SPE-HPLC实验讲义

固相萃取-高效液相色谱法测定水溶液中的腺嘌呤核苷
【实验目的】
1. 掌握固相萃取前处理样品的基本步骤及方法
2. 熟悉高效液相色谱仪的一般使用方法
【实验原理】
固相萃取（SPE）分离是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，使其与样品的基体或干扰化合物分离，然后再用适当的溶剂洗除杂质，最后用适当溶剂洗脱目标化合物从而达到分离和富集目标化合物的目的。

腺嘌呤核苷是生物细胞维持生命活动的基本组成元素之一，参与DNA的代谢过程,在体内许多系统和组织有着广泛的生理学作用，具有抗肿瘤、抗病毒、基因治疗等多种生物活性。

本实验利用固相萃取—高效液相色谱的方法，实现了水溶液中的腺嘌呤核苷与其结构类相似物2’-脱氧鸟嘌呤核苷，鸟嘌呤核苷，胞7嘧啶核苷，尿嘧啶核苷，胸腺嘧啶核苷的定量分离。

当样品杂质的极性＞目标物的极性，用反相模式。

采用固相萃取C18柱。

洗脱剂的选择，洗杂质、目标物时极性相似。

目标物与杂质同时吸附，而样品中杂质的极性＞目标物的极性时，先用极性大的溶剂，将杂质洗下来（15％甲醇），再用极性小的溶剂洗脱目标物（50％甲醇）。

必须活化，才能与溶质产生重线性。

先用强溶剂预洗，以消除小柱上在生产或储存过程中可能带入的污染物，避免在色谱图上出现与样品无关得杂质峰。

反相选甲醇。

然后再用较弱的甲醇－水，洗脱润湿小柱，从而保证样品在柱上有足够的保留与回收率。

润湿能打开卷曲在硅胶表面上的烷基链，使溶质与键合相之间充分接触。

上样溶剂：水；淋洗：5～10弱溶剂（水－缓冲液或甲醇－水）；洗脱剂：溶剂强度＞上样溶剂，用小体积洗目标产物。

分别接洗脱后溶液，进色谱C18柱，极性小的后出柱。

【仪器和试剂】
高效液相色谱仪；ODS色谱柱；固相萃取仪；C18固相萃取柱；
腺嘌呤核苷（A），2’-脱氧鸟嘌呤核苷（2’-dG），鸟嘌呤核苷（G），胞嘧啶核苷（C），尿嘧啶核苷(U)，胸腺嘧啶核苷(T)，甲醇，混合磷酸盐缓冲液等。

【实验步骤】
1. 色谱条件色谱柱：ODS柱（250×4.6mmID, 5 m）；流动相：1
2.5％甲醇+PH4.0磷酸盐缓冲液；检测波长：260nm；柱温：25℃；流速：1.0mL／min；进样量：20μL。

腺嘌呤核苷t R：10.6min，2’-脱氧鸟嘌呤核苷t R：6.7min，鸟嘌呤核苷t R：5.8min，胞嘧啶核苷t R：
3.4min，尿嘧啶核苷t R：
4.7min，胸腺嘧啶核苷t R：8.0min。

2. 溶液的配制 1.0mM/L标准储备液：分别精密称取鸟嘌呤核苷0.0071g,2’-脱氧鸟嘌呤核苷0.0067g,腺嘌呤核苷0.0067g,胞嘧啶核苷0.0061g,胸腺嘧啶核苷0.0061g,尿嘧啶核苷
0.0061g于25mL容量瓶中，用三蒸水定容至刻度，摇匀。

20μM/L混和标准储备液：分别精密吸取上述各标准储备液0.5mL于25mL容量瓶中，用三蒸水定容，摇匀。

3. 标准曲线的制备精密吸取20μM/L混和标准储备液，用三蒸水逐级稀释成10，5，2.5，1.0，0.5μM/L，用微量注射器分别吸取上述各混和标准溶液，进样20μL，记录色谱图。

以各核苷的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，用最小二乘法回归成线性方程。

4. 固相萃取
4.1 固相萃取柱的活化将C18固相萃取柱依次用10mL甲醇及10mL的纯净水活化。

4.2 上样取2mL样品溶液，开启真空系统，使溶液连续通过活化过的C18萃取柱，保持流速1-2ml／min进行固相萃取，收集上样溶液。

当所有的样品穿过萃取柱后，继续真空抽吸1min，使柱子干燥，记录样品体积，关闭真空泵。

4.3 淋洗开启真空系统，用3mL15%甲醇淋洗C18萃取柱，收集淋洗样品，记录体积。

4.4 洗脱开启真空系统，用3ml50%甲醇洗脱MIP小柱，收集洗脱液，记录体积。

5. 固相萃取样品的检测用微量注射器吸取固相萃取样品（上样，淋洗，洗脱），进样20μL，记录色谱图，代人标准曲线，计算腺嘌呤核苷的浓度。

6. 结果计算
6.1 标准曲线
对照品回归方程相关系数(r2)
A y=10879x-4670.2 0.991
G
2’-dG y=4582.2x+659 0.997
C y=5386.4x-346.92 0.9992
T y=7058.9x-44.406 0.9997
U y=7310.8x-274.28 1
6.2 样品浓度计算
【注意事项】
1.在活化及萃取过程中，不要让萃取柱变干，柱床始终保持湿润。

2.固相萃取上样时速度不宜过快，防止待测组分来不及与填料充分作用就从通道流失。

3.固相萃取柱最好只用一次。

因为从严格的意义上来说，很多物质的吸附是不可逆的，一
次吸附，无法洗脱，若重复使用，可能影响下一次吸附。

4.高效液相色谱在进样时，为保证进样准确，进样时必须多取一些溶液，使溶液完全充满
进样环。

【思考题】
1.本实验依次用10mL甲醇及10mL的纯净水流过淋洗固相萃取小柱，上样后又依次用15%
甲醇、纯甲醇流过小柱，请解释各溶剂的作用。

用强溶剂10mL甲醇预洗，以消除小柱上在生产或储存过程中可能带入的污染物，避免在色谱图上出现与样品无关得杂质峰。

再用较弱的甲醇－水，洗脱润湿小柱，润湿能打开卷曲在硅胶表面上的烷基链，使溶质与键合相之间充分接触。

从而保证样品在柱上有足够的保留与回收率。

样品中杂质的极性＞目标物的极性，用极性大的溶剂15%甲醇，将杂质洗下来.
用极性小的溶剂50％甲醇洗脱目标物。

2.实验结果说明了什么？
N
N
N N
NH 2
H O H
O H H H H
H H H
O
N NH
O
O
C
H 3H H
O H H H H
H H H
O
腺苷（A ） 10.57 min 胸腺嘧啶（T ）8.02 min
N
NH
N
N NH 2
O
H
O OH
N
NH N
N NH 2
O
H
O OH
OH
2’－脱氧鸟苷（2’－dG ）6.7min 鸟苷（G ）5.8 min
O H
O H H H H
H H H
O
N
NH O O H
N
NH
O O
H
-
OH O
OH
尿苷（U ） 4.7min 胞苷（C ）3.35min
姓名_______________________ 学号_____________________。