免疫组化抗原修复简介PPT参考幻灯片共23页文档
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免疫组织化学技术-PPT精选文档
3、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法 利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上 荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在 荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发 光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中 某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光 技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊 断、检验中应用较广。
2）免疫酶标方法 是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶 的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗 粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成 分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。
本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是： 定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于 光、电镜研究等。 免疫酶标方法目前在病理诊断中广为 使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检测系统等. 。
4、被检测的物质
组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、 多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病 原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
5、从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与 Western blotting、ELISA的异同
1）Western blotting：蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗 原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品 内蛋白含量的检测方法。与免疫组化技术相比，定量可能 更加准确；当然Western blotting也可定性和定位（通 过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量 ，进而间接反映它们的定位），但敏感性远远低于免疫组 化技术。 2）ELISA：酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原 结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。 与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首 选方法之一。
免疫荧光组化技术PPT课件
详细描述
抗体不结合的原因可能包括抗体选择不当、抗体浓度过低、抗体保存不当或抗原 处理不当等。为解决此问题，应确保选择适合的抗体，适当增加抗体浓度，正确 保存抗体，并优化抗原处理条件，如采用适当的抗原修复方法。
染色不均问题
总结词
染色不均一是指免疫荧光组化染色过程中出现的非特异性染色问题，影响结果的解释。
详细描述
染色不均的原因可能包括抗体孵育时间过长、抗体浓度过高、组织切片厚度不均或组织中内源性酶的存在等。解 决此问题的方法包括控制抗体孵育时间、调整抗体浓度、确保组织切片厚度一致以及通过灭活内源性酶来减少背 景染色。
荧光淬灭问题
要点一
总结词
荧光淬灭是指在免疫荧光组化染色过程中，荧光信号的强 度减弱或消失的现象。
05
案例分享与结果展示
案例一：肿瘤标志物检测
肿瘤标志物检测
利用免疫荧光组化技术检测肿瘤细胞表面或内部的抗原，以辅助肿 瘤诊断和预后评估。
技术流程
固定、切片、抗原修复、阻断、一抗孵育、荧光二抗孵育、洗涤、 封片。
结果展示
通过荧光显微镜观察，可以清晰地看到肿瘤细胞表面的抗原表达，为 肿瘤诊断提供有力证据。
将抗体与荧光物质结合，以便在 显微镜下观察到荧光信号。选择 适当的荧光标记，如FITC、Cy3 等，确保信号的稳定性和敏感性 。
荧光显微镜观察
荧光激发
使用适当的光源激发荧光标记， 以产生荧光信号。
信号采集
使用高灵敏度的相机或CCD设备， 捕捉荧光信号并将其转换为数字信 号。
图像分析
对采集到的数字信号进行图像处理 和分析，提取所需的信息。
适当延长孵育时间，使抗体与抗原充分结合，提 高荧光信号的强度。
降低背景噪声
抗体不结合的原因可能包括抗体选择不当、抗体浓度过低、抗体保存不当或抗原 处理不当等。为解决此问题，应确保选择适合的抗体，适当增加抗体浓度，正确 保存抗体，并优化抗原处理条件，如采用适当的抗原修复方法。
染色不均问题
总结词
染色不均一是指免疫荧光组化染色过程中出现的非特异性染色问题，影响结果的解释。
详细描述
染色不均的原因可能包括抗体孵育时间过长、抗体浓度过高、组织切片厚度不均或组织中内源性酶的存在等。解 决此问题的方法包括控制抗体孵育时间、调整抗体浓度、确保组织切片厚度一致以及通过灭活内源性酶来减少背 景染色。
荧光淬灭问题
要点一
总结词
荧光淬灭是指在免疫荧光组化染色过程中，荧光信号的强 度减弱或消失的现象。
05
案例分享与结果展示
案例一：肿瘤标志物检测
肿瘤标志物检测
利用免疫荧光组化技术检测肿瘤细胞表面或内部的抗原，以辅助肿 瘤诊断和预后评估。
技术流程
固定、切片、抗原修复、阻断、一抗孵育、荧光二抗孵育、洗涤、 封片。
结果展示
通过荧光显微镜观察，可以清晰地看到肿瘤细胞表面的抗原表达，为 肿瘤诊断提供有力证据。
将抗体与荧光物质结合，以便在 显微镜下观察到荧光信号。选择 适当的荧光标记，如FITC、Cy3 等，确保信号的稳定性和敏感性 。
荧光显微镜观察
荧光激发
使用适当的光源激发荧光标记， 以产生荧光信号。
信号采集
使用高灵敏度的相机或CCD设备， 捕捉荧光信号并将其转换为数字信 号。
图像分析
对采集到的数字信号进行图像处理 和分析，提取所需的信息。
适当延长孵育时间，使抗体与抗原充分结合，提 高荧光信号的强度。
降低背景噪声
免疫组化PPT精选课件
20
2. B 细胞
● 静止B细胞 SIg(G、M、D), CD19-22、CD24、 Ia（HLA-D）
● 活化B细胞 CD23（Blast-2, BCGF) CD25(IL-2R)
● 其他标志 CD80、CD86
21
3.NK细胞
CD11b、CD11c、CD16、CD35、CD57、CDw122等
38
四. 肿瘤的病理诊断
39
㈠ 组织相ed marker)
又称组织特异性标志物 ( specific tissue marker) 用于区分肿瘤的组织来源
40
表1. 上皮细胞常用标志物
------------------------------------------------------------------------------
45
2.间叶组织类抗原
间叶细胞性: 波形蛋白（Vm）－ 间叶性肿瘤
Vm ( 结肠间质 )
Vm ( 恶性纤维组织细胞瘤 ) 46
肌源性: 结蛋白( Dm ) － 肌源性肿瘤 肌动蛋白( actin ) － 肌源性肿瘤 肌凝蛋白( myosin )－ 骨骼肌 肌红蛋白( myoglobin，MGB )－ 横纹肌肿瘤
29
● 移植物排异反应 血管壁 － IgG、C3沉积 肾小球 － 复发性肾炎
● 其他自身免疫性疾病 混合性结缔组织病：血管、 肾小球内IgG、C3沉积 硬皮病：结缔组织、 血管壁IgG沉积
硬皮病 30
三. 修复、纤维化机制的研究
肉芽组织是不完全性修复的物质基础
31
常见疾病
A粥样硬化 － 冠心病 肝硬化 － 肝昏迷、上消化道大出血 肾小球硬化 － 肾功能衰竭 肺纤维化 － 肺心病、肺性脑病
2. B 细胞
● 静止B细胞 SIg(G、M、D), CD19-22、CD24、 Ia（HLA-D）
● 活化B细胞 CD23（Blast-2, BCGF) CD25(IL-2R)
● 其他标志 CD80、CD86
21
3.NK细胞
CD11b、CD11c、CD16、CD35、CD57、CDw122等
38
四. 肿瘤的病理诊断
39
㈠ 组织相ed marker)
又称组织特异性标志物 ( specific tissue marker) 用于区分肿瘤的组织来源
40
表1. 上皮细胞常用标志物
------------------------------------------------------------------------------
45
2.间叶组织类抗原
间叶细胞性: 波形蛋白（Vm）－ 间叶性肿瘤
Vm ( 结肠间质 )
Vm ( 恶性纤维组织细胞瘤 ) 46
肌源性: 结蛋白( Dm ) － 肌源性肿瘤 肌动蛋白( actin ) － 肌源性肿瘤 肌凝蛋白( myosin )－ 骨骼肌 肌红蛋白( myoglobin，MGB )－ 横纹肌肿瘤
29
● 移植物排异反应 血管壁 － IgG、C3沉积 肾小球 － 复发性肾炎
● 其他自身免疫性疾病 混合性结缔组织病：血管、 肾小球内IgG、C3沉积 硬皮病：结缔组织、 血管壁IgG沉积
硬皮病 30
三. 修复、纤维化机制的研究
肉芽组织是不完全性修复的物质基础
31
常见疾病
A粥样硬化 － 冠心病 肝硬化 － 肝昏迷、上消化道大出血 肾小球硬化 － 肾功能衰竭 肺纤维化 － 肺心病、肺性脑病
免疫组化抗原修复
浅谈免疫组化抗原修复
病理科
一、定义
组织在制作过程中，由于化学试剂的作用 封闭了抗原，又由于热的作用致使部分抗 原的肽链发生扭曲，致使在免疫组化的染 色过程中不能将其显示出来，为了解决上 述的问题，利用化学试剂和热的作用将这 些抗原重新暴露出来或修正过来的过程称 为抗原修复。
二、抗原修复的目的
在免疫组化染色后的镜下观察中，有发现这样 的结果，阳性物反应不强，时隐时现，表达不 均匀，有时可出现假阴性，这是因为： 1、 组织在用甲醛固定的过程中所形成的醛键可封 闭抗原的决定簇。甲醛与组织蛋白质类的反应 是多样而复杂的，因为它能和多种不同的功能 基团结合，在多数情况下在其间形成桥键8。这 也是甲醛的一个作用，因为它是一种聚合固定 剂，因而能在相邻的蛋白质键间形成桥键的作 用。
3、抗原修复时有效温度所需持续时间 所需持续时间根据各单位的设备条件以及使用的 仪器不同，抗原修复时在有效的温度范围内所持 续的时间也不一样。例如：真空负压抗原修复法， 当达到预定的温度和所需的负压（66.7KPa）后 可持续5-10分钟，微波辐射抗原修复法温度不好 控制，抗原修复液容易沸腾，如果切片附贴任凭 其沸腾持续5-10分钟。如果切片附贴很牢固，为 了防止脱片，一发现抗原液已沸腾，即可关掉电 源，待温度下降后，又可重开电源。如此反复数 次，使之持续10分钟。
2、抗原修复时应选择最佳温度。
• 据Masson等研究表明：70℃－90℃的温度对没 有经固定的蛋白可发生变性，但经福尔马林固定 的蛋白，要使其发生变性，温度必须在92℃↑。据 实验认为温度在92℃－98℃是合适的，尤其在 95℃为最好，这是因为：①这种温度未达沸腾， 切片不容易脱离裁片；②能够解离和破坏与蛋白 交联的甲醛醛键等，处理时可以随意选择和确定 抗原修复的作用时间。
病理科
一、定义
组织在制作过程中，由于化学试剂的作用 封闭了抗原，又由于热的作用致使部分抗 原的肽链发生扭曲，致使在免疫组化的染 色过程中不能将其显示出来，为了解决上 述的问题，利用化学试剂和热的作用将这 些抗原重新暴露出来或修正过来的过程称 为抗原修复。
二、抗原修复的目的
在免疫组化染色后的镜下观察中，有发现这样 的结果，阳性物反应不强，时隐时现，表达不 均匀，有时可出现假阴性，这是因为： 1、 组织在用甲醛固定的过程中所形成的醛键可封 闭抗原的决定簇。甲醛与组织蛋白质类的反应 是多样而复杂的，因为它能和多种不同的功能 基团结合，在多数情况下在其间形成桥键8。这 也是甲醛的一个作用，因为它是一种聚合固定 剂，因而能在相邻的蛋白质键间形成桥键的作 用。
3、抗原修复时有效温度所需持续时间 所需持续时间根据各单位的设备条件以及使用的 仪器不同，抗原修复时在有效的温度范围内所持 续的时间也不一样。例如：真空负压抗原修复法， 当达到预定的温度和所需的负压（66.7KPa）后 可持续5-10分钟，微波辐射抗原修复法温度不好 控制，抗原修复液容易沸腾，如果切片附贴任凭 其沸腾持续5-10分钟。如果切片附贴很牢固，为 了防止脱片，一发现抗原液已沸腾，即可关掉电 源，待温度下降后，又可重开电源。如此反复数 次，使之持续10分钟。
2、抗原修复时应选择最佳温度。
• 据Masson等研究表明：70℃－90℃的温度对没 有经固定的蛋白可发生变性，但经福尔马林固定 的蛋白，要使其发生变性，温度必须在92℃↑。据 实验认为温度在92℃－98℃是合适的，尤其在 95℃为最好，这是因为：①这种温度未达沸腾， 切片不容易脱离裁片；②能够解离和破坏与蛋白 交联的甲醛醛键等，处理时可以随意选择和确定 抗原修复的作用时间。
免疫组化技术 ppt课件
笨，没有学问无颜见爹娘 ……” • “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
一.发展简史
1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检测 肺组织内的肺炎双球菌获得成功。
60年代 Akanke建立酶标抗体技术——铁蛋白 标记Ab技术。
70年代 Stemberger 改良上述技术，建立辣根 过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP）技术， 使免疫细胞化学得到广泛应用。
ppt课件
12
免疫组化染色观察模型大鼠治疗后粘膜EGF表达情况
正常组
模型组
低剂量组
中剂量组
ppt课件
高剂量组
雷尼替丁组
13
免疫组化染色观察模型大鼠治疗后粘膜EGFR表达情况
正常组
模型组
低剂量组
中剂量组
ppt课件
高剂量组
雷尼替丁组
14
结论
EGF和EGFR在胃溃疡粘膜表达强度呈 平行变化,表示药物在治疗胃溃疡过程 中,可能通过促进EGF与EGFR表达、进 而促进粘膜的修复过程。
ppt课件
8
三 免疫组化的基本流程
1.染色前处理
5.一抗孵育
22..细细胞胞通通透透、、封封 闭闭内内源源性性过过氧氧化化 物物酶酶
3.抗原修复、暴 露抗原决定簇
4.封闭非特异性 蛋白
6.二抗孵育 7.染色 8.显色
ppt课件
9
染色前处理
主要包括取材、脱水、浸蜡，福尔马林固定，防 脱片处理，以及脱蜡与水化。脱蜡与水化的目的是确 保抗体等其他试剂能够充分与组织中抗原等结合发生 反应。若脱蜡和水化不全容易产生非特异性背景着色。
免疫组化技术
ppt课件
1
主要内容
一.免疫组化的发展简史 二.免疫组化的原理 三.免疫组化的基本流程 四.免疫组化在药理学中的应用
一.发展简史
1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检测 肺组织内的肺炎双球菌获得成功。
60年代 Akanke建立酶标抗体技术——铁蛋白 标记Ab技术。
70年代 Stemberger 改良上述技术，建立辣根 过氧化物酶——抗体过氧化物酶（PAP）技术， 使免疫细胞化学得到广泛应用。
ppt课件
12
免疫组化染色观察模型大鼠治疗后粘膜EGF表达情况
正常组
模型组
低剂量组
中剂量组
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高剂量组
雷尼替丁组
13
免疫组化染色观察模型大鼠治疗后粘膜EGFR表达情况
正常组
模型组
低剂量组
中剂量组
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高剂量组
雷尼替丁组
14
结论
EGF和EGFR在胃溃疡粘膜表达强度呈 平行变化,表示药物在治疗胃溃疡过程 中,可能通过促进EGF与EGFR表达、进 而促进粘膜的修复过程。
ppt课件
8
三 免疫组化的基本流程
1.染色前处理
5.一抗孵育
22..细细胞胞通通透透、、封封 闭闭内内源源性性过过氧氧化化 物物酶酶
3.抗原修复、暴 露抗原决定簇
4.封闭非特异性 蛋白
6.二抗孵育 7.染色 8.显色
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9
染色前处理
主要包括取材、脱水、浸蜡，福尔马林固定，防 脱片处理，以及脱蜡与水化。脱蜡与水化的目的是确 保抗体等其他试剂能够充分与组织中抗原等结合发生 反应。若脱蜡和水化不全容易产生非特异性背景着色。
免疫组化技术
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1
主要内容
一.免疫组化的发展简史 二.免疫组化的原理 三.免疫组化的基本流程 四.免疫组化在药理学中的应用