兽药残留SPE方法

The determination of antibiotic and pesticide residues in foods： samplepreparation for LC-MS analysisAbstract: In this article, we will discuss SPE strategies prior to tandem LC/MS analysis for sub-ppb determination of chloramphenicol, nitrofuran antibiotic metabolites, and other related substances in animal tissues and in honey. Sample preparation for LC-MS analysis to determinate of antibiotic and pesticide residues in foods is reviewed and prospected .Key words: antibiotic and pesticide residues , food , sample preparation , LC-MS食品中抗生素和农药残留分析：用于LC－MS分析的SPE样品前处理方法Waters公司赵维国摘要：本文将讨论LC-MS分析之前，动物组织和蜂蜜中残留物质的样品前处理策略，其中包括ppb级氯霉素、喹诺酮类、硝基呋喃代谢产物和其它相关物质的固相提取（SPE）方法。

对食品中抗生素和农药残留的LC－MS分析的SPE样品前处理方法进行综述和展望。

关键词：抗生素和农药残留，食品，样品前处理，LC-MS食品中抗生素和其它兽药残留目前正在全球范围内受到广泛的重视。

对于农药和兽药残留的分析而言，所需达到的要求通常取决于毒理学评估的结果，而所期望达到的定量限(LOQ)与合法注册的农业化学品的最大允许残留限量相关。

近年来更加令人担心的是畜牧业和渔业生产中违规非法使用的某些抗生素残留。

这些抗生素没有允许的残留限量，任何被禁用抗生素的存在皆可作为犯罪活动的证据。

本文将讨论串联LC-MS分析之前动物组织和蜂蜜中残留物质的SPE样品前处理策略，其中包括ppb级氯霉素、氟喹诺酮类、硝基呋喃代谢产物和其它相关物质的SPE提取方法。

对食品中抗生素和农药残留的LC－MS分析的SPE样品前处理方法进行了综述和展望。

1固相提取方法SPE的优势SPE是样品前处理的重要手段。

与液液萃取相比，SPE方法简单、快速、重现性好且比较容易实现自动化，是近年来应用非常广泛的样品前处理技术之一。

SPE技术能够有效地净化和浓缩样品，不仅提高检测灵敏度，延长色谱柱寿命，而且能够延长LC-MS系统珍贵的开机时间。

SPE吸附剂：Oasis吸附剂的选择Oasis吸附剂是Waters公司1996年起推出的SPE产品，是Waters继其在业界首推Sep-Pak固相提取产品后，又一个划时代的SPE品牌。

Oasis吸附剂目前有反相机理(HLB)、阳离子交换与反相混合机理(MCX)、阴离子交换与反相混合机理(MAX)、弱阳离子交换与反相混合机理(WCX)、弱阴离子交换与反相混合机理(WCX)五种类型，分别适合于多种未知有机物及碱性、酸性物质的提取 (参见图1：Oasis 吸附剂选择图)。

图1 Oasis 吸附剂选择图2 用于LC-MS 分析的SPE 方法开发示例2.1 牛肉中氟喹诺酮类(Fluoroquinolone)药物的SPE 方法开发氟喹诺酮类药物主要用于预防和治疗动物疾病[1，2]，少量使用对动物生长有一定的促进作用。

但是过量使用或使用不当会造成这类药物在畜产品中的长期残留。

而这类残留的药物对人的中枢神经系统会造成不良影响[3]，因此，欧盟、北美等国家规定：氟喹诺酮类药物在动物源性食品中的最高限量不得超过10~400µg/kg 。

表1 喹诺酮类药物的最大残留限量(MRL) [7]下面以恩诺沙星为例，介绍如何根据化合物的结构特点，选择样品前处理所用的SPE 小柱和优化提取方法。

图2 恩诺沙星的结构式恩诺沙星是一个两性化合物，同时具有酸性和碱性特征：酸性官能团的pKa ≈ 5，碱性官能团的pKa ≈ 8-9。

恩诺沙星在水中溶解度也与pH 有关：中性条件下微残留标记物动物种类 目标组织 MRL(µg/kg) 达诺沙星（Danofloxacin ）牛（Bovine ） 猪（Porcine ） 鸡（Chicken ） 肉（Muscle ） 肝脏（Liver ） 肾脏（Kidney ） 200 400 环丙沙星（Ciprofloxacin ） 恩诺沙星（Enrofloxacin ）牛（Bovine ）肉（Muscle ） 肾脏（Kidney ）30200溶，在酸性或碱性条件下溶解度较好。

因此，可以选用离子交换吸附剂提取。

当pH>6 时，使用阴离子交换填料提取，pH<6 时，使用阳离子交换填料提取。

目前Waters开发了的单柱和双柱串联两种净化法用于氟喹诺酮类药物的SPE样品前处理。

单柱净化法：使用Waters公司的Oasis MAX（6cc/500mg, 186000865）固相提取小柱。

首先称取2g牛肾脏，用30mL 50 mM 磷酸盐缓冲液(pH 7.4)提取，再以10000 rpm速度离心10分钟，取上清液，进行SPE净化。

SPE净化操作步骤如下：1）活化、平衡SPE小柱：1 mL 甲醇, 1 mL 5 M NaOH和1 mL 水2）上样：5 mL的离心上清液3）第一步清洗：1 mL 5 % 氨水4）第二步清洗：1 mL 甲醇5) 洗脱：3 mL 4 % 甲酸甲醇溶液6) 挥干溶剂，用0.4mL 流动相重新定容氟喹诺酮类药物的分析可以用LC/MS或LC/荧光检测方法，本次实验中使用Waters /Micromass Quattro micro API™ (MS/MS)系统，最低检测限（LOQ）可低于20 µg/kg[4]。

LC分离条件等度分离：LC-UV, LC－荧光色谱柱：Atlantis™ dC18，5 μm，4.6 x 150 mm流动相：75% NFPA(0.2%) 水溶液，3% 甲醇，22% 乙腈流速： 1.2 mL/min温度： 30 °C进样体积：30-80 μL 梯度分离：LC-APCI MS色谱柱：Atlantis™ dC18，5 μm，4.6 x 150 mm 流动相：A: 0.2% NFPA*水溶液 B: 甲醇梯度：线性, 在10分钟内 40% B到80% B流速： 0.8 mL/min温度：30 °C进样： 30-80 μL*NFPA 为C4F9-COOH图3 牛肾脏中9种加标氟诺酮类药物SPE提取后的LC/MS/MS 分析此方法已用于合法注册的允许使用抗生素的残留分析。

可以看到，经过单柱SPE 净化、提取，可以得到较好的分析结果。

此外，Waters 还开发了能够去除更多干扰物质，得到更干净本底的双柱串联SPE 净化法。

同样是根据被测物的两性特性，样品先通过Oasis MAX 小柱（6cc 150 mg ，186000370），选择性地保留两性的目标化合物，清洗去除碱性和中性干扰物质。

然后，将从第一根SPE 小柱得到的洗脱液，经过Oasis MCX 小柱（1cc 30 mg ，186000254），再次选择性地保留目标化合物，清洗去除弱酸性干扰物，流程见图4。

加标浓度（ng/g ） 洛美沙星Lomefloxacin 达诺沙星Donofloxacin 氧氟沙星Ofloxation 氟甲喹Flumaquine 诺氟沙星 Norfloxacin 10 76.9[6.5] 75.5[7.7] 85.3[6.2] 75.0[13.5] 70.2[8.2] 100 87.8[5.3] 77.5[7.3] 91.9[7.7] 68.0[6.8] 75.7[5.9]加标浓度（ng/g ） 依诺沙星Enoxacin 环丙沙星Ciprofloxacin 恩诺沙星Enrofloxaxin 沙拉沙星Sarafloxcin 10 69.4[11.0] 70.2[11.3] 73.3[21.3] 71.9[10.9] 10078.7[7.6]80.5[4.7]108.4[5.6]82.0[5.5]图4 牛肾脏中氟喹诺酮类药物的双柱串联SPE 提取流程图5 牛肾脏中氟喹诺酮类药物的SPE 提取结果对比表2 9种氟喹诺酮类药物的回收率及相对标准偏差结果（n=5）从图5可以看到双柱串联SPE法净化的样品本底更加干净，只是回收率略有降低。

可见，选择性各异的SPE小柱和优化的SPE方法为样品前处理提供了更多的选择。

2.2虾中氯霉素(Chloramphenicol)的检测[5]氯霉素的过度使用会使细菌逐渐产生抗药性。

动物性食品中的氯霉素主要来源于带有抗生素的饲料或治疗时使用的抗生素。

目前，美国、加拿大、英国等国已经明令禁止在食用动物中使用氯霉素，食品中发现任何氯霉素残留即为违法。

氯霉素的最低定量限小于或等于100 ng/kg (0.1 ppb)。

氯霉素微溶于水（2.5 mg/mL），易溶于甲醇，乙酸乙酯，乙醇和丙酮，不溶于 (正)己烷，其结构如下：图6 氯霉素结构式美国FDA2003年的提取方法：1）乙酸乙酯（含2%氨水）提取组织中的氯霉素；2）挥干溶剂，并用0.05%醋酸溶解残留物；3）正己烷多次液液萃取；4）SPE C18小柱进行净化，甲醇洗脱，挥干。

用水溶解，过滤。

该方法的缺点是：用正己烷进行多次的液液萃取。

Waters 公司充分利用Oasis® HLB 小柱独特的富集和净化能力，避免液液萃取繁琐复杂的操作以及正己烷的使用，开发出适合LC/MS分析的操作简单、回收率高、步骤少的净化方法，而且该方法更容易标准化，具体操作如下：1）用乙酸乙酯（10+5ml）提取虾组织（5g），挥干溶剂2）用1mL 50：50 甲醇/水溶解残留物3）用20mL水稀释上述溶液，振荡或超声后，离心。

4）取上清液，通过Oasis® HLB 小柱（6cc ，200mg ，WAT106202），30%甲醇水溶液清洗，80%甲醇水溶液洗脱5）挥干洗脱溶剂，用流动相重新定容，过滤，待测。

2．3 蜂蜜中硝基呋喃类药物代谢产物(Nitrofuran metabolites)[6]硝基呋喃类药物是欧盟国家禁止使用的一类兽药，包括呋喃它酮、呋喃唑酮、呋喃西林和呋喃妥因等。

由于硝基呋喃类药物在动物体内容易代谢，因而在其生理基质中很少发现该类药物的原药，检测的目标化合物通常为它们与组织中蛋白结合的代谢产物：5-甲基吗啡-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)，3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ)，氨基脲(SEM) ，1-氨基-乙内酰脲(AHD)。