射干合剂2015年版《中华人民共和国药典》微生物检查方法适用性研究
制药用水微生物限度检验方法学确认2015.11
制药⽤⽔微⽣物限度检验⽅法学确认2015.11制药⽤⽔-微⽣物限度检验⽅法学确认⽬录⼀、引⾔1、概述2、验证的⽬的⼆、验证⽅法合格标准三、主要材料确认1、仪器设备确认2、辅助材料确认3、⼈员确认4、商品培养基及灭菌培养基确认5、菌种及菌液的制备四、样品制备1、稀释液2、供试液制备3、操作⽅法五、⽅法验证1、需氧菌总数的计数⽅法验证2、计算菌回收率公式六、验证结果及评价七、再验证周期⼋、验证结论批准⼀、引⾔1、概述：根据《中国药典》2015年版三部通则“1105 ⾮⽆菌产品微⽣物限度检查：微⽣物计数法”（以下简称《药典》）的要求，对内控标准中有“微⽣物限度”检查项的产品进⾏该项验证。
根据《中国药典》2015年版三部纯化⽔进⾏⽅法学确认。
2、验证⽬的：确保药品微⽣物限度检查实验的准确性，在建⽴药品的微⽣物限度检查法时，应进⾏需氧菌总数计数⽅法的验证，以确认所采⽤的⽅法适合于该样品的需氧菌总数的测定。
⼆、验证⽅法合格标准1.前提条件：培养基适⽤性实验应符合规定，即：被检R2A培养基上菌落平均数与对照培养基上菌落平均数⽐值应为0.5~2，且菌落形态⼤⼩应与对照培养基上的菌落⼀致。
2.计数⽅法适⽤性试验：在3次独⽴的平⾏试验中，若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值与菌液对照组的平均菌落数的⽐值）均在0.5～2范围内，照该供试液制备⽅法和计数法测定供试品的需氧菌总数。
三、主要材料确认1、仪器、设备确认检查结果：检查⼈：复核⼈：⽇期：2、辅助材料确认2.1移液器、接种环、酒精灯、记号笔、酒精棉球、试管架、试管、玻璃平⽫、⽌⾎钳等2.2需灭菌物品见《微⽣物限度检查法验证记录》2.3⼀次性⽆菌⽤具见下表检查结果：检查⼈：复核⼈：⽇期：3、⼈员确认化验员经设备操作、微⽣物检验技术和实验室⽣物安全等⽅⾯的培训，考核合格后上岗。
4、商品培养基及灭菌培养基4.1 所⽤培养基均不得有结块、吸潮、异味、颜⾊发⽣改变等现象。
《中国药典》2015年版微生物计数法实例
SDA
试验二：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数 （薄膜过滤法）
试验组
（样+菌）
• 取10g供试品加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，制成1:10的供试液，供试 液分装成7支试管，每支9.9mL，每管加0.1mL的菌液，使试管中含菌量不大于 100cfu/mL，吸取1mL进行薄膜过滤，用500mLpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗， 100mL/次，滤膜贴在相应的培养基上。每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜。
水不溶性非油脂类供试品
• pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或TSB溶解或稀释成1:10供试液。分散力较差的 供试品可在稀释液中加入表面活性剂如0.1%的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。必要时进一步稀释。
油脂类供试品
• 取供试品加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌 性的无菌表面活性剂充分混匀。必要时进一步稀释。
1107 非无菌药品微生物限度标准（3/3）
1107 非无菌药品微生物限度标准----实例
微生物限度标准：需氧菌总数不得过103cfu/g，霉菌和酵母菌总数 不得过102cfu/g，金黄色葡萄球菌不得检出，铜绿假单胞菌不得检 出，大肠埃希菌不得检出，沙门菌不得检出，耐胆盐革兰阴性菌 应小于102cfu/g。
/
/
T/S
0.92
0.91
0.92
1.07
1.08
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应 在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。
实例：霉菌和酵母菌总数计数培养基适用性检查结果（SDA）
菌种
被检培养基菌落数 （T）
中和法联合稀释法在复方苯佐卡因凝胶微生物限度检查中的适用性研究
中和法联合稀释法在复方苯佐卡因凝胶微生物限度检查中的适
用性研究
高爽;高岩
【期刊名称】《中国药品标准》
【年(卷),期】2022(23)3
【摘要】目的:探讨中和法联合稀释法在复方苯佐卡因凝胶微生物限度检查中的适用性。
方法:依据《中国药典》2015年版四部通则,选择不同的试验方法(中和法、中和法加稀释法、常规法),通过比较试验菌的回收比值确定最终方法;复方苯佐卡因凝胶在需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的检测中采用中和法加稀释法,控制菌检测采用中和法;以聚山梨酯和卵磷脂作为中和剂。
结果:中和法加稀释法可对药物杀菌功能产生明显的抑制作用,采用中和剂0.3%卵磷脂和3%聚山梨酯80制备1∶20的供试液,在微生物计数试验中各试验菌的回收比值均在0.5~2.0之间;控制菌检查中,对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌均能有效检出。
结论:中和法加稀释法可用于复方苯佐卡因凝胶的微生物限度检查。
【总页数】4页(P330-333)
【作者】高爽;高岩
【作者单位】盘锦检验检测中心微生物科
【正文语种】中文
【中图分类】R921.2
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新会蛇伤药酒微生物限度检查方法适用性试验
新会蛇伤药酒微生物限度检查方法适用性试验
梁志云;昌水平;林传辉;余香;蒋三元
【期刊名称】《蛇志》
【年(卷),期】2017(029)001
【摘要】目的考察新会蛇伤药酒微生物限度检查方法的适用性.方法按照2015年版《中国药典》四部通则非无菌产品微生物限度检查法进行试验.结果新会蛇伤药酒采用培养基稀释法(0.2 m l/皿)进行需氧菌数的测定,常规法进行霉菌和酵母菌数的测定,金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌采用直接接种法测定,结果均良好,中和剂对其方法均无明显干扰.结论该方法适用于新会蛇伤药酒的微生物限度检查.
【总页数】3页(P4-5,11)
【作者】梁志云;昌水平;林传辉;余香;蒋三元
【作者单位】江门市新会区中医院,广东江门 529100;江门市新会区中医院,广东江门 529100;江门市新会区司前人民医院,广东江门 529159;江门市新会区中医院,广东江门 529100;江门市新会区中医院,广东江门 529100
【正文语种】中文
【中图分类】R927
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微生物限度检查知识指导
精心整理微生物限度检查知识培训1、微生物方法验证，要求菌株回收率≧70%，是否有上限要求？（如不得高于100%或者110%）。
答：没有上限。
但一般不会高于100%，因为加进去的菌量是一样的，如果超过100%可看成是操作上的误差。
按微生物的特性，如果不超过太多，是可以接受的，但没有具体上限。
（本所控制在110%以内）。
2、在微生物方法验证时，霉菌、酵母菌计数验证只用黑曲霉及白色念珠菌做方法学验证，在操作似？答：3答：计数，超过204阴性对照是检查整个检验系统是否被微生物污染，实际上也包括了培养基的无菌性检查。
5、微生物限度检查法中所用的培养基如：营养琼脂、EMB 、Macl 等培养基其分装容器需要预先灭菌吗？答：不用。
只要是洁净的就行，因为分装后还要灭菌。
6、具有抑菌性的供试品，细菌、霉菌、都是用薄膜过滤法来检查的，那么沙门菌可以用常规法来检查吗？就是可以不经过过滤直接接种到营养肉汤中吗？答：这要看你验证的结果。
如果通过验证，你的品种是对沙门菌有抑制作用，且用培养基稀释法不能消除其抑菌性，则就必需考虑用薄膜过滤法。
7、微生物限度检查中，稀释剂对照组，是在稀释液中加入50~100cfu的菌，还是把稀释液制成含量50~100cfu的浓度呢？答：是把稀释液制成含50~100cfu/ml菌的浓度。
（在这里，我对上次讲课时关于稀释剂对照组操作的PPT进行纠正，对于离心薄膜过滤法的稀释剂对照组的操作应该是：含50~100cfu/ml菌的稀释89、10答：11、答：报告书不需要显示第一、第二天的结果，只需报告最终结果。
理由请见第9题答复。
或者是在营养琼脂中加入TTC试剂（每100ml加入0.1%）12、由于微生物检验的特殊性，对于样品的微生物限度检查计数数据是否可登记在表格内（此表格仅含样品名称、批号及检查结果）。
之后再将检测结果移至详细记录中？答：原始记录应该只有1份。
如果你说的详细记录是属于一般记录，是没有必要的，如果是指报告书，就应该没问题。
阿司匹林肠溶片2015年药典微生物限度检查法的建立及方法学验证
阿司匹林肠溶片2015年药典微生物限度检查法的建立及方法学验证发表时间：2018-06-28T11:34:14.657Z 来源：《医药前沿》2018年6月第16期作者：杜春华李东娴和东阳普冰清牛延菲游燕（通讯[导读] 笔者在做试验设计时，做了中和剂组和中和剂对照组，且二者的菌落数比值在0.5～2之间，说明30%碳酸钠稀释剂不影响污染微生物的生长。
（云南省药物研究所云南昆明 650111)【摘要】目的：建立阿司匹林肠溶片微生物限度检查法并进行方法学验证。
方法：按《中国药典》2015年版四部制剂通则 1105、1106项下要求进行试验。
结果：需氧菌总数检查采用培养基稀释法加中和剂法(调节pH后的1:20供试液，1ml/皿)，霉菌和酵母菌检查采用常规法加中和剂法(调节pH后的1:10供试液，1ml/皿)，大肠埃希菌采用调节pH后的1:10供试液进行常规法检查。
结论：该方法不影响污染微生物的生长，适用于阿司匹林肠溶片的微生物限度检查。
【关键词】阿司匹林肠溶片；微生物限度；常规法；培养基稀释法；中和剂；方法学验证【中图分类号】R92 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）16-0385-02Establishment and Verification of Microbial Limit test Methods for aspirin enteric-coated tablets Chinese Pharmacopoeia 2015 Du Chunhua, Li Dongxian,He Dongyang,Pu Bingqing,Niu Yanfei,You Yan.Yunnan Institute of Materia Medica, yunnankunming 650111,China【Abstract】Objective To build and Verification of Microbial Limit test methods for aspirin enteric-coated tablets.Methods According to 1105, 1106, 1107 of Chinese Pharmacopoeia 2015 method. Results Total aerobic microbial count was checked by diluting method and sodium carbonate neutralization method (1:20 solution of the sodium carbonate neutralization method 1ml/plate), total combined yeasts and molds count were checked by routine method and sodium carbonate neutralization method method (1:10 solution of the sodium carbonate neutralization method 1ml/plate), the routine method was feasible for the Escherichia coli 1:10 solution of the sodium carbonate neutralization method. Conclusion This method does not affect the growth of contaminating microorganisms, can be applied to microbial limit test for aspirin enteric-coated tablets.【Key words】Aspirin enteric-coated tablets;Microbial limits test;Routine method;Diluting method;Sodium carbonate neutralization method;Validation of method阿司匹林，主要成分为2-（乙酰氧基）苯甲酸，最早用于解热、镇痛、抗炎，在临床上，能够对于感冒发热、头痛牙痛以及关节风湿疾病等患者起到较好的镇痛效果，类别为：解热镇痛、非甾体抗炎药、抗血小板聚集药[1]-[4]。
纯化水需氧菌检查R2A培养基适用性试验方案--2015年版药典-上上2018年
纯化水需氧菌检查R2A培养基适用性试验方案--2015年版药典-上上2018年纯化水需氧菌检查R2A培养基适用性试验方案下表用于记录修订/变更主要内容及历史1・概述2.验证目的和范围3.组织及职责4.验证进度计划表5.验证所需要的仪器设备的确认确认6.验证所需要的菌种、培养基、试剂、检验样品的7.验证项目和验证方法7. 1试验菌株7.2菌液制备7・3培养基适用性检查7. 4计数方法适用性试验（薄膜过滤法）&偏差与漏项控制9.验证报告会审第 4 页共16 页制药有限公司制药有限公司第5 页共16 页1. 概述我公司自制纯化水微生物限度检查项目为需氧菌总数检查。
参照《中国药典》2015 版四部附录1105：微生物计数法的规定，须对纯化水检查所用的R2A 培养基进行适用性试验。
通过适用性试验以确认所采用的培养基适用于纯化水的需氧菌检查。
本验证方案通过试验菌株的回收率测试，验证R2A琼脂培养基是否适用于本品的需氧菌总数检查。
2.验证目的和范围验证纯化水的需氧菌检查所用R2A 培养基的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。
本验证方案采用1批按GMF要求组织生产的纯化水，并进行R2A培养基适用性检查。
3.组织及职责3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。
验证方案实施完成后，由QC组负责汇总需氧菌检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。
3.2验证方案的培训验证方案在经质量负责人批准后，由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，并将该次的培训记录归档。
3.3验证方案实施过程中的变更和偏差验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。
3.4验证工作小组成员表4.验证进度计划表本次R2A培养基的适用性试验的计划安排时间是2015年8月至2015年9月。
5.验证所需要的仪器设备的确认主要检验仪器设备确认表检查人/ 日期复核人/日期：6.验证所需要的菌种、培养基、试剂、检验样品的确认6.1.试验菌种检查表检查人/ 日期复核人/日期：6.2试验所需的培养基检查检查人/ 日期复核人/日期：6.3试剂检查人/ 日期复核人/日期：64试剂及培养基配制pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液（冲洗液）：称取pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液干粉16.09g。
赤芍桃仁颗粒微生物限度检查方法适用性试验研究
【摘要】目的:建立赤芍桃仁颗粒的微生物限度检查方法，并对方法进行验证。方法:按照2020版《中国药典》四部通则1105、 1106、1107规定,对需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数及控制菌的检查方法进行验证。结果:赤芍桃仁颗粒具有一定的抑菌性，采用培养 基稀释法（1 : 10,0.2mL/皿）进行需氧菌总数的计数，采用供试品溶液稀释法（1 : 100,1mL/皿）进行霉菌和酵母菌总数的计数，控制菌可 采用常规法检查。结论:所选方法通过微生物限度检查方法适用性试验，可用于本品的微生物限度检查。
甘肃医药 2021 年 40 卷第 7 期 Gansu Medical Journal,2021 ,Vol.40,No.7
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・药学・
赤芍桃仁颗粒微生物限度检查方法适用性试验研究
黄燕1戴余雯1周素琴1袁丽2徐丽波2李待军3 1.兰州大学第二医院，甘肃兰州730030;2.兰州大学药学院，甘肃兰州730000;3.甘肃中医药大学附属医院，甘肃兰州730000
阳性对照组;4瓶以pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 替代供试液，作为阴性对照组。上述4组,351培养24h。 取各培养物1mL,接种至100mLMacB中,44七培养48ho
取麦康凯液体培养物划线接种于MacA平板上,35七 培养 72h。
2.6.2耐胆盐革兰氏阴性菌。取赤芍桃仁颗粒10g，加 100mL TSB，制成1 : 10供试液，混匀,25T培养2h(不
3结果
3.1计数方法三批赤芍桃仁颗粒，需氧菌总数、霉 菌和酵母菌总数计数分别按培养基稀释法和供试液稀 释法进行验证回收试验。见表2。
采用培养基稀释法(1 ： 10,0.2mL/皿)和供试液稀 释法(1 ： 100,1mL/皿)测定需氧菌总数、霉菌和酵母菌 总数，各试验菌回收比值均在0.5~2.0范围内，表明该
蒲地蓝消炎片微生物限度检查方法的建立及检验结果分析
蒲地蓝消炎片微生物限度检查方法的建立及检验结果分析发布时间：2021-11-09T02:29:56.976Z 来源：《医师在线》2021年27期作者：狄彦丽韩溶[导读] 根据国家《药典》2015版要求，建立蒲地蓝消炎片微生物限度检查法，抽样调查样本微生物，并分析检查结果，狄彦丽韩溶青岛黄海制药有限责任公司山东青岛 266000摘要：根据国家《药典》2015版要求，建立蒲地蓝消炎片微生物限度检查法，抽样调查样本微生物，并分析检查结果，从而蒲地蓝消炎片的合理化微生物限度标准与提升产品质量提高，提供丰富的参考依据。
关键词：蒲地蓝消炎片；微生物限度检查；方法适用性蒲地蓝消炎片为常用药，收录于《中药成方制剂》第三册。
蒲地蓝消炎片的主要成分为黄芩、蒲公英等中药组成[1]。
蒲地蓝消炎片常用于咽炎、疖肿、腮腺炎、扁桃腺炎等的治疗，有较好的清热解毒、抗炎消肿的功效。
在其限度检查时，需注意中药成分的抑菌性，符合消除供试液抑菌活性后，再进行检查[2]。
一、仪器与材料（一）仪器选用生物安全柜：Nu-425-400S型，产商：Nuaire（美）、低温生化培养箱：KB240型，产商：BINDEＲ（德）、电热恒温培养箱：BPX-272型，产商：博迅实业（上海）、生化培养箱：SPX-250B-Z型，产商：博迅实业（上海）、奥林巴斯显微镜（型号：CX31ＲBSFA，产商：奥林巴斯株式会社（日）），全自动微生物鉴定系统：VITEK 2 ComPact，产商：生物梅里埃（法）与飞行质谱微生物检定仪（型号：MALDI-TOF-MS，产商：生物梅里埃（法））。
（二）样品选蒲地蓝消炎片为样本，共有27批次，均选自山东仙河药业、云南白药集团、哈尔滨市龙生北药生物工程、锦州本天药业、天津中新药业集团股份的公司。
（三）培养基与稀释液本次研究所使用培养基均经过培养基适用性检查，主要包含：液体培养基：肠道菌增菌液体培养基、RV沙门菌增菌液体培养基，琼脂培养基：沙氏葡萄糖琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基等。
药用辅料苯甲醇新版药典微生物限度检查适用性实验
药用辅料苯甲醇新版药典微生物限度检查适用性实验目的：建立苯甲醇微生物限度检查法并進行方法适用性实验。
方法：按《中国药典》2015年版四部制剂通则1105、1106、1107项下要求进行实验。
需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查和控制菌检查均采用薄膜过滤法，采用上述方法对苯甲醇药用辅料各实验菌进行回收率实验，并对控制菌检查方法进行适用性实验。
结果：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数验证实验中各菌的回收比值均符合《中国药典》2015年版规定，控制菌检查方法可行。
结论：该方法适用于苯甲醇辅料的微生物限度检查。
微生物檢查作为药品安全的重要指标，其标准制定也随着药品产业的发展及对药品质量高要求的需求而不断提高。
2015年版《中国药典》对微生物限度检查法做了较大的修订，新版药典将2010年版药典附录中的ⅪJ微生物限度检查法拆分为三个部分，分别为微生物计数法、控制菌检查法和微生物限度标准[1]。
其中检验所用实验菌液、检验方法、培养基、培养温度等都做了不同程度的更改。
新版药典更加关注生产过程中的微生物控制，在药品生产、储藏和流通各个环节中，药品生产企业均应严格遵循GMP的指导原则。
制剂、原料及辅料、中药提取物及中药饮片的微生物限度与2010年版《中国药典》比较给出了具体的限度标准。
本文按照2015年版《中国药典》的操作要求及指导原则，对苯甲醇药用辅料微生物限度检查法进行研究及适用性实验，以确定出适宜、有效的检查方法[2]。
苯甲醇也称苄醇，英文名Benzyl alcohol，是最简单的含有苯基的脂肪醇，苯甲醇为无颜色透明液体，有微弱的芳香气味，稍溶于水，易溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂[3-4]。
苯甲醇用途广泛，主要应用于环氧树脂及涂料领域，也广泛应用于日化、食品、医药等领域。
近年来随着相关行业的发展，国内外对苯甲醇的需求量不断增加，2011年医药领域苯甲醇的消费量约为1200 t。
由于其具有麻醉、镇痛的功效，苯甲醇在制剂中用作防腐剂和局部止痛剂，但因不良反应较大，婴儿使用时有过致死案例，目前主要用作防腐剂。
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龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn 射干合剂2015年版《中华人民共和国药典》微生物检查方法适用性研究 作者：田怀平 王玲 杜毅 唐跃年 来源：《中国中医药信息》2017年第10期
摘要：目的 建立符合2015年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）要求的射干合剂的微生物限度检查方法。方法 采用2015年版《中国药典》方法对射干合剂进行微生物限度检查方法学验证。薄膜过滤法进行样品前处理，使用6种菌株分别进行微生物计数检查和限度菌检查的方法适用性研究。结果 微生物计数检查的5种菌株的回收比值均在0.5～2之间，控制菌检查的大肠埃希菌检出合格。结论 射干合剂的微生物限度检查方法经验证符合2015年版《中国药典》要求。
关键词：射干合剂；微生物计数检查；限度菌检查；薄膜过滤法；中华人民共和国药典 DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.10.017 中图分类号：R927.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）10-0072-04 Study on Applicability of Microbiological Examination Methods for Shegan Mixture in Chinese Pharmacopoeia 2015 TIAN Huai-ping， WANG Ling， DU Yi， TANG Yue-nian （Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine， Shanghai 200092， China）
Abstract： Objective To standardize the method of microbiological examination on Shegan Mixture in Chinese Pharmacopoeia 2015. Methods Chinese Pharmacopoeia 2015 was used. Microbial enumeration test and specified microorganisms test were used to verify Shegan Mixture. The samples were treated by membrane filtration. Six kinds of strains for microbiological counting and limiting bacteria were used to study applicability. Results Microbial counts of the five strains of the recovery ratio were between 0.5 to 2， and Escherichia coli tested by control bacteria was qualified. Conclusion The microbiological examination methods for Shegan Mixture can meet the requirements of Chinese Pharmacopoeia 2015.
Key words： Shegan Mixture； microbial enumeration test； specified microorganisms test； membrane filtration method； Chinese Pharmacopoeia 2015
射干合剂为本院临床应用多年的医院制剂，是著名儿科名家时毓民的经验方，由麻黄（炙）、射干、黄芩、前胡、苦杏仁、僵蚕、蔊菜、蝉蜕、百部（炙）等组成，具有宣肺清热、止咳祛痰平喘的功效，常用于治疗感冒咳嗽、急性支气管炎及哮喘性支气管炎引起的咳嗽、多痰等症状。该制剂委托上海方心制药科技有限公司生产（批准文号：沪药制字龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn Z04180745，执行标准SYZ-ZF-017-2004），常规质量控制检查包括鉴别、装量、含量测定和微生物检查等[1]。
2015年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）的微生物检查法与2010年版比较，在培养基、培养条件和检验方法等方面有重大改变[2]。现有
基金项目：上海市卫生局中医药科研基金（2012G003A） 通讯作者：唐跃年，E-mail：tyn2018@163.com 制剂的微生物检查方法，应按照新版《中国药典》调整，并进行方法适用性检查，但此类研究报道较少。本试验按照2015年版《中国药典》要求，对射干合剂的微生物限度检查法进行方法适用性验证研究，以期为药品质量控制部门采用新版《中国药典》进行微生物检查和质量分析提供参考。
1 材料 1.1 仪器 ME204电子天平，梅特勒-托利多（上海）有限公司；CLG-32L高压蒸汽灭菌锅，日本ALP CO.，Ltd.公司；M017生物安全柜，Thermo Fisher Scientific；SW-CJ医用型洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；HTY-APL01集菌仪，杭州泰林生物技术设备有限公司；集菌培养器，型号KSF330，批号20161105，杭州泰林生物技术设备有限公司；PYX-DHS40*50电热恒温培养箱，上海跃进医疗器械一厂；MJ-250I霉菌培养箱，上海一恒科技有限公司；Microflex LT质谱仪，德国布鲁克道尔顿公司。
1.2 药物 射干合剂，本院委托上海方心制药科技有限公司生产的外加工制剂，批号分别为151201、160913、160914，规格100 mL/瓶，有效期限12个月。
1.3 微生物限度标准 射干合剂为非无菌不含药材原粉的中药口服液体制剂。2015年版《中国药典》四部1107微生物限度标准：需氧菌总数不超过102 cfu/mL（1 mL或1 g可接受的最大菌数为200），霉菌和酵母菌总数不超过101 cfu/mL（1 mL或1 g可接受的最大菌数为20）。不得检出大肠埃希菌（1 mL）[2]。
1.4 培养基和稀释液 龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn 胰酪大豆胨琼脂培养基（Tryptic Soy Agar，TSA，批号20160107），沙氏葡萄糖琼脂培养基（Sabouraud Dextrose Agar Medium，SDA，批号20160126），胰酪大豆胨液体培养基（Trypticase Soytone Broth，TSB，批号20160219），麦康凯液体培养基（MacConkey Broth，Mac B，批号20160902），麦康凯琼脂培养基（MacConkey Agar，Mac A，批号150929）。配制好的培养基采用121 ℃高压蒸汽灭菌15 min，高压蒸汽灭菌采用3M1292生物指示剂（批号20160428，美国3M公司）验证合格。培养基全部产自上海中科昆虫生物技术开发有限公司。稀释液为本院制剂室生产的0.9%无菌氯化钠溶液，质量检查合格。每批次培养基均按照2015年版《中国药典》要求，进行与对照培养基验证试验，适用性检查合格[2]。
1.5 菌种 需氧菌总数使用TSA培养基检查，菌种为金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus，CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌[Pseudomonas aeruginosa，CMCC（B） 10104]、枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis，CMCC（B） 63501]、白色念珠菌[Candida albicans，CMCC（F） 98001]和黑曲霉[Aspergillus niger，CMCC（F）98003]；霉菌和酵母菌总数使用SDA培养基检查，菌种为白色念珠菌和黑曲霉。控制菌检查使用Mac B和Mac A培养基，试验菌种为大肠埃希菌[Escherichia coli，CMCC（B）44102]。试验菌种均为中国食品药品检定研究院提供的0代菌种，试验前传代至第3代。
2 方法与结果 2.1 试验菌液的制备 按照2015年版《中国药典》四部非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法（1105）和控制菌检查法（1106）的方法，分别制备金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉和大肠杆菌的菌液[2]。接种的验证菌为传代至第3代的菌种，菌液用0.9%无菌氯化钠溶液稀释，各菌种的稀释倍数在10-6～10-8之间，最终试验组接种量为1 mL含菌50～100 cfu。菌液制备后，室温放置则2 h内使用，若保存在2～8 ℃则24 h内使用。
2.2 供试液的制备 将射干合剂混匀，量取10 mL，加0.9%无菌氯化钠溶液稀释至100 mL，混匀，为1∶10的供试液。量取1∶10供试液10 mL，加0.9%无菌氯化钠溶液稀释至100 mL，混匀，为1∶100供试液。供试液制备后1 h内完成接种。
2.3 微生物计数检查分组 计数检查方法验证时，检品分为4组，每种菌株分别制备加菌试验组和菌液对照组，每种培养基分别制备供试品对照组和阴性对照组。由于射干合剂含多种有抑菌作用中药，因此采用薄膜过滤法消除样品的抗菌活性。①加菌试验组：分别取1∶10供试液和1∶100供试液各10 mL，使用集菌培养器进行薄膜过滤，0.9%无菌氯化钠溶液冲洗3次，每次100 mL，在最后一