异源表达
烟曲霉Aspergillus Fumigatus 3-甾酮-Δ~1-脱氢酶基因的克隆、异源表达和活性鉴定
甾体 激 素在 临床 上 应 用 广 泛 ， 仅 次 于 抗 生 素 的 是
不 溶 于水 的 ， 因此 ， 然对 于 各种 ＫｓＤ在 大 肠 杆菌 系 虽 ｔ
摘 要 ： 生物 转 化 在 甾体 药 物 合 成 中起 着 不 可替 代 的 作 用 ， 中 Ｃ ， 微 其 １ ２住 脱 氢 是 最 为 重 要 的反 应 类 型 。 以烟 曲 霉 （ ｆ ｍｉａｕ） 出发 菌 株 ， 用 同源 序 列 比对 从 烟 曲 霉 酸 基 因 簇 中钓 取 出 ｋｔ Ａ． ｕ ｇ ｔｓ为 运 ｓ ＤＦ序 列 。该 基 因 与 玫瑰 色 热微 茵 （ ｅ— ｒ ｍｏ ｃｏｉｍ ｒｓｕ ）Ｄ Ｍ １ ９的 ｋｔ 一 致 性 为 ５ 。 构 建 ｐ Ｔ ８ （ ）ｋｔ ｍｉｒｂｕ ＂ｏｅｍ Ｓ ５５ ｓ Ｄ １ Ｅ ２ ａ ＋ 一ｓ ＤＦ表 达 栽 体 ， 转化 大肠 杆 菌 （ ｓ ｅｉ ｉ Ｅ ｃ ｒｃ ａ ｈ ｈ ｃｌ Ｌ １ Ｅ ） 获 得 高 表 达 重 组 子 菌株 。 经 ＩＴ 诱 导 、 Ｄ － Ａ ｏｉ ）Ｂ ２ （Ｄ ３ ， ＰＧ ｓ ＳＰ ＧＥ 电 泳 分 析 ， 现 高 温 （ ７℃ ） 利 于 Ｋｓ 蛋 白 发 ３ 有 ｔ Ｄ
烟 曲霉 Ａｓ ｅｇ ｌ ｓ ｕ ｇ ｔｓ３ 甾 酮一 １脱 氢 酶 基 因 ｐ ｒ ｉ ｕ ｍｉａｕ 一 ｌ Ｆ Ａ一 的 克 隆 、 源 表 达 和 活 性 鉴 定 异
陈 苗苗 。 良才 ， 林 马昱澍 ， 王风清 ， 东芝 魏
（ 东理 工 大 学 生物反 应 器工程 国家重 点 实验 室 鲁 华 生物技 术研 究所 ， 海 ２ ０ ３ ） 华 上 ０ ２ ７
乳酸菌细菌素plantaricin JK的异源表达、分离纯化及抗菌活性
乳酸菌细菌素plantaricin JK的异源表达、分离纯化及抗菌活性蒋晗;刘娇;郦萍;顾青【摘要】In order to obtain the high-yield two-peptide bacteriocin plantaricin JK, pln J and pln K were successfully heterologously expressed in Escherichia coli BL21 (DE3), and were induced by IPTG.Then the two peptides were expressed as His6-tag fusion proteins and were separated by Ni2+ chelating affinity chromatography.The fusion proteins were cleaved by enterokinase and further purified.The yields of pln J and pln K were around 2-3 and 5-8 mg·L-1.The antibacterial activity of the peptides against 4 indicator strains, i.e.Staphylococcus citreus, Escherichia coli, Micrococcus luteus, Listeria monocytogenes, was analyzed by agar diffusion method.It was shown that pln J and pln K both could inhibit the growth of the 4 indicator strains, but plantaricin JK had larger inhibition zone than pln J or pln K alone.%为获得高产双肽细菌素plantaricin JK,通过PCR扩增获得pln J和pln K基因,构建表达载体pET32a(+)-pln J-BL21(DE3)和pET32a(+)-pln K-BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,利用镍亲和层析柱进行分离纯化,重组蛋白经肠激酶酶切纯化后,细菌素pln J和pln K的产量分别为2~3、5~8 mg·L-1.利用牛津杯平板抑菌法研究抗菌活性,结果显示细菌素pln J和pln K对柠檬色葡萄球菌(Staphylococcus citreus)、大肠埃希菌(Escherichia coli)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)和单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)都有明显抑制作用,且双肽细菌素plantaricin JK的抑菌圈直径大于单独的细菌素pln J或pln K.【期刊名称】《浙江农业学报》【年(卷),期】2017(029)002【总页数】6页(P332-337)【关键词】plantaricinJK;异源表达;分离纯化;抗菌活性【作者】蒋晗;刘娇;郦萍;顾青【作者单位】浙江工商大学浙江省食品微生物技术研究重点实验室,浙江杭州310018;中国计量大学浙江省海洋食品品质及危害物控制技术重点实验室,浙江杭州 310018;浙江工商大学浙江省食品微生物技术研究重点实验室,浙江杭州310018;浙江工商大学浙江省食品微生物技术研究重点实验室,浙江杭州 310018;浙江工商大学浙江省食品微生物技术研究重点实验室,浙江杭州 310018【正文语种】中文【中图分类】Q786Heterologous expression and purification of plantaricin JK and analysis of its antibacterial乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是美国食品与药品监督管理局(FDA)认定的食品级微生物，乳酸菌及其代谢产物一般被认为是安全的(generally regarded as safe，GRAS)[1]。
荔枝LcMYB1异源表达促进矮牵牛和番茄花色苷的积累
热带作物学报2021, 42(5): 1290 1296 Chinese Journal of Tropical Crops收稿日期 2020-06-09；修回日期 2020-07-21基金项目 长江师范学院校级科研项目（No. 2016KYQD19，No. 2016KYQD20，No. 2016XJQN07）。
作者简介 杜丽娜（1987—），女，博士，副教授，研究方向：园艺植物生物技术。
*通信作者（Corresponding author ）：赖 彪（LAI Biao ），E-mail ：*******************。
荔枝LcMYB1异源表达促进矮牵牛和番茄花色苷的积累杜丽娜1,2，陈春帆1，苏 睿1，谭春艳1，赖 彪1,2*1. 长江师范学院现代农业与生物工程学院，重庆涪陵 408100；2. 长江师范学院武陵山片区绿色发展协同创新中心，重庆涪陵 408100摘 要：为分析荔枝LcMYB1的功能，以白色‘W115’矮牵牛和‘Micro-Tom ’番茄为材料，利用农杆菌介导法将LcMYB1在矮牵牛和番茄中异源表达，观测转基因植株表型。
结果表明：与‘W115’相比，转基因矮牵牛的叶片和花瓣中积累了花色苷，且矮牵牛花色苷生物合成结构基因PhCHS 和PhDFR 、调控基因PhAN1的表达显著上调；与野生型‘Micro-Tom ’番茄相比，转基因番茄的叶片和花药中积累了花色苷，且相应组织花色苷生物合成结构基因SlDFR 、调控基因SlAN1和SlJAF13的表达显著上调，虽然果实中没有积累花色苷，但SlAN1和SlJAF13表达也显著上调。
LcMYB1在矮牵牛和番茄中异源表达时通过上调花色苷生物合成关键结构基因和调控基因bHLH 的表达诱导花色苷积累。
因此，荔枝LcMYB1是花色苷生物合成中的关键转录因子，具备异源转化利用的潜力。
关键词：LcMYB1；矮牵牛；番茄；花色苷 中图分类号：S667.1 文献标识码：AEctopic Expressed LcMYB1 Induced Anthocyanin Biosynthesis in Petunia and TomatoDU Lina 1, CHEN Chunfan 1, SU Rui 1, TAN Chunyan 1, LAI Biao 1,2*1. School of Advanced Agriculture, Bioengineering, Yangtze Normal University, Fuling, Chongqing 408100, China;2.Correlative Innovation Centre for Green Development in Wulingshan Region, Yangtze Normal University, Fuling, Chongqing 408100, ChinaAbstract: In order to better understand the function of LcMYB1 and provide theoretical support for further utilization, LcMYB1 was transformed into both petunia and tomato. White flower ‘W115’ petunia and ‘Micro-Tom’ tomato were used as materials in LcMYB1 ectopic expressed assays. Anthocyanin contents and related gene expressions were ana-lyzed in transgenic plants. Ectopic expression of LcMYB1 in ‘W115’ resulted in anthocyanin production in vegetative and floral tissues such as leaves and petals, probably by transcriptional activation of anthocyanin biosynthetic genes such as PhCHS and PhDFR and endogenous anthocyanin regulatory gene PhAN1. However, the transgenic tomato only produced anthocyanin in anthers and leaves but not in tomato fruits and petals. The results suggested that LcMYB1 could enhance anthocyanin production in vegetative and floral tissues of both petunia and tomato by activating anthocyanin biosynthesis and regulatory genes. LcMYB1 is an important transcriptional regulatory factor in anthocyanin biosynthesis of plants and is potentially used in ectopic transformation. Keywords: LcMYB1; petunia; tomato; anthocyanin DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.013色泽是花卉和果蔬的重要品质组成之一。
蜘蛛多肽类毒素异源表达的研究进展
（７ｋ ａ 利用表达载体 ｐ Ｔ一１ ｂ成功表 达 ３ Ｄ ） Ｅ ４
； 大肠杆 菌
目前研究用 的蜘 蛛毒 素大部分从 天然 的粗 毒 中提 取出
ｎｚＭ． 等人利用 表达 载体 ｐ Ｔ ２ （＋） ｉ， Ｒ． Ｅ ３ｃ 在大肠杆 菌 Ａ ４ ４ Ｄ９
（ Ｅ ） Ｌｓ Ｄ ３ ｐ ｙＳ中成 功表达 出 Ｐ ｏｅｔａｎｇ ｖｎ ｒ ｈｎ ｕｒ ｉｒ ｅｔ 的钠离子通 ｉ ｉ ｅ 道抑制剂 Ｔ ｌ ２０ ｘ＿ ．０ ３年 Ｃ ｍｅ ｏ Ａ Ｍ． ４ ａ ｉ ， ． 等人用质粒 ｐ Ａ ｒ Ｍ Ｌ—
第２ ６卷
第 ２期
长
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大
学
学
报
Ｖ０ ． ６ Ｎ０． Ｉ２ ２ Ｍａ ．２ ０ １ ２ ｒ
２０１２年 ３月
Ｊ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＨＡＮＧＳＨＡ ＵＮＩ ＲＳＩ ＶＥ ＴＹ
蜘 蛛 多肽 类 毒 素 异 源表 达 的研 究进 展
王 浩 ， 刘燕波 ， 李文颖 孟 尔 ， ， 柳 珑
蜘蛛在分类学上 属于节肢 动物 门，蛛形 纲 ，蜘蛛 目． 蜘 蛛是世界上最古老 的种 之一 ， 其种 类数 目仅次 于昆虫 ， 分
布 也 极 为广 泛 ． 统 计 全 世 界 共 发 现 蜘 蛛 ４ ００多 种 ． 据 ００ 除
了 ｈｃｌ ｒｗ ａｅｓ（ ｌ ｏｉａ ） ｐ ｍｔ ｅｍ ｓｔｅｄ ａｋ ｄｏｂ ｅｖｒ Ｕｏ ｒ ｅ 和 ｒ ｉｖ ｅｏ ｌ ｓ中 ｅ ｂ ｄ ｉ ｉ ｈｉ 的某些 种类 外 ， 其它所有 蜘蛛都 具有 毒腺０ 蜘蛛毒 液成分 ．
丝状真菌异源蛋白高效表达的研究进展
丝状真菌异源蛋白高效表达的研究进展摘要:根据一般真核生物的特点，同时，真菌也有微生物系统的优点，比如利用一个简单的发酵系统有能力分泌的蛋白质改性方案。
丝状菌中的黑曲霉等真正有效分泌蛋白质，但是关于重组蛋白的分泌是一个困难的任务。
作为黑曲霉因其高的分泌量,而且通常作为一种生物模型。
然而，具有高的生产产可以取得相应的蛋白质表达,低得多的大量生产,也获得了外源蛋白质。
要充分利用丝状真菌的潜力，了解分子遗传学，他们的生理，和糖基化代谢进行调查，并在更详细的澄清。
本综述丝状真菌异源蛋白生产中的最近的事态发展，还推广了由各种基因和生物处理方法蛋白质产量提高的可能性，从而减轻相关和可靠的表达平台的丝状真菌的认可。
引言丝状真菌能够生产大量特定的蛋白质。
其丰富的遗传多样性，利用他们作为一个新的基因源，并作为表达宿主。
许多重要的工业，如里氏木霉、霉真菌菌株，已被列为GRAS （一般认为是安全的），可以生长在相对廉价的载体上，既可以产生和分泌巨大的重组蛋白。
如成本低，生产效率高的特点也吸引了许多研究工作，在分子遗传技术与过程改进。
许多研究者已经在丝状真菌的发展总结自己的进步，为同源载体上进行异源蛋白的生产。
为了提高外源蛋白的表达，已成为真菌分子生物学的一个重大的问题。
酵母只占1%的产品（如表1所示）1.丝状真菌表达宿主目前，丝状真菌已用于同源和外源蛋白的表达。
事实上，真菌分泌到培养液中的酶有明显的优势，如果他们在细胞内积聚，在生产蛋白质可能有毒。
同时，分泌也有利于净化所需的产品，因为没有必要打破细胞，并摆脱所有的细胞内蛋白质，这一过程往往是繁琐和昂贵的。
此外，发酵技术也非常发达，真菌可以生长大量廉价的目的蛋白。
从此，许多重要的工业真菌蛋白质产生了各种表达，主要优势真菌表达系统列于表3。
产量最高的是获得性异种真菌酶（如表4所示），生产真菌蛋白与此相反，丝状真菌的非真菌蛋白产量是非常低的，不具有工业生产力。
2.外源蛋白的生产产量低的瓶颈限制蛋白质生产的因素，可以低的转录水平，mRNA不稳定，效率低下的翻译，转录后的瓶颈，感兴趣的蛋白质降解。
嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因在地衣芽孢杆菌中的异源表达
50㊀2021Vol.47No.1(Total 421)DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.025483引用格式:楼志华,刘翔,张劲楠.嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因在地衣芽孢杆菌中的异源表达[J].食品与发酵工业,2021,47(1):50-54.LOU Zhihua,LIU Xiang,ZHANG Jingnan.Heterologous expression of maltotetraose-forming amylase from Pseud-omonas saccharophila in Bacillus licheniformis [J].Food and Fermentation Industries,2021,47(1):50-54.嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因在地衣芽孢杆菌中的异源表达楼志华1,2∗,刘翔1,张劲楠11(江苏省奥谷生物科技有限公司,江苏常州,213300)2(溧阳维信生物科技有限公司,江苏常州,213300)摘㊀要㊀为了考察重组地衣芽孢杆菌的异源表达特性,进一步提高麦芽四糖酶的发酵水平,以适用于工业化生产,研究构建了木糖诱导型的重组地衣芽孢表达系统,表达了来源于嗜糖假单胞菌的麦芽四糖酶基因,并进行了初步发酵优化㊂结果显示,构建的表达系统经过核酸电泳以及十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis ,SDS-PAGE )鉴定均正确,该系统在发酵过程中经过木糖诱导,重组酶能够成功地分泌至发酵液中,然后通过对诱导剂添加时间㊁诱导温度和发酵时间优化后,摇瓶水平的最大酶活力可达(168.2ʃ9.41)U /mL ㊂最佳的发酵条件为,在24h 添加诱导剂,诱导温度30ħ,发酵至稳定期结束停止发酵㊂该研究为重组地衣芽孢杆菌的异源表达研究以及麦芽四糖酶的工业化应用提供了参考㊂关键词㊀麦芽四糖酶;地衣芽孢杆菌;嗜糖假单胞菌;发酵优化;异源表达;木糖诱导第一作者:硕士,工程师(通讯作者,E-mail:muxinhua23@)收稿日期:2020-08-26,改回日期:2020-09-21㊀㊀麦芽四糖酶(glucan 1,4-α-maltotetraohydro-lase),又名麦芽四糖淀粉水解酶,可以连续地催化淀粉状多糖中非还原型末端麦芽四糖残基的水解,主要产物为麦芽四糖[1]㊂而麦芽四糖因其独特的理化特性,一度被誉为最有希望的麦芽低聚糖[2],在食品加工行业有着广泛㊁重要的应用㊂麦芽四糖酶基因主要来源于斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri )和嗜糖假单胞菌(Pseudomonas saccharophila ),二者来源的麦芽四糖酶均为α构型㊂相比而言,嗜糖假单胞菌来源的麦芽四糖酶的热稳定性和pH 稳定性均较好,在40ħ以下和pH 5.5~11均能长时间保持稳定;在最适温度(55ħ)㊁最适pH(6.7)以及在其他宿主内表达后酶活力也均较高[3]㊂这些因素表明嗜糖假单胞菌来源的麦芽四糖酶更适合于工业化应用,也因而备受学者的关注㊂国内,ZHOU㊁赵云等[4-5]在大肠杆菌中克隆表达了嗜糖假单胞菌来源的麦芽四糖酶,但获得的重组酶大部分是包涵体,重组酶活力并不高㊂2019年,张梓芊㊁杨亚楠等[6-7]在Bacillus subtilis 中构建了表达系统胞外表达了嗜糖假单胞菌来源的麦芽四糖酶,发现其比活力为980.49U /mg,通过发酵优化后,在摇瓶水平重组酶活力可高达147U /mL㊂这些报道中,重组酶酶学性质基本一致,在芽孢杆菌中表达可获得更高的活力㊂国外,美国杰能科公司上市的麦芽四糖酶SAS3则以地衣芽孢杆菌为宿主进行重组表达[8],并且在地衣芽孢杆菌发酵产相关淀粉酶方面形成了技术封锁,因此导致国内纯化的麦芽四糖价格极高㊂地衣芽孢杆菌是优良的食品安全级表达宿主,被美国FDA 认定为食品安全级菌株(Generally Recognized As Safe,GRAS)已有近40年的历史,而且该菌产酶能力高,胞外蛋白分泌能力大约是枯草芽孢杆菌的2倍[9]㊂然而,国内目前还未发现有关重组地衣芽孢杆菌表达麦芽四糖酶的研究㊂本研究拟构建地衣芽孢杆菌表达系统,对来源于嗜糖假单胞菌的麦芽四糖酶基因进行木糖诱导表达,通过果聚糖合酶信号肽使麦芽四糖酶分泌至胞外,并对构建的重组菌进行初步发酵条件优化,以期为地衣芽孢杆菌的异源表达以及麦芽四糖酶的工业化应用提供参考㊂1㊀材料与方法1.1㊀菌株和质粒本研究所用敲除了α-淀粉酶基因amyL 和碱性蛋白酶基因aprE 的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis CICIM B1391(BLΔAE)㊁E.coli JM109以及大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pHY300-PLK,均购于江南大学,由江苏省奥谷生物科技有限公司保藏㊂重组质粒pBL-SY2由江南大学石贵阳教授惠赠,该重组质粒携带了来源于B.licheniformis CICIM B1391自身的木糖异构酶启动子及其调控蛋白基因㊁枯草芽孢杆菌果聚糖合酶信号肽基因sacBss㊁B.licheniformis ATCC14580的麦芽糖淀粉酶基因以及木糖异构酶基因的终止子ter㊂嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因序列由NCBI数据库查寻获得,序列号为:X16732.1,将该序列和终止子ter一并委托上海生物工程有限公司合成,合成后的片段插入至质粒pET28a中,即pET28a-G4-ter㊂重组质粒pBLxys㊁pBLG4,重组地衣芽孢杆菌BLG4由本研究构建㊂1.2㊀工具酶、引物和试剂含DNA聚合酶的Taq和Pfu预混液㊁T4DNA连接酶,Thermo Fisher公司;各种限制性内切酶㊁PCR产物纯化试剂盒㊁质粒提取试剂盒,TAKARA有限公司;引物由上海生物工程有限公司合成,引物序列见表1;酵母粉和蛋白胨,安琪酵母有限公司;其他试剂为国产分析纯或生化试剂㊂表1㊀本研究所使用的引物Table1㊀Primers used in this study引物名称引物序列(5 -3 )a酶切位点PxylF CC AAGCTTTTAAAATCTCTCATTCATAAACCGTTCC HindⅢPxylsR GG GGTACCATGATGATGATGATGATGCG KpnⅠPxylsF GG GGTACCATGAGCCACATCCTGC KpnⅠPterR GCTCTAGAGGGTAAAAAACCATTCACTC XbaⅠ㊀㊀注:a下划线序列为酶切位点1.3㊀DNA操作技术质粒提取㊁DNA片段纯化㊁回收等均参照TAKARA 试剂盒说明书㊂PCR扩增反应㊁DNA琼脂糖凝胶电泳㊁酶切㊁连接以及转化子筛选等均参照分子克隆实验指南[10]㊂1.4㊀木糖诱导分泌表达载体的构建首先以重组质粒pBLSY2为模板,以PxylF㊁Pxy-lsR为引物,扩增含木糖异构酶启动子及其调控蛋白基因和信号肽的基因片段Blxyl-sacBss,反应条件:95ħ10min,95ħ30s,54ħ30s,72ħ2min,30个循环,72ħ10min㊂然后分别同pHY300-PLK经Hind Ⅲ和KpnⅠ酶切后通过胶回收克隆至pHY300-PLK,获得木糖诱导分泌表达的重组质粒pBLxys后转化至E.coli JM109,即E.coli JM109/pBLxys㊂再以pET28a-G4-ter为模板,以引物PxylsF㊁PterR扩增麦芽四糖酶结构基因,反应条件与上述一致,再分别同pHY300-PLK 经KpnⅠ和XbaⅠ酶切后通过胶回收克隆至pBLxys,即为木糖诱导分泌表达麦芽四糖酶的重组质粒pBLG4,经过转化子筛选后,送去测序,测序正确后即获得携带pBLG4重组质粒的E.coli JM109/pBLG4㊂1.5㊀重组地衣芽孢杆菌的构建培养E.coli JM109/pBLxys㊁E.coli JM109/pBLG4,提取重组质粒pBLxys㊁pBLG4后,按文献[13]所述电转方法分别将其转入BLΔAE,从而获得重组地衣芽孢杆菌BLXYLS和BLG4㊂1.6㊀麦芽四糖酶酶活定义及测定麦芽四糖酶酶活力单位(U)定义为:在pH7.0和50ħ的反应条件下,每分钟分解可溶性淀粉生成相当于1μmoL葡萄糖所需的酶量㊂麦芽四糖酶酶活测定方法参照文献[5]㊂1.7㊀发酵优化实验LBG培养基(g/L):葡萄糖10.0,蛋白胨FP321 10.0,酵母粉FM4085.0,NaCl10.0㊂发酵培养基(g/L):麦芽糊精90,蛋白胨FP321 20,酵母粉FM40810,玉米浆干粉5,(NH4)2HPO4 10,K2HPO4㊃3H2O9.12,KH2PO41.36,CaCl20.50, MgSO4㊃7H2O0.50㊂在进行发酵优化实验时,均使用挡板摇瓶进行发酵,发酵前均加入终质量浓度为20mg/L的四环素㊂每组实验做3个平行㊂2㊀结果与分析2.1㊀重组表达载体的构建根据NCBI显示,嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因序列(G4-ter)总长约1.7kbp,编码551个氨基酸,理论上蛋白大小为59.9kDa,而终止子序列总长为0.1 kbp,因此KpnⅠ和XbaⅠ酶切后应获得约1.8kbp 和6.3kbp大小的2条核酸条带㊂Blxyl-sacBss基因片段长度约为1.4kbp,经HindⅢ和KpnⅠ酶切后应获得约6.7kbp和1.4kbp大小的2条核酸条带㊂对获得的克隆宿主E.coli JM109/pBLG4提取重组质粒pBLG4,质粒大小约8.1kbp,构建重组表达载体图见图1㊂然后分别用HindⅢ㊁HindⅢ和KpnⅠ㊁KpnⅠ和XbaⅠ酶切,电泳鉴定结果如图2,结合测序结果,可以充分说明重组表达载体构建正确㊂2.2㊀重组麦芽四糖酶的表达将对照菌BLXYLS和重组菌BLG4分别进行摇瓶发酵,接种后8h均加入10g/L木糖进行诱导,然后继续培养30h,离心后收集发酵液上清,分别检测二者胞外麦芽四糖酶活力㊂结果显示,只有重组菌BLG4检测到活力,而对照菌BLXYLS未检测到活力㊂将二者发酵液上清进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析,结果见图3㊂可以2021年第47卷第1期(总第421期)51㊀52㊀2021Vol.47No.1(Total 421)Blxyl -木糖异构酶启动子及其调控蛋白基因;sacBss -枯草芽孢杆菌果聚糖合酶信号肽基因;G4-嗜糖假单胞菌麦芽四糖酶基因;ter -木糖异构酶基因的终止子图1㊀重组表达载体pBLG4Fig.1㊀Diagram of recombinant expression vector pBLG4M-Maker;1-pBLG4/Hind Ⅲ;2-pBLG4/Hind Ⅲ+Kpn Ⅰ;3-pBLG4/Kpn Ⅰ+Xba Ⅰ图2㊀重组表达载体pBLG4验证电泳图Fig.2㊀Electropherogram of recombinant expression vector pBLG4发现在约60kDa处出现一明显的表达条带,这与理论推测的蛋白大小基本一致,表明重组菌成功地将麦芽四糖酶分泌到了发酵液中㊂M-Maker;1-BLXYLS;2-BLG4图3㊀发酵液上清液SDS-PAGE 电泳图Fig.3㊀SDS-PAGE electropherogram of fermentationbroth supernatant2.3㊀发酵条件优化2.3.1㊀诱导剂添加时间对发酵的影响重组菌接种后,在37ħ㊁250r /min 下进行培养,分别在接种后的8㊁12㊁16㊁20㊁24㊁28㊁32h 取样检测OD 600,并添加10g /L 木糖进行诱导,发酵至24h 时补加30g /L 麦芽糊精,发酵至48h 时添加10g /L 的木糖,然后继续发酵至72h 结束㊂发酵结束后,取样检测OD 600和发酵液中的麦芽四糖酶活力,结果如表2㊁图4所示㊂结果显示,诱导剂添加时间对重组菌生长影响较小,但对发酵结束时胞外麦芽四糖酶酶活有显著影响㊂随着诱导剂添加时间的延迟(8~24h),发酵结束时检测到的胞外酶活呈递增趋势,当发酵24h 添加诱导剂时,发酵结束时胞外酶活力高达(138.2ʃ11.2)U /mL;而当28㊁32h 添加诱导剂时,发酵结束时酶活有所降低㊂事实上,这与木糖操纵子在地衣芽孢杆菌中的转录特性有关,据文献[12-13]报道,在对数生长期到稳定期的转换期间木糖操纵子转录活性显著增加,并且这种较高的转录活性会维持近12h㊂根据检测到的菌体量来看,发酵至24h 后,重组菌的生长速率明显降低,该时间点对应文献中对数生长期到稳定期的转换期间,因此,在发酵24h 时诱导能够检测到较高的麦芽四糖酶酶活㊂2.3.2㊀诱导温度对发酵的影响重组菌接种后,在37ħ㊁250r /min 下进行培养,当培养至24h 时,添加10g /L 木糖进行诱导,并添加30g /L 麦芽糊精,分别转移至25㊁30㊁37㊁42ħ,发酵至48h 时添加10g /L 的木糖和30g /L,然后继续发酵至72h 结束㊂发酵结束后,取样检测OD 600和发酵液中的麦芽四糖酶活力,结果如图5所示㊂可以发现,诱导温度对重组菌生长和产酶均有显著的影响㊂在25~37ħ,随着温度升高,发酵结束后的菌体量也越来越高,而42ħ时,菌体量又有所降低,这说明重组菌最适生长温度为37ħ㊂当诱导温度为30ħ时,胞外酶活力最高可达(161.4ʃ10.4)U /mL,37ħ次之,42ħ时胞外酶活力最低㊂重组菌在温度胁迫下的产酶特性是可以预见的㊂温度低时,菌体整体代谢速率较慢,酶的合成速率也会降低[14]㊂而温度较高时,尽管菌体代谢速率增加,但地衣芽孢杆菌分泌的其他蛋白酶也会增加[15],对重组酶的水解速率也会增加,另外重组酶自身的稳定性也可能有所下降㊂所以,诱导温度变化对重组菌生长和重组酶酶活力均有较大的影响㊂2021年第47卷第1期(总第421期)53㊀表2㊀不同时间添加诱导剂发酵结束时的菌体量Table 2㊀Biomass at the end of fermentation under different induction time诱导剂添加时间/h 8121620242832发酵结束时OD 600值50.2ʃ2.0849.6ʃ3.7050.6ʃ3.2150.8ʃ2.8851.8ʃ3.0453.3ʃ3.6352.1ʃ3.41图4㊀诱导剂不同添加时间对重组菌表达麦芽四糖酶的影响Fig.4㊀Effect of different adding time of inducer on the expression of maltotetraose in recombinant bacteria图5㊀诱导温度对重组菌表达麦芽四糖酶的影响Fig.5㊀Effect of induction temperature on the expression ofmaltotetraose in recombinant bacteria2.3.3㊀发酵时间对发酵的影响根据2.3.1和2.3.2的结果,在37ħ㊁250r /min下对重组菌进行培养,当培养至24h 时,添加2%木糖进行诱导,并转移至30ħ继续发酵㊂诱导后每隔12h 检测菌体量OD 600和麦芽四糖酶酶活㊂结果如图6所示㊂可以看到,发酵至84h 时,胞外检测到的最大酶活力为(168.2ʃ9.41)U /mL,之后酶活力明显开始下降㊂显然,重组地衣芽孢杆菌胞外酶活力开始下降的时间要略晚于稳定期,这与2.3.1小节所记录的特性相符,表明木糖诱导型重组地衣芽孢杆菌发酵至稳定期结束时停止发酵最为合适㊂在后续应用过程中,对重组酶的酶学性质进行了简单研究㊂以淀粉液为化液底物反应时,其最适pH 为7.0,最适反应温度为50ħ,并且在反应48h 后,相对酶活力仍能达50%以上,结合异淀粉酶进行转化,麦芽四糖转化率可达72.4%,其特性与文献报道[5-7]基本一致,表明重组酶的酶学性质未发生明显图6㊀重组地衣芽孢杆菌发酵过程曲线Fig.6㊀Growth and maltotetraose production curves ofrecombinant Bacillus licheniformis改变,有良好的应用前景㊂目前,国内对麦芽四糖酶的发酵还处于基础研究阶段,多见于在大肠杆菌㊁枯草芽孢杆菌中的表达,在地衣芽孢杆菌中的表达未见报道㊂杨亚楠等[7]在以枯草芽孢杆菌表达来源于嗜糖假单胞麦芽四糖酶的表达时,摇瓶水平酶活力可力达147U /mL,本研究摇瓶水平酶活力可达(168.2ʃ9.41)U /mL,较之有所提高,但提高有限㊂多项研究显示,地衣芽孢杆菌胞外蛋白分泌量可达枯草芽孢杆菌的2倍[9],这表明地衣芽孢的表达性能仍未被完全开发,其优势尚未完全发挥,可提升的空间仍然很大㊂据报道[1],美国杰能科公司也是通过重组地衣芽孢杆菌分批补料发酵,表达嗜糖假单胞菌的麦芽四糖酶,根据该酶的比酶活[7]及地衣芽孢杆菌的产酶特性,保守估计其发酵水平应在10000U /mL 左右㊂就本研究结果来看,尽管继续通过发酵优化能够继续提升发酵水平,但提升效果可能有限,还需要充分挖掘地衣芽孢杆菌的表达潜力,提升其表达能力,诸如在密码子偏好性[16],酶蛋白修饰[17],蛋白酶基因继续敲除[18],高效启动子开发[19-20]等方面均可继续进行深入研究㊂3㊀结论本研究利用地衣芽孢杆菌木糖诱导分泌表达载体,对来源于嗜糖假单胞菌麦芽四糖基因进行了表达,重组酶成功地分泌至胞外,能够在发酵液上清液中检测到酶活力,而且目标蛋白大小符合理论大小㊂对重组菌进行了发酵条件优化:在24h 添加诱导剂,诱导温度30ħ,发酵至稳定期结束停止发酵,摇瓶水54㊀2021Vol.47No.1(Total 421)平可高达(168.2ʃ9.41)U /mL㊂参考文献[1]㊀ZANGY,ANDERSEN J H,DINOVI M,et al.Maltotetraohydrolase from Pseudomonas stutzeri expressed in Bacillus licheniformis [M ].71th.Geneva:World Health Organization,2016.[2]㊀唐玉,孙俊良,梁新红,等.麦芽四糖研究新进展[J].河南科技学院学报(自然科学版),2013,41(4):14-16.TANG Y,SUN J L,LIANG H X,et al.New advances in maltote-traose[J ].Journal of Henan Institute of Science and Technology (Natural Sciences Edition),2013,41(4):14-16.[3]㊀赵云.麦芽四糖淀粉酶基因克隆㊁表达及活性研究[D].上海:华东师范大学,2013.ZHAO Y.Cloning,expression and activity study of a α-4-amylase enzyme [D].Shanghai:East China Normal University,2013.[4]㊀ZHOU J H,BABA T,TAKANO T,et al.Properties of the enzyme ex-pressed by the Pseudomonas saccharophila maltotetraohydrolase gene (mta )in Escherichia coli [J].Carbohydrate Research,1992,223:255-261.[5]㊀赵云,朱蓓霖,汪正华,等.麦芽四糖淀粉酶基因优化表达及酶学性质分析[J].中国生物工程杂志,2013,33(5):100-106.ZHAO Y,ZHU B L,WANG Z H,et al.Optimization of expression and the characterization of a α-4-amylase enzyme [J].China Bio-technology,2013,33(5):100-106.[6]㊀张梓芊.来源于Pseudomonas saccharophila 的麦芽四糖生成酶的分泌表达及其结构与性质研究[D].无锡:江南大学,2019.ZHANG Z Q.Secretion expression of maltotetraose-forming amylase from Pseudomonas saccharophila and analysis of its structure and en-zymatic properties[D].Wuxi:Jiangnan University,2019.[7]㊀杨亚楠.Pseudomonas saccharophila 麦芽四糖淀粉酶的重组表达㊁发酵优化及其应用研究[D].无锡:江南大学,2019.YANG Y N.Recombinant expression,fermentation optimization and application of maltotetraose amylase from Pseudomonas saccharophila [D].Wuxi:Jiangnan University,2019.[8]㊀BERG C T,DERKX P M F,FIORESI C,et al.Modified amylase from Pseudomonas saccharophila :Denmark,DK1907538[P].2008-04-09.[9]㊀PHENGNUAM T,SUNTORNSUK W.Detoxification and anti-nutrientsreduction of Jatropha curcas seed cake by Bacillus fermentation [J].Journal of Bioscience and Bioengineering,2013,115(2):168-172.[10]㊀SAMBROOKJ,RUSSELL D W.分子克隆实验指南[M].北京:科学出版社,2008.SAMBROOK J,RUSSELL D W.Molecular Cloning:A LaboratoryManual[M].Beijing:Science Press,2008.[11]㊀LI Y 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Biotechnology,2019,35(3):123-136.[16]㊀ZHOU J W,LIU H,DU G C,et al.Production of α-cyclodextringlycosyltransferase in Bacillus megaterium MS941by systematic co-don usage optimization[J].Journal of Agricultural and Food Chem-istry,2012,60(41):10285.[17]㊀朱静,周健.产碱菌麦芽四糖淀粉酶的化学修饰[J].生物化学与生物物理学报,1995,27(3):299-303.ZHU J,ZHOU J.Chemical modification of maltotetrose-forming am-ylase from Alcaligenes sp.[J].Acta Biochimica Et Biophysica Sini-ca,1995,27(3):299-303.[18]㊀潘力,刘欣,王斌.一种枯草芽孢杆菌重组菌株及其制备方法与应用:中国,CN106085937A[P].2016-06-15.PAN L,LIU X,WANG B.Recombination of Bacillus subtilis and itspreparation method and application:China,CN106085937A [P ].2016-06-15.[19]㊀SONG W,NIE Y,MU X Q,et al.Enhancement of extracellular ex-pression of Bacillus naganoensis pullulanase from recombinant Ba-cillus subtilis :Effects of promoter and host[J].Protein Expressionand Purification,2016,124:23-31.[20]㊀XIAO F X,LI Y R,ZHANG Y P,et al.Construction of a novel sug-ar alcohol-inducible expression system in Bacillus licheniformis [J].Applied Microbiology and Biotechnology,2020,104(12):1-17.Heterologous expression of maltotetraose-forming amylase from Pseudomonassaccharophila in Bacillus licheniformisLOU Zhihua 1,2∗,LIU Xiang 1,ZHANG Jingnan 11(Jiangsu OGO Biotechnology Co.,Ltd.,Changzhou 213300,China)2(Liyang VisionBio Technology Co.,Ltd.,Changzhou 213300,China)ABSTRACT ㊀To investigate the heterologous expression in Bacillus licheniformis and improve the fermentation level of maltotetraose-forming amylase,a xylose-inducible expression system was constructed in B.licheniformis CICIM B1391to express the maltotetraose-form-ing amylase from Pseudomonas saccharophila ,and a preliminary fermentation optimization was conducted.It was observed that maltote-traose-forming amylase was successfully secreted into the fermentation broth induced by xylose.After optimized induction time,temperature and fermentation time,the maximum enzyme activity reached to (168.2ʃ9.41)U /mL in shake flask fermentation.The optimal fermenta-tion conditions were adding the inducer at 24h,the induction temperature of 30ħ,and ending fermentation at the end of stable period.Key words ㊀maltotetraose-forming amylase;Pseudomonas saccharophila ;recombinant expression;fermentation optimization。
异源蛋白诱导方法
异源蛋白诱导方法异源蛋白诱导技术（Heterologous protein induction）是一种常用的生物工程技术，可以用于大量生产和纯化需要的蛋白质。
这种技术可以在细胞内产生被表达的异源蛋白质，这些蛋白质都可以通过特定的培养条件来诱导表达。
本文将介绍一些异源蛋白诱导方法。
1. 培养条件调节法培养条件调节法是最常用的异源蛋白诱导方法之一。
通常，通过调整培养条件，如温度，pH、营养元素、气体浓度等，来诱导表达异源蛋白质。
这种方法适用于小规模生产。
2. 转录调节法转录调节法是一种通过调节基因表达的方法，从而实现异源蛋白的诱导表达。
例如，利用诱导剂如IPTG引导外源基因在表达载体中发挥作用，从而实现异源蛋白的诱导表达。
3. 转化机制调节法转化机制调节法是一种使用化合物调节细胞自身的代谢机制，并促进表达异源蛋白的方法。
例如，静态和销售搅拌的菌落液培养技术可以在发酵过程中提高细胞产量，并促进异源蛋白的表达。
4. 特定细胞系的选择特定细胞系的选择是一个重要的异源蛋白表达方法。
同样的异源蛋白质在不同的宿主细胞中表达可以带来不同的结果。
选择最适合宿主细胞的细胞系能够提高表达效率。
5. 蛋白修饰及纯化蛋白质修饰和纯化是特定的工艺flow，在异源蛋白表达中起着至关重要的作用，不同的蛋白质通常需要不同的纯化流程。
因此，在诱导表达的同时，也需要特别重视蛋白质的纯化。
总结异源蛋白诱导技术是制造高质量蛋白质的重要步骤，同时还需要仔细控制温度、pH、营养元素、气体浓度等条件，采取合理的转录调节、转化机制调节、特定细胞系的选择和蛋白质修饰等方法。
这可以提高蛋白质的表达效率，并使纯化工艺得以成功。
唾液酸转运体蛋白NanT的分子克隆,异源表达及纯化(精)
Hans Journal of Biomedicine 生物医学 , 2016, 6(4, 25-30 Published Online October 2016 in Hans.文章引用 : 黄尚谕 , 史青茹 . 唾液酸转运体蛋白 NanT 的分子克隆,异源表达及纯化 [J]. 生物医学 , 2016, 6(4: 25-30.Molecular Cloning, Heterologous Expression, and Purification of the Sialic Acid Transporter NanTShangyu Huang1,2, Qingru Shi1*1Youth Science and Technology Guide Station of Baoshan District, Shanghai 2Shanghai Xingzhi High School, Shanghai Received: Sep. 21st , 2016; accepted: Oct. 7th , 2016; published: Oct. 10th , 2016Copyright © 2016 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY.AbstractSialic acids are nine-carbon sugar acids, and are found widely distributed in animal tissues. In human, the brain contains high concentration of sialic acids, which are vital for neural transmis-sion. The transport of sialic acids in vivo is carried out by the multi-pass membrane protein, NanT, a membrane of the SLC17 transporter family. The loss of function of NanT will cause salla disease and infantile sialic acid storage disorder.However, the structure and mechanism of the sialic acids transporter remain unknown. In this study, we clone and express the NanT protein. Combining the affinity and size-exclusion chromatography, we obtain the high purity of the target protein. Our results provide a basis for further exploring the structure and mechanism of the sialic acids transporter, NanT. KeywordsSialic Acid, Transporter, Neural Transmission, Salla Disease唾液酸转运体蛋白 NanT 的分子克隆,异源表达及纯化黄尚谕 1,2,史青茹 1*Open Access*通讯作者。
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1 生物实验设计专题练（提高篇） 一、选择题：（每题只有一个答案符合题意）
1．某中学生进行以下实验：2支试管中分别加入等量2％可溶性淀粉溶液，再分别加入等量稀释10倍唾液和不稀释的唾液，再分别滴入1滴碘液，37℃水浴恒温条件下，观察蓝色消失所需时间。结果所需时间几乎相等， 这项实验的目的是 （ ） A．证明唾液含有淀粉酶 B．证明淀粉遇碘变蓝 C．证明淀粉酶具有高效性 D．证明淀粉酶具有专一性 2．某研究性学习小组在进行“调查环境污染对生物的影响”课题研究时，确定了“路边小吃店的污染物对周围树木生长的影响”子课题研究，并制定了研究方案。下列说法不正确的是：A. 该项研究中要研究汽车尾气对树木的生长的影响 B.通过该项研究学会调查研究环境污染对植物影响的基本方法 C.该项研究中要了解小吃店的废水、废气和废弃物对路边树木生长的不利影响 D.该研究方案的内容包括研究目的、研究方法、完成时间、结果预测、结论、报告形式等 3．19世纪，世界上很多著名的科学家试图通过研碎胰腺的方法来获得其中的胰岛素，但都没有获得成功，后来有科学家通过结扎胰管让胰腺退化然后单独研碎胰岛的方法成功获得了其中的胰岛素。下列关于分析失败的原因中，最可能的是 （ ） A．研磨过程中，胰腺中的消化酶把胰岛素分解了 B．研磨时选取的胰腺部分正好不含有胰岛 C．当时研磨技术比较落后，研磨不充分 D．胰岛素和胰腺内的其他物质紧密结合，不容易分离 4．下列实验过程或技术手段中，没有发生细胞之间分离或细胞结构之间分离的项是（ ） A．动物细胞培养 B．观察植物细胞有丝分裂 C．高倍镜观察细胞质流动 D．植物细胞质壁分离和复原实验 5．为了研究高等动物内分泌腺的功能，有人做了下述实验：将体重恰好相等的三只雄性小狗分别编号为A、B、C。A狗不作任何处理，该狗发育下常。而对B、C两只狗分别进行了不同的处理，四个月后，A狗发育成熟了。对三只狗进行血液分析，得到实验数据如下： 分析表中的数据不能得到的推测是 （ ）
实验狗 雄性激素 （微克/100克血） 甲状腺素 （微克/100克血） 生长激素 （微克/100克血） A 4 3 6 B 3.5 0.0 5.8 C 3.8 2.8 0.1 A． A狗用作对照实验 B．B狗被切除了甲状腺和胰腺 C．C狗被切除了垂体 D．经较长时间后，C狗血液中的雄性激素与甲状腺激素也会减少 6． 右图是《观察SO2对植物的影响》的实验装置，观察 植物在SO2浓度为28mg/m3的环境下的影响。下列说法中， 与此实验不符的是 （ ） A 实验前植物幼苗需要阳光照射 B植物叶片首先受害的是成熟叶 C 植物受害程度与植物接触SO2的时间成正比 D植物受害程度与玻璃罩中SO2的浓度成反比 7．在实验条件下，测试 某种恒温动物离体细胞的呼吸强度（E）受温度变化的影响，正确结果是： 2
8．实验室现有四瓶失去标签的蔗糖溶液(编号为A、B、C、D)，已知四瓶蔗糖溶液的浓度都不同。现利用半透膜袋进行渗透实验，装置如下图，一段时间后半透膜袋①和③变得胀硬，半透膜袋②萎缩。四种蔗糖溶液中浓度最低的是 ( ) A.蔗糖溶液A B.蔗糖溶液B C.蔗糖溶液C D.蔗糖溶液D
9．将某绿色植物放在特定的实验装置内，研究温度对光合作用与呼吸作用的影响(其余的实验条件都是理想的)，实验以CO2的吸收量与释放量为指标。实验结果如下表所示。 温 度 (℃) 5 10 15 20 25 30 35 光照下吸收CO2(mg/h) 1.00 1.75 2.50 3.15 3.75 3.50 3.00
黑暗中释放CO2(mg/h) 0.50 0.75 1.25 1.75 2.25 3.00 3.50
昼夜不停地光照，温度在35℃时该植物能否生长？ （ ） A.能生长 B.不能生长 C.不能确定 D.白天生长晚上不生长 10．在观察植物细胞的质壁分离和复原的过程中，某同学在视野中 看到生活着的洋葱表皮细胞正处在右图状态，a、b表示两处溶液的 浓度，由此可能作出的推测是 （ ） A、此时a>b，细胞渗透吸水 B、此时a=b，渗透系统保持平衡 C、此时a二、非选择题部分 1．以下是某同学关于 酶特性的实验操作步骤， 请根据要求回答： （1）若该实验的目的是验证酶作用的专一性，则步骤4可以选用 或 两种不同类别的酶。 （2）如果按上述步骤进行操作，分析A、B可能出现的现象及原因： 现象： 原因： （3）该实验步骤中存在明显的缺陷，请写出正确的操作步骤（注：可直接用上表步骤中的 数字表示，需增加的步骤用文字表述）： 2．探究酸碱度对酵母菌酒精发酵酶促反应速度的影响 实验用具：烧杯、注射器8支、带有橡皮塞抽去空气的试管4支、干酵母粉、蔗糖、配 制好的pH分别为5、6、7、8的缓冲液 实验步骤：①用开水配制10%蔗糖溶液100mL，冷却到室温（26℃）后，加入4克干酵母粉，10min后 ……依次完成步骤②③④⑤，观察并记录。
步 骤 1 操作方法 试 管
Ⅰ Ⅱ 1 注入可溶性淀粉溶液 2mL —
2 注入蔗糖溶液 — 2mL 3 注入斐林试剂 2mL 2mL 4 注入新鲜的某种酶溶液 2mL 2mL 5 酒精灯隔水加热 煮沸1min
6 观察现象 A B 3
实验记录：产生2mL气体体积量 （以针筒推柄上升的mL数为产气量， 见右图）所需要的时间如下表： （1）完成实验步骤： ② ③ ④ ⑤ （2）实验结论： （3）回答问题： ①实验过程中为什么要等到蔗糖溶液冷却后再加入干酵母粉？
②为什么要用注射器吸取溶液注入试管内？ 3．同学甲从一本《植物生理学》中查到“幼嫩叶片可产生生长素，生长素可阻止叶柄脱落”的结论。于是他设计了一个实验，想证实该结论。他设计的实验步骤为： 第一步：取一盆生长状况良好的植物，去掉幼叶的叶片（如图所示）； 第二步：观察幼叶叶柄的脱落情况。 同学乙在仔细研究了甲的实验设计方案后，向他提出了两点意见。请你用所学的生物学知识，把同学乙提出的意见补充完整： （1）在去掉幼叶的同时，还必须 ，因为 。 （2）应增加一个对照实验，对照设置为：取同一品种、生长状况相同的植物；然后 ，观察幼叶叶柄的脱落情况。以此对照实验来说明 。 4．苍耳是短日照植物，短日照可诱导短日植物开花，用3株苍耳(每株均有两个分枝A和B)，A枝持续光照，B枝给于短日照并改变叶的数目，下面图表为实验处理及其结果。 组别 实验过程图解 实验处理 枝条保留的叶片数 开花反应
Ⅰ A持续光照 全部 √
B短日照 全部 √
Ⅱ A持续光照 全部 √ B短日照 1/6片叶 √
Ⅲ A持续光照 全部 × B短日照 0 × (1)该实验的结论是_________________________________________________。 (2)再设计一个实验，用植物嫁接的方法，进一步论证上述结论。___________________。 (3)从你的实验结果中得出了何种推论?____________________。 5．生物实验室里，有下列试剂供实验时选用： A、10-8mol/L吲哚乙酸 B、10-4mol/L秋水仙素菜 C、0.14g/mL龙胆紫溶液 D、15%HCl溶液 E、0.5g/mL蔗糖溶液 F、冷酒精 G、0.14mol/LnaCl溶液 （1）分别用上述7种试剂处理小麦幼苗30min观察，经哪些试剂处理后仍有生活力？ （2）欲观察洋葱根尖细胞染色体，应选用试剂 （3）能促使插条生根的试剂是 （4）欲使单倍体水稻结实，应选用试剂
pH pH=5 pH=6 pH=7 pH=8 时间（s） 8 7 6 7.5 4 （5）用于提纯DNA的试剂
6．下面是4组实验材料：①无色洋葱头，紫色洋葱头 ②白萝卜，胡萝卜 ③鲤鱼的卵巢，精巢 ④黄瓜叶，黄瓜（果实部分） ⑤拟南芥（植株小，十字花科植物）姚树，请回答 （1）用①代质壁分离实验材料，最好用 ，因为 。 （2）用②作可溶性糖的鉴定，最好用 因为 （3）用③作DNA的粗提取实验材料，最好用 因为 （4）用④作叶绿体中色素的提取和分离最好用 ，因为 （5）用⑤作遗传实验材料，最好用 因为 7．根据实验原理和材料用具，设计实验选择运载体质粒，明确质粒的抗菌素基因所抗的抗菌素类别。 ①实验原理：作为运载体的质粒，须有标记基因，这一标记基因是抗菌素抗性基因。故凡有抗菌素抗性的细菌，其质粒才可用作运载体。 ②材料用具：青霉素、四环素的10万单位溶液、菌种试管、灭菌的含细菌培养基的培养皿、酒精灯、接种环、一次性注射器、蒸馏水、恒温箱。 ③方法步骤：⑤⑥ 第一步：取三个含细菌培养基的培养皿并标为1、2、3号，在酒精灯旁，用三支注射器，分别注入1mL蒸馏水、青霉素液、四环素液，并使之分布在整个培养基表面。 第二步： 。 第三步： 。 ④预期结果：A、 。 B、 。 C、 。 8．某同学由温度能影响酶的活性联想到温度能否影响甲状腺素的活性。为了探索这一问题，他做了一个实验。在实验步骤(1)、(2)、(3)中各有一处错误或不妥之处，请改正并预测实验现象及结论。实验步骤: (1)取三只相同的洁净玻璃缸，编上号，分别装上等量的蒸馏水、河水、自来水。 (2)取发育状况不同的15只蝌蚪，分成三等份，分别放人1、2、3号玻璃缸中，三只玻璃缸放在相同的适宜外界条件下培养。 (3)每天同时向1、2、3号玻璃缸中分别投入普通饲料、甲状腺制剂拌匀的饲料、用60℃温水处理1小时的甲状腺制剂拌匀的饲料。(4)过几天比较蝌蚪的发育状况。 改正： 预测实验现象及结论： 9．用2％的秋水仙素处理植物分生组织5～6小时，能够诱导细胞内染色体加倍。那么，用一定时间的低温（如40C）处理水培的洋葱根尖时，是否也能诱导细胞内染色体的加倍呢？请对这个问题进行实验探究。 （1）针对以上问题，你作出的假设是： ，你提出此假设的依据是 。 （2）低温处理植物材料时，通常需要较长时间才能产生低温效应。根据这个提示将你设计的实验组合以表格的形式列出来。 （3）按照你的设计思路，以 作为鉴别低温是否诱导细胞内染色体加倍的依据。为此，你要进行的具体操作是： 第一步：剪取根尖2～3mm. 第二步：按照 ―― ―― ―― 步骤制作 。 10、“霜叶红于二月花”的美丽景色，是由于成片的黄栌或枫叶片逐渐变红形成的。假若你是研究性学习小组的成员，请你利用暑假对这一自然现象产生的原因进行实验探究。 实验假设：叶片变红现象受温度影响 （1）围绕该实验假设，有的同学主张在实验前，需要搜集有关资料，才能对实验组的温度进行设置，该“有关资料”应为 。 实验材料：盆栽的黄栌或枫树、透明的恒温箱等实验用具。 （2）实验步骤： （3）实验结果预测及结论：