的起始材料：包括适宜的植物种类和取材部位

2、选择适宜的培养基：一般说来，增加培养基的N、P和K浓度能促进细胞生长，而适当增加糖浓度有利于次生产物的合成

3、前体的应用：培养基中加入外源前体物质，可使目的产物产量提高

4、激发子的应用：激发子也称诱导子，是指能够诱导植物细胞中一个反应，并形成细胞特征性自身防御反应的分子；激发子是植物抗病生理过程中诱导植物产生植物抗毒素和引起植物过敏反应的因子，包括侵染植物的微生物及植物细胞内的分子。

5、培养技术的选择：培养技术的选择不仅要考虑细胞生长和产物积累的效率，同时还应考虑技术基础和生产成本。两相培养两步培养等。

第六章原生质体培养和植物体细胞杂交

原生质体的概念:植物原生质体（protoplast）是指除去了细胞壁后的裸露的球形细胞。

原生质体培养的基本原理:

原生质体能进行植物细胞的各种基本生命活动，如蛋白质和核酸合成、光合作用、呼吸作用以及通过质膜的物质交换等，这极有利于探讨许多细胞生理问题。同时，由于原生质体在诱导条件下能发生融合，离体培养条件下可能再生植株。因此原生质体培养研究在理论上和实践上都具有重要意义。

原生质体的制备:

（一）原生质体的分离--酶解法

优点：条件温和，原生质体完整性好，得率高等。

影响因素：供试材料，酶的种类、浓度以及其组合，酶液渗透压，酶解时间和温度，纯化方法。

1、材料的来源

实践证明，幼嫩叶片，萌发种子的下胚轴、子叶以及愈伤组织和悬浮培养物等均是原生质体的良好来源：（1）叶肉细胞是分离原生质体的较好材料，从叶片中可分离出大量的较均匀一致的原生质体。由叶片制备原生质体时，植株的年龄和生长条件十分重要一般选用植株上充分展开的叶片

（2）愈伤组织和悬浮细胞系，由于其生长快速稳定，受环境条件的影响不大容易获得大量高质量的原生质体。细胞系建立时间的长短，继代培养的时间和培养基的成分等都影响原生质体分离的数量和质量。一般选用结构疏松并处于对数生长期的细胞分离原生质体的效果较好。

2、预处理及酶解

酶解法分离原生质体所用酶解溶液各组分的作用：

（1）甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等调节酶液渗透压，使其与所处理细胞的渗透压相似，保证原生质体活力，使用浓度根据植物材料而异，一般在0.2~0.8mol/L。

（2）CaCl2·2H2O，KH2PO4，MES（ 2-氮吗啉乙烷磺酸），葡聚糖硫酸钾

--提高原生质体膜的稳定性。

（3）牛血清蛋白——可防止细胞壁降解过程中对细胞膜和细胞器的破坏。

（4）AgNO3、过氧化物歧化酶(SOD)——减轻酶解时产生的乙烯、氧自由基对细胞膜的损伤。

（二）原生质体的纯化

1、沉降法

2、漂浮法

3、梯度离心法

原生质体的培养

原生质体培养基

1.无机盐大量元素浓度；NO3-与NH4+的比例；Ca2+浓度

2.有机成分维生素、氨基酸、糖及糖醇、酵母提取物、水解酪蛋白

3.激素：生长素先高到低

4.渗透压：培养基渗透压和细胞渗透压等渗

原生质体的培养方法：

（1）液体浅层培养：过程→将原生质体以一定密度悬浮在培养液中，用吸管将原生质体悬浮液转移到培养皿或三角瓶中使成一薄层。膜密封后置于人工培养箱中，静置培养。

（2）固体培养－－琼脂（糖）平板培养或包埋培养：过程→将原生质体悬浮液与35℃的琼脂（糖）培养基等量混合，使琼脂（糖）最终浓度为0.6%左右，迅速并轻轻摇动使原生质体均匀分布，然后转移至培养皿，冷却后原生质体包埋在琼（糖）培养基中，封口后培养。

（3）液体浅层-固体平板双层培养法：过程→在培养皿的底部铺一薄层含琼脂（糖）的固体培养基，再将原生质体悬浮液加于固体培养基表面进行液体浅层培养。

（4）琼脂糖珠培养：过程→将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ul一滴的量滴于直径6cm 的培养皿，待其固化后，向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。

（5）饲养层培养-看护培养、滋养培养：该法又可分为分层培养和混合培养。

分层培养是先制备固体的饲养细胞层，再在其上植板培养层。用x射线照射部分分离的原生质体，照射后将原生质体洗2～3次，包埋于琼脂培养基中，然后铺于培养皿的底层构成饲养细胞层。将欲培养的有活力的原生质体植板于饲养细胞层上面进行培养。

混合培养是将经过x射线照射而失去分裂能力的原生质体与有活力的原生质体相混合，并包埋于琼脂培养基中进行固体平板法培养。

培养条件主要指培养的光照和温度。原生质体培养对培养条件的要求十分严格，且不同来源的原生质体在不同的培养阶段有不同要求。一般来说：--新分离原生质体应在散射光或黑暗中培养，诱导分化阶段再置于光下培养，光强1000～3000lx，光周期每天10～16h--不同的植物原生质体培养对温度的要求不尽相同，一般为25～30℃

愈伤组织形成和植株再生：细胞壁再生细胞分裂愈伤组织形成植株再生

影响原生质体培养的因素：基因型原生质体的来源起始培养密度和培养基

原生质体培养的意义：

1、原生质体融合

原生质体培养成功为开展体细胞杂交奠定了基础，通过不同材料的原生质体融合克服传统育种方法所面临的生殖障碍，创造新的种质材料。

2、筛选突变体

原生质体在培养过程中能够产生体细胞无性系变异，且对外界理化因子更为敏感易诱发突变，可从中选出具有优良性状的变异体，成为农作物改良的重要遗传资源。

3、遗传转化

原生质体容易摄取外源遗传物质，如细胞器、细胞核、细菌、病毒、质粒和各种DNA分子，使其能够作为遗传转化的受体系统。目前，PEG法、电激法、脂质体法、基因枪法等均已用于原生质体转化研究，

获得了大豆等一系列转基因植株。

4、基础研究

原生质体为细胞生物学、发育生物学、细胞生理学、病毒学等学科的基础理论研究提供了理想的实验体系，可用于研究细胞壁再生、细胞膜的结构及离子转运、细胞器的光合作用、呼吸作用等。

体细胞杂交的概念：

体细胞杂交是指两个离体细胞通过一定的诱导技术使质膜接触而融合在一起，随后导致两个细胞核物质融合的技术。植物体细胞杂交则是指除去细胞壁的原生质体融合。

根据融合时细胞的完整程度，原生质体融合可分为两大类：

对称融合——即两个完整的细胞原生质体融合。

非对称融合——利用物理或化学的方法使某亲本的核或细胞质失活后再进行融合

（一）原生质体融合方法：

PEG融合电融合

PEG诱导融合：

1 制备原生质体悬浮液；

2 混合好的原生质体悬浮液中逐滴加入PEG溶液，可在倒置显微镜下观察；

3 将PEG中的原生质体于室温下保温15～20min；

4 待大多数细胞圆球化，再在原生质体悬浮液滴顶部加一滴高钙溶液，静置10～20min；

5 用原生质体培养液洗涤，500r/m离心去除融合液，培养原生质体。

PEG融合的特点：

1.融合成本低，勿需特殊设备

2. 融合子产生的异核率较高

3. 融合过程不受物种限制

4.融合过程繁

琐 5. PEG可能对细胞有毒害

PEG融合的机理：

1.由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键

2.当PEG分子链足够长时，在相邻原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连

3.与膜相连的PEG分子被洗掉后，膜上电荷发生紊乱而重新分配

4.另外，PEG能增加类脂膜的流动性，使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能

电融合诱导法：

1、将已制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室中；

2、微电极型的两个电极的端部同时与两靠近的原生质体膜表面接触，所产生的5～12mA的脉冲电流间断刺激1～5ms，原生质体瞬时发生暂时性的收缩，两层膜之间形成小孔，连接成桥，形成一个个泡囊，最后形成融合体；

3、平行多电极通过1MHz的交流电场发生双向电脉冲，原生质体在电场力作用下极化产生偶极子原生质体紧密排开成串珠状，在直流电脉冲作用下，质膜被击穿，进一步形成融合体。

电融合的基本过程：1 细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；2 膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲后就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。

电融合法的原理交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠

与PEG融合比较起来，电融合有三大优点：

1.不存在对细胞的毒害问题

2. 融合效率高

3. 融合技术操作简便

植物体细胞杂交技术的应用：

1、体细胞杂交合成新物种--体细胞杂交可以避开生殖细胞的受精过程，避免了远缘物种间杂交表现出的受精不亲和或胚胎早期败育现象，实现远缘物种间的基因转移，创造新物种。

2、通过体细胞杂交培育作物新种质和新品种--通过近缘种内或种间的原生质体融合，可以获得稳定的具有双亲两套染色体的体细胞杂种植株，从而将近缘栽培种或野生种的一些有益性状转移到现有栽培种中，从其后代选育出优良新品种（系）。

3、体细胞杂交创造细胞质杂种--与常规的有性杂交过程不同,体细胞杂交不仅包括核基因组，也涉及到双亲细胞质。它不仅可把细胞质基因转移到全新的核背景中，也可使叶绿体基因组与线粒体基因组重新组合。农作物的许多性状如雄性不育性状(CMS)由细胞质控制，这些研究创造了细胞质变异的源泉。

体细胞杂交面临的困难：

1. 许多原生质体再生程序效率低，重复性差，有基因型依赖性

2. 体细胞杂种植株仍限于少数物种

3. 转移期望基因和性状的概率较小

4. 种间杂种植株大多不育

--互补选择法：利用突变细胞系互补进行选择

--如果是细胞质发生融合而细胞核未融合，两个核处在共同的细胞质中，则形成异核体或异核细胞。如果双核异核体的细胞核也发生融合，就会产生真正的杂种细胞。异核体中的两个细胞核，若亲缘关系太远，其中一个核中的染色体会一个个被排除掉，形成不对称杂种；如果整个核完全消失，但细胞质依旧是杂合的，这种融合产物叫胞质杂种。若两个相同原生质体发生融合，则形成同核体。

第七章 胚胎干细胞培养

一、干细胞（stem cells ）是什么

具有无限的或延长的自我更新能力的细胞，能产生至少一种类型的高度分化的细胞

从具有的分化潜能上讲：--专能干细胞 --多能干细胞 --全能干细胞

从组织发生即来源上讲：--胚胎性干细胞 --成体干细胞/组织干细胞

胚胎性干细胞是一类来自早期胚胎、原始生殖细胞等源于胚胎的干细胞，基本特征是有稳定地在体外自我更新、稳定地维持正常核型和发育全能或多能性、能够分化为属于三胚层范畴的各种类型分化细胞，甚至参与个体发育。

--来自早期胚胎：胚胎干细胞（embryonic stem cells, ES ）

--来自胚胎生殖嵴中的原始生殖细胞：胚胎生殖细胞（embryonic germ cells, EG ）

--来自畸胎瘤组织：胚胎性癌细胞（embryonal carcinoma cells, EC ）

成体干细胞（adult stem cells, AS ），也叫作组织干细胞（tissue stem cells ） 是指一群分布在成体组织中处于尚未分化的、具有自我更新并负有构建和补充某种组织的各种类型细胞潜能的干细胞。如骨髓的造血干细胞、间充质干细胞；神经系统的神经干细胞；肝干细胞；骨骼肌干细胞等。

--造血干细胞可分化为血液系统的各种细胞；小肠和皮肤中的干细胞具有分化、补充和更新小肠和皮肤组织的能力。

--骨髓干细胞除了形成各种血细胞和衍生于间质细胞的各类细胞外，还可被诱导分化为神经细胞、肌肉细胞、骨和肝细胞等不同分化细胞。

二、ES/EG 细胞的培养建系技术

1、ES/EG 细胞的来源

(1)发育良好的囊胚，从中分离ICM ，进一步分离培养ES 细胞(2)从胚胎生殖腺中分离出EG 细胞

（3）从畸胎瘤中分离出EC 细胞（4）治疗性克隆即体细胞核转移（SCNT ）途径分离培养ES 细胞

分离囊胚的内细胞群

与成纤维细胞共培养，ES 细胞非分化增殖 分离胚胎生殖腺细胞 胚胎干细胞的鉴定 定向诱导分化 功能细胞

2、ES/EG细胞的分化抑制培养

目前常用的细胞分化抑制物主要有三种:

-- 饲养层细胞(feeder layer)

-- 特殊细胞的条件培养液(conditioned medium),如BRL(Buffalo rat liver )细胞条件培养液

-- 分化抑制因子(differentiation inhibitory factor, DIF ),如白血病抑制因子(leukemia inhitory factor,LIF)

常用的饲养层细胞有下列两种：

（1）MEF细胞(mouse embryonic fibroblast)，取自各种品系小鼠的12dpc胚胎。经剪碎和胰蛋白酶消化，常规分散细胞培养为单层散布的成纤维细胞。

（2）STO细胞，来自SIM小鼠(S)胚胎的对硫代鸟嘌呤(T)和乌本苷(O)有抗性的成纤维细胞系，能分泌干细胞生长因子(stem cell factor,SCF)以及白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)。

无饲养层培养法：饲养层细胞的制备在一定程度上使ES/EG细胞培养显得较繁杂。近来以添加LIF生长因子或某些特定细胞的条件培养液至含FCS的正常培养液，借此替代饲养层细胞：（1）直接在ES细胞基础培养液中加入重组LIF（2）Buffalo大鼠肝细胞条件培养液(BRL-CM)（3）2～3周幼年大鼠心肌细胞条件培养液(RH-CM)

3、ES/EG细胞系的特性和鉴定

（1）形态学特征（2）发育全能性和分化潜能鉴定（3）嵌合体动物

（1）形态学特征：体外培养小鼠ES/EG细胞在抑制分化培养中呈现一个或几个核仁、且核质比高的圆形或卵圆形细胞，彼此均呈单层或多层紧密堆积而形成岛状或巢状群体生长形态，组成克隆的细胞彼此界限不清楚，粘连性强.人ES与EG细胞的形态学特征有所不同，与小鼠ES/EG也有所不同。单层培养时，人体ES细胞呈扁平状群落，且细胞界限清楚。

三、ES/EG细胞的体外诱导分化

1、基本原理

细胞诱导分化是一个细胞与其微环境相互间复杂而又精密协调的分子细胞学过程，是胚胎正常发育过程中重要而基本的现象；

在体胚胎的细胞分化过程中，诱导作用的结果不只是决定于各种诱导物质的性质和专一性，同时也决定于被诱导细胞的反应能力(competence)。后者受遗传、发育潜能等内在因素的限制；

ES细胞是体外研究诱导分化的较理想模型，在体外被诱导分化的途径可能与在体胚胎细胞的不完全相同

2、ES细胞体外诱导分化的基本方法

●单层ES细胞培养和诱导分化：较难分化为单一类型的细胞

●ES细胞拟胚体形成和诱导分化：相对诱导分化细胞类型较

单一,具体方法有：

（1）软琼脂培养

（2）悬滴培养

五、ES/EG培养与诱导分化的意义

哺乳类发育的体外模型

哺乳动物早期胚胎一般体积很小，又在宫内发育，在体内研究胚胎发育和各类细胞分化及其机理几乎不可能；ES细胞具有完整的发育潜能性，而且对所有调节正常发育的信号具有应答能力。虽然ES细胞体外分化途径和机制与在体胚胎不完全相同，但在分子水平有共同或相似之处，是研究特定类型细胞分化、某些前体细胞起源和细胞谱系演变较理想的实验体系；许多国家在法律上禁止以克隆或复制人为目的的前提下，已允许将人ES细胞类似于小鼠ES细胞体外实验一样，用于研究人类胚胎发育、分化和调节信号等事件。

人体的基因和细胞治疗

这里的基因治疗是指用遗传改造过的人体细胞直接移植或输入病人体内，达到控制和治愈疾病为目的的治疗手段，又称细胞治疗。

目前常说的基因治疗技术虽然能把编码正常序列的基因导入突变细胞而使突变基因的功能得到纠正，但导

入基因的整合和表达难以精确控制，特别是基因插入后对其他基因产生的效应尚无法预知。更大问题是，许多被用作基因操作的细胞在体外不易稳定地被转染和增殖传代；

ES细胞是基因治疗的较理想的靶细胞，经遗传操作后一般仍能稳定地在体外增殖传代，克服了目前基因治疗中需要大量靶细胞来源的主要问题。

组织工程的种子细胞来源

人体ES细胞技术学的发生和发展，有望解决目前组织或器官修复中的难题。

第八章动物细胞培养

第一节动物细胞体外培养方法

相关概念

1. 原代培养：从有机体取得材料开始，在培养瓶内培养至第一次传代前的这一过程。

2. 传代培养：待细胞长满瓶底之后，将细胞从一个培养容器转移到另一个培养容器中的培养过程。

3. 外植块：用于开始体外细胞培养而切下的一小块组织或器官。

4. 细胞系：原代细胞经过第一次传代后形成的细胞群体，即具有增殖能力，类型均匀的培养细胞，多为有限细胞系。

初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称为细胞系。如细胞系的生存期有限，称之为有限细胞系；如已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系

5. 细胞株：细胞系经过克隆或其他方法而得的单一类型的细胞群体。

6. 细胞系的转化：细胞发生遗传性改变的一种变化。其性状可以代代相传，能够长期维持和存在。分为一般转化和恶性转化。

7. 根据冻存液在冻结之后是否形成冰晶，低温冷冻保存细胞可分为非玻璃化保存和玻璃化保存两种方法。液体的固化有两种方式：一种是形成尖锐的冰晶，另一种是进入无定形的玻璃化状态。非玻璃化冻存细胞过程中不可避免地会在细胞内和细胞外形成冰晶。玻璃化是指液体转变为非晶态（玻璃态）的固化过程。遗传缺陷细胞：从有先天遗传缺陷者取材培养或用人工方法诱发突变的细胞，都属于遗传缺馅细胞。（一）原代细胞的取材

?取材要注意新鲜和保鲜?应严格无菌?防止机械损伤?去除无用组织和避免干燥

?应注意组织类型、分化程度、年龄等?作好记录

（二）原代细胞的分离和制作

1、悬浮细胞的分离方法采用1000r/min低速离心10分钟，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。

2、实体组织材料的分离方法：

（1）机械分散法方法：剪切法；压挤法。

特点：简便、快速；对组织机械损伤大，细胞分散效果差，适用于处理纤维成分少的软组织。

（2）消化分离法方法：酶消化分离法；非酶消化分离法

程序：剪切、加液漂洗、消化、弃去消化液、漂洗、机械分散。

（三）原代细胞的培养方法

1、组织块培养法

2、酶解培养法

3、悬浮细胞培养法

1、组织块培养法

无菌条件下，从有机体内取出组织，用平衡盐溶液漂洗数次以洗去血污，并剔除多余成分；

剪成约1mm3大小的组织小块；

均匀接种于培养瓶底部，采用薄层培养法或翻转干涸法使组织小块贴壁；

数天后，组织块周围细胞开始向外迁移生长铺展开来，在周围形成一圈单层细胞；

当单层细胞彼此相互接触汇合，铺满整个培养瓶底部即可形成细胞单层，可进行传代。

2、酶解培养法

无菌条件下，从有机体内取出组织，用平衡盐溶液漂洗数次，洗去血污，并剔除多余成份；

剪成约1mm3大小的组织小块；

用胰蛋白酶或胶原酶溶液消化；

将制备成的单细胞悬液接种到培养瓶中培养；

数天后，细胞贴壁生长并铺满培养瓶底部，形成细胞单层。

3、悬浮细胞培养法

●低速离心分离后直接培养

●经淋巴细胞分层液分离后接种培养

（四）原代和传代细胞的培养和维持

原代细胞培养的首次传代注意以下几点：

1.细胞生长密度不高时，不能急于传代

2.原代培养的贴壁细胞需控制消化时间

3.吹打已消化的细胞应减少机械损伤

4.首次传代时细胞接种数量要多一些

5.首次传代培养，小牛血清浓度可加大至15%～20%左右

(五)动物细胞大规模体外培养的方法

1、悬浮培养

2、贴壁培养

3、贴壁-悬浮培养

悬浮培养: 1.适用于一切种类的非贴壁依赖性细胞（悬浮细胞），也适用于兼性贴壁细胞。 2.优点在于操作简便，培养条件较均一，传质和传氧较好，容易扩大培养规模，在培养设备设计和实际操作中可借鉴许多有关细菌发酵的经验。 3. 不足之处是因细胞体积较小较难采用灌流培养，细胞密度一般较低。 4.目前，生产中用于悬浮培养的设备主要是通气搅拌罐式生物反应器和气升式生物反应器。

贴壁培养

1.使用于一切贴壁依赖性细胞，也适用于兼性贴壁细胞。

2.优点在于适用的细胞种类广，较容易采用灌流培养的方式使细胞达到高密度。

3. 不足之处操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够面积，培养条件不易均一，传质和传氧效果差。

贴壁-悬浮培养/假悬浮培养：

（1）微载体培养

1.既可创造大的贴附面积供细胞贴附生长增殖，又由于载体体积小，比重轻，在轻度搅拌下即可携带细胞自由地悬浮在培养基内，充分发挥了悬浮培养的一切优点。

2.20世纪80年代这种方法已被正式用于工业化生产各种疫苗以及其他细胞产品，并出现了一大批商业化的微载体，包括葡聚糖类、聚苯乙烯类和胶原类微载体。

3.理想微载体应有：生物相容性、无毒性、表面惰性、比重适当（1.030～1.045g/ml）、粒径均一（溶胀后在60～250 m之间）、光学透明、柔软、耐高压灭菌、可反复使用、制备简单、原料充足。

4.原理：利用固体小颗粒作为载体，细胞附着之，通过连续搅拌悬浮于培养液中。扩大了细胞的附着面，因而提高了细胞生长效率和产量。微载体是由天然葡萄糖聚合物（葡聚糖）或者各种合成的聚合物组成的。（2）包埋或微囊

包埋或包裹在载体或微囊内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损伤；可以获得较高的细胞密度，一般都在107～108个/ml以上；当控制微囊膜的孔径后，可使产品浓缩在微囊内而有利于下游产物的纯化；可采用多种生物反应器进行大规模培养。

（六）动物细胞生物反应器

1.搅拌罐式生物反应器

2.气升式生物反应器

3.中空纤维式生物反应器

4.透析袋或膜式生物反应器

5.固定床或流化床式生物反应器

第二节体外培养动物细胞的生物学特性

一.体外培养动物细胞的形态和生长特性

离体培养的细胞根据生长方式可分为两类：贴壁依赖型非贴壁依赖型

贴壁型（贴壁依赖型）

1.上皮细胞型

2.成纤维细胞型

3.游走细胞型

4.多形细胞形

悬浮型（非贴壁依赖型）

悬浮在溶液中

兼性贴壁型细胞

兼具上述两种生长方式的细胞，如CHO细胞、小鼠L929细胞

1.贴壁型细胞：这类细胞的生长必须给以可贴附的支持物表面，细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴

附因子可在该表面上生长、增殖。细胞在该表面生长一般形成两种形态即成纤维样细胞型或上皮样细胞型。前者主要来源于中胚层组织的细胞，生长时呈放射状、旋涡状或火焰状走行；后者主要来源于外胚层和内胚层组织的细胞，生长时彼此紧密连接成单层细胞片。

2.悬浮型细胞：这类细胞的生长不依赖支持物表面，可在培养液中呈悬浮状态生长，如血液淋巴细胞和用以生产干扰素的Namalwa细胞等，细胞呈圆形。

3.兼性贴壁型细胞：兼具上述两种生长方式的细胞称为兼性贴壁细胞，如CHO细胞、小鼠L929细胞。当它们贴附在支持物表面上生长时呈上皮或成纤维细胞的形态，而其当悬浮于培养基中生长时则呈圆形，但有时它们可相互支持贴附在一起生长。

二.培养细胞的生长曲线

每代细胞的生长过程：

1）潜伏期2）指数生长期3）稳定期4）衰退期

1）潜伏期细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期，此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。

2）指数生长期这是细胞增殖最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。这个时期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数（Mitotic Index：MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%～0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%～5%

在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3～5天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（Contact Inhibition）。

细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（Density Inhibition），导致细胞分裂停止。

3）稳定期细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入稳定期。此时细胞数量不再增加，也称平台期（Plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH 降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传1～2两代，通过换液淘汰死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。

细胞系的生长过程

1）原代培养期2）传代培养期3）衰退期

1）原代培养期也称初代培养期，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1～4周。

此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂但不旺盛；初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大，多呈二倍体核型，是检测药物很好的实验对象；细胞群是异质的（Heterogeneous），即各细胞的遗传性状互不相同。细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，细胞独立生存性差

2）传代培养期初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（Diploid Cell Line）。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。世界上常用细胞均在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞适宜密度，利于生存，但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。

3）衰退期此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）。标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性

性（Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（Infinite Cell Line），也称连续细胞系（Continuous Cell Line）。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质

三.细胞系的演化

细胞系的演化是指细胞系从原代培养开始直至衰老死亡的整个生命历程，可分为三个阶段：原代培养阶段、有限细胞系阶段和连续细胞系阶段或衰老死亡阶段。

四.细胞系的转化：指细胞在体外培养过程中发生与原代细胞形态、核型、增殖或其他特性的可遗传的变化。它可以是由外源基因的整合而产生，也可以是自然发生的或诱导。

五.体外培养细胞的去分化

去分化的原因可能是因为缺少适当的诱导环境，使细胞不能表达分化特征，加上细胞对环境的不适应而发生了变化。

第九章动物细胞融合和单克隆抗体

单克隆抗体的制备

单克隆抗体技术

通常称B淋巴细胞杂交瘤技术，它是1975年英国学者George Kohler与阿根廷学者Cesar Milstein 成功将经过绵羊红细胞免疫的小鼠脾脏细胞与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞融合在一起，并获得了能产生特异性抗羊红血球单抗的杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体，这种单一类型的、只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。为此他们荣获1984年度的诺贝尔医学及生理学奖。

单抗的制备过程:

1.动物免疫与亲本细胞选择

2.细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备

3.杂交瘤细胞的筛选

4.抗体阳性杂交瘤细胞的筛选

5.抗体阳性杂交瘤细胞株的克隆化培养

6.单克隆抗体的制备和冻存

7.单克隆抗体的纯化

杂交瘤细胞的筛选

1.加HA T培养基，稀释至细胞不超过2×105/ml;

2.将细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔培养板内，每孔0.1ml，若为24孔板，每孔0.5ml；

3.每隔2～3天半量换液，7天后可选择出杂交瘤细胞

也有人使用软琼脂来筛选，将融合的细胞培养在含有选择培养基的软琼脂上，这样长出的集落都是融合了的杂交细胞，但一般筛选到的杂交细胞比较少。

HAT选择系统

HA T是含一定浓度次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）、胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。

杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤细胞或者是胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一；HPRT-细胞的嘌呤核苷酸与TK-细胞的嘧啶核苷酸只能由全合成途径产生。

淋巴细胞具有合成DNA的两条途径。

杂种细胞通过互补作用获得HRPT或TK基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过补救合成途径合成DNA。在HAT培养基中，HPRT-或TK- 亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有杂种细胞存活。

抗体阳性杂交瘤细胞株的克隆化培养

克隆化培养方法有有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、应用流式等。

有限稀释法

通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的：

1）取出阳性孔内的细胞进行计数；2）用培养液将其稀释到如10个细胞/ml；3）于96孔板内每孔加0.1ml，其机率将为每孔落入一个细胞；4）加入一定数量的饲养细胞，经过8~12天后，可以观察到有集落生长的孔；5）根据检测的阳性结果再次进行克隆化培养。

软琼脂培养法

在无菌平皿内铺上一层0.5％的琼脂，待凝固后再铺上一层混有杂交瘤细胞和饲养层细胞的0.25％的软琼脂。待细胞长成集落后，可用毛细管吸出小球样团块，移种于含有饲养细胞的96孔板内，继续培养。

单克隆抗体的改造和应用

1. 单抗作为体内体外诊断试剂在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等

2. 单克隆抗体靶向制剂，治疗癌症等疾病

人源单克隆抗体

迄今构建人淋巴细胞杂交瘤产生人源单克隆抗体的技术远没有鼠类淋巴杂交瘤技术成熟。有三个主要困难：

1. 缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。

2. 获得抗原特异的人B淋巴细胞十分困难，对人来说，高度免疫获得抗原特异的B淋巴细胞的方法显然是不可行的。

3. 大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体较困难，鼠类杂交瘤可以通过小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水达到目的，人杂交瘤细胞在鼠类中诱生腹水是很十分困难的。

方法1：分离人B淋巴细胞，使之与荧光标记的抗原相结合，通过荧光标记选择能够产生特异抗体的B淋巴细胞，并用Epstein－Barr病毒转化，最后得到少量的单抗。

方法2：将人源免疫干细胞导入缺失大部分免疫细胞的小鼠体内，遇到抗原时，产生人源的抗体。

方法3：将改造过的人的抗体基因导入鼠胚胎中，能在免疫后得到产生人抗体的转基因鼠。

基因工程抗体

改造鼠源性单克隆抗体的目的：一是降低免疫原性；二是降低相对分子量，增加组织通透性。如将鼠源性单克隆抗体的C区用人的Ig分子的C区置换则对人的免疫原性消失。对鼠源性抗体的改造有很多成果报道，包括：

1. 人-鼠嵌合抗体（人IgC-小鼠IgV，150000）

2. 改形抗体（将小鼠CDRs替换为人CDRs，150000）

3. Fab(完整L链和Fd，50000）

4. FV（VH和VL，25000）

5. 单链抗体（SCFV，VH-多肽-VL，27000）

6. 单域抗体（VH或VL，12500)及最小识别单位（MRU）

（一个CDR，<2000）

杂交人－鼠单克隆抗体

1. 抗体同抗原结合的功能决定于抗体分子的V区,同种型免疫原性决定于抗体分子的C区。

2. 在基因水平上把鼠源性单抗的VH和VL分离出来分别与人IgCH和CL连接成人－鼠嵌合体H和L链基因，再共转染骨髓瘤细胞，就能表达出完整的人－鼠嵌合抗体。

一、人杂交瘤单克隆抗体

由于小鼠骨髓瘤系的优良性质，在制作人杂交瘤时也曾尝试用小鼠的骨髓瘤来制作人－鼠的种间的异源杂交瘤以获取人单克隆抗体。由于不同种间杂交细胞的特点就是染色体的丢失，人、兔、大鼠的淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合后，容易发生人、兔、大鼠的染色体丢失，因而这种异源杂交瘤的应用有限，但也可用于基因定位等。

二、基因工程抗体

这方面的研究发展十分迅速。

1改造已有的鼠源单克隆抗体，其着眼点大都在于尽量减少抗体中的鼠源成分，但又保留原有的抗原特异性。可分为完整的抗体分子和抗体片段。

2模拟体内系统，在体外构建相应于体内的B细胞库的抗体库，用表达抗体片段的噬菌体克隆来取代B细胞克隆，并同体内的原则一样，用抗原来选择特异的抗体克隆。

3用人的Ig基因组取代小鼠的Ig基因组，建立能产生人源抗体的小鼠。

改造原有的鼠源单克隆抗体

可变区和识别抗原有关，具有特异性；恒定区和效应功能有关（C区与抗体的效应功能相关，可激活补体，介导穿过胎盘和黏膜屏障，结合细胞表面的Fc受体从而介导调理作用、ADCC作用和I型超敏反应）。

A具有完整抗体分子的形式

B抗体片段

C衍生的其它形式

模拟体内的抗体库－噬菌体抗体库

应用基因组工程构建转人Ig基因组小鼠

单链抗体

在大肠杆菌的系统中，可以表达VL－衔接物－VH的序列，产生单链抗体。单链FV片段:抗体分子量小、免疫原性较低，渗透性好，用于实体肿瘤的诊断和治疗。

生物导弹：利用单链抗体序列接上一段药物蛋白的编码序列，表达后的蛋白可根据抗原抗体反应而达到专一性治疗疾病的目的。

双功能抗体片段：两个抗原结合特异性不同的Fab或Fv片段通过二硫键连接起来，如一个结合肿瘤特异性抗原，一个结合杀伤性T细胞，识别和消灭肿瘤细胞的功能可统一在一个单链抗体分子上。

抗体融合蛋白

将抗体的可变区与一非抗体蛋白融合起来，使融合蛋白继承有抗体分子的结合特异性。可以保留不同程度的抗体结合特异性以及激发其他免疫反应的能力。

抗体酶

一种对酶促反应过渡态特异的抗体。结合酶与抗体的优点，既可以起酶促催化作用，又可以起抗体的选择性和专一性结合抗原的作用。

制备抗体酶的方法：

1）利用与过渡态结构相类似的半抗原通过杂交瘤技术生产抗体酶。

2）利用定向催化，即利用抗体的特异性和亲和性使催化反应的两种底物按一定的构象结合并定向，从而降低底物分子的自由度，反应速度加快。

3）对抗体进行化学修饰，使抗体与催化基团相连。