灰色链霉菌产链霉素汇报、汇总.
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发酵工程制药实验-链霉菌发酵
实验2灰色链霉菌的活化一、实验目的学习制备高氏一号斜面培养基的方法以及斜面接种技术。
二、实验原理高氏一号斜面培养基是一种合成培养基，用于培养放线菌。
三、实验试剂与仪器1. 菌种：灰色链霉菌；2. 培养基：可溶性淀粉20g，硝酸钾1 g，氯化钠0.5 g，磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，琼脂20 g，水1000毫升，PH7.2—7.4（配制时注意，可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以上培养基中）；3. 器材：天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、18mL×180mL试管、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。
四、实验步骤1. 高氏一号培养基的制备（1）按配方称量药品，加热搅拌至琼脂完全熔化，补水至1000mL。
趁热分装于18mL×180mL试管，斜面以8mL为宜。
（3）分装完毕后，塞好棉塞并将试管捆扎好。
高压蒸汽灭菌：121℃灭菌20min，灭菌后趁热摆斜面。
2. 斜面接种接种是将纯种微生物，在无菌操作条件下，移植到已灭菌并适宜该菌生长繁殖所需要的培养基中。
为了获得微生物的纯种培养，要求接种过程中必须严格进行无菌操作。
一般是在无菌室内，超净工作台或实验台酒精灯火焰旁进行。
（1）左手拿试管菌种，右手拿接种环，先将金属环烧灼灭菌，再将接种环在空白培养基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻。
（2）左手将试管菌种放下，拿起斜面培养基。
在火焰旁用右手小指和手掌边缘拔下棉塞并夹紧，迅速将接种环伸入空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。
划线时由底部向上划一直线，一直划到斜面的顶部。
注意勿将培养基划破，不要使菌体沾污管壁。
（3）灼烧试管口，在火焰旁将棉塞塞上。
接种完毕，接种环上的余菌必须灼烧灭菌后才能放下。
（4）斜面置于28℃恒温箱中，培养5～6d观察结果。
实验3 灰色链霉菌的摇瓶种子制备一、实验目的学习制备摇瓶种子培养基的方法以及种子扩大培养技术。
链霉素
药物说明
01
药理作用
02
药代动力学
03
用法用量
04
注意事项
06
适应症
05
不良反应
药物相互作用
禁忌
制剂
药理作用
链霉链霉素是一种氨基糖苷类药。其作用机制是作用于细菌体内的核糖体，抑制细菌蛋白质合成，并破坏细 菌细胞膜的完整性。敏感菌具有氧依赖性抗生素跨膜转运系统，链霉素可首先经被动扩散通过细胞外膜孔蛋白， 然后经此转运系统通过细胞膜进入细胞内，并不可逆地结合到分离的核糖体30S亚基上，导致A位的破坏，进而:
物化性质
外观与性状：白色无定形粉末 密度：1.98g/cm3 沸点：872.9ºC at 760mmHg 闪 点 ： 4 8 1 . 7 ºC 储存条件：库房通风低温干燥，与食品原料分开储运 稳定性：链霉素为白色无定形粉末，有吸湿性。易溶于水，不溶于大多数有机溶剂，强酸、强碱条件下不稳 定。硫酸链霉素制剂外观为黄色粉末，密度0.38g/L，pH1.5～3.5，易溶于水，呈微酸性，在中性和酸性条件下 稳定，碱性条件下易失效。
不良反应
过敏反应
链霉素与双氢链霉素均可和血清蛋白质结合形成全抗原，但所产生的抗体不同，因此无交叉反应，对链霉素 过 敏 者 可 用 双 氢 链 霉 素 。 然 而 有 对 二 者 均 过 敏 史 ， 颇 须 注 意 。 过 敏 反 应 包 括 ： 皮 疹 （ 0 . 3 % ～ 11 % ） ， 可 表 现 为 斑 丘疹、荨麻疹、红斑、麻疹样皮疹、猩红热样皮疹、天疱疮样皮疹、湿疹样皮疹、紫癜及血管神经性水肿等皮肤 表现。严重者可发生过敏性休克，严重过敏者反应还可并发急性溶血性贫血、血红蛋白尿、休克、急性肾功能衰 竭等。
该品可引起过敏反应，以皮疹、发热、嗜酸粒细胞增多较为多见。皮疹的发生率自0.3%～10%（平均5%） 不等，多在开始治疗后7～9天发生，但以往曾接受链霉素治疗的患者可在数小时内迅速出现。最多见者为斑丘疹， 伴有痒感，一般持续5～10日后消退；少数可发展为剥脱性皮炎，停药后则于1～3日内迅速消退。较少见的皮疹 有荨麻疹、红斑、麻疹样皮疹、猩红热样皮疹、天疱疮样皮疹、湿疹样皮疹等，亦可伴血管神经性水肿或紫癜。 经常与链霉素接触的医务工作者，药厂分装工人，以及外用该品者常可发生接触性皮炎，一般于接触后3～12个 月发生；皮疹多出现于两手、手背、眼睑、颈部等处，表现为皮肤发红、搔痒、丘疹、眼皮肿、眼睑湿疹等，停 止接触后即可消退。故该品局部应用已无人问津。该品也可导致过敏性休克，部份患者可能在特异性体质基础上 发生类似症状。患者用药剂量往往不大，大多于注射后1～2分钟出现突然发作的呼吸困难，面色苍白，青紫、昏 迷、抽搐、口吐白沫、大小便失禁等。患有呼吸道感染的儿童较多见。该品所引起的过敏性休克，其发生率虽较 青霉素所致者为低，但见诸国内报告者已不下百例，因休克而死亡者亦不在少数，已引起人们高度警惕。神经系 统：链霉......
链霉素发酵提取工艺
链霉素研究现状
链霉素(Streptomycin)是1944年发现的第一个氨基糖贰类 抗生素，也是继青霉素后的第二个重要抗生素一般认为链霉素 是治疗结核杆菌感染的首选药物，除此以外，还用于治疗革兰 氏阴性菌所引起的泌尿道感染、结核性脑膜炎、鼠疫、肠道感 染、肺炎、败血症、百日咳等。链霉素的缺点是容易产生耐药 性，长期使用对第八对脑神经有毒害。
小罐种子培养36±0.5℃，24-30h转速60-300rpm， 搅拌功率5.5kw通气量2m3/min,罐压0.03Mpa
中罐种子培养36±0.5℃，25h转速60-240rpm接种 量15%通气量1.5VVM罐压0.03Mpa搅拌功率22kw 大罐发酵36±0.5℃，136h转速60-130rpm接种量 15%通气量0.75VVM罐压0.04Mpa搅拌功率115kw
链霉素的发酵工艺
链霉素结构的图片
1、概 述
链霉素（streptomycin）是一种氨基葡萄糖型抗生素， 分子式C21H39N7O12。
1943年美国 S.A.瓦克斯曼从链霉菌中分离得到，是 继青霉素后第二个生产并用于临床的抗生素。它的抗结核 杆菌的特效作用，开创了结核病治疗的新纪元。从此，结 核杆菌肆虐人类生命几千年的历史得以有了遏制的希望。
17 、儿童 是中心 ，教育 的措施 便围绕 他们而 组织起 来。上 午7时5 分23秒 上午7时 5分07: 05:232 1.7.21
2、Our destiny offers not only the cup of despair, but the chalice of opportunity. (Richard Nixon, American President )命运给予我们的不是失望之酒，而是机会之杯。二〇二一年六月十七日2021年6月17日星期四
链霉素
三 经Flow-Cel超滤技术处理后的发酵滤液后
还可以用专利性的Nano－flo纳滤技术进一 步浓缩到所需的浓度。Nano－flo纳滤技术 不同于传统意义上的反渗透技术。它既可以 使链霉素完全被截流，又可以用无机盐透析， 减少渗透压，从而有利于浓缩过程的进行， 使链霉素浓度达到相当高的水平。因此，在 节省成本、增加收率的同时，减少了产品在 母液及其他废液中的损失，有利环境保护。
关于链霉素的发酵工艺
郑超 薛雅娴 郑忠巧
链霉素的定义
• 链霉素（Streptomycin）是瓦克斯曼 〔Waksman S.A.)于 1944 年从灰色链霉 菌 （Streptomyces,griseus）培养液中分离出来 的一种碱性抗生素。链霉素是一种 相当强 的有机碱，也是一种多糖类化合物。其分 子结构是由链霉肌、链霉糖和 N-甲基-L-葡 萄糖胺三部分以苷键相联结而成的。链霉 素碱稳定性特别差，工业 产品主要是其硫 酸盐形式， 即硫酸链霉素(Streptomycin Sulfate)。
谢 谢 观 赏
链霉素结构的图片
链霉素极其衍生物的化学结构式图
双氢链霉素
链霉素
硫酸链霉素ຫໍສະໝຸດ 链霉素的作用机理及范围• 机理：链霉素是一种氨基糖苷类药，经主动转运通过
细菌细胞膜，与细菌核糖体30S亚单位的特殊受体 蛋白结合，干扰信息核糖核酸与30S亚单位间起始 复合物的形成，抑制蛋白合成。使DNA发生错读， 导致无功能蛋白质的合成；使多聚核糖体分裂而失 去合成蛋白的功能，使大量氨基糖苷类进入菌体， 细菌细胞膜断裂，细胞死亡。 • 应用：链霉素抗菌范围广，对结核杆菌有显著的抑 菌和杀菌作用；可以治疗结核病，但因易复发，复 发后结核病菌有抗药性，所以常与其他抗结核药物 合用来减少抗药性的产生。在农业上，链霉素可有 效防治植物细菌病害。
链霉素
链霉素生产工艺流程
菌种选取： 生产菌株多采用灰色链霉菌、比基尼 链霉菌和灰色、链霉菌等。灰色链霉 菌的孢子梗直而短，不呈螺旋形，孢 子数量很多，孢子乃断 裂而成，呈椭 圆形，气生菌丝和孢子均呈白色，单 菌落生长丰满，呈梅花型。或馒头型， 直径为 3~4mm，基质菌丝透明，在斜 面背后产生淡色色素。可以通过各种 物理化学方法进行诱变为营养缺陷型 高产菌株。
链霉素生物合成调节机制
在链霉素生物合成中的调节机制主要有发 酵阶段的转变、分解产物的调节以及无机 磷的反馈抑制等方面。
1.发酵阶段的转变 催化链霉胍的2个转脒基反应的酶，在合成阶段开始时 的突然出现是由于新的蛋白质的合成，而不是蛋白质的 激活。 2.分解代谢产物的调节 在发酵过程中，除形成链霉素外，还形成一种支路产 物—甘露糖链霉素(又叫链霉素B)。对大多数微生物来 说，甘露糖链霉素的生物活性只有链霉素的20%-25%。 直到发酵后期才产生水解甘露糖链霉素的α-D-甘露糖苷 酶，能迅速把甘露糖链霉素水解成链霉素和甘露糖，反 应如下： 链霉素-甘露糖 甘露糖苷酶 链霉素+甘露糖
改进链霉素工艺的方法
（1）菌种的优化。现在已经 证明质粒与链霉素的生物合成 有关，通过对菌株质粒DNA 复制的初步模式，以及原生质 体融合、质粒DNA转化等方 面的研究优化菌种。DNA重 组技术也可以很好的运用在链 霉素的菌种选育。
（2）发酵工艺的优化。发酵过程的 微机控制能在线控制数据，从而更精 准的调控发酵条件，例如：罐温、罐 压、pH、糖浓度、溶氧浓度等。除此 之外，可以在培养基中加赖氨酸能提 高链霉素的发酵单位；或者在培养基 中加氯化钙、天门冬酰胺或者谷氨酰 胺能抑制链霉素B的产生。
链霉素结构的图片
链霉素极其衍生物的化学结构式图
链霉素生产工艺及结构改造
2.3 无机磷的反馈抑制 正常生长所需的无机磷浓度抑制链霉素的形成。磷酸盐与链霉素的生物合成过程有 密切关系，在链霉素生物合成中有几步磷酸酯酶所催化的去磷酸化反应。过量的磷 酸盐会产生反馈抑制，阻抑这几步的一个或多个磷酸酯酶的活性或形成，因而抑制 链霉素的合成，因此磷酸酯酶的活力与链霉素的形成有密切关系。此外磷酸盐还能 调节链霉胍合成的关键酶——脒基转移酶的形成，高浓度磷酸盐严重阻遏该酶的形成。
2.1 发酵阶段的转变 催化链霉胍的2个转脒基反应的酶，在合成阶段开始时的突然出现是由于新的蛋白 质的合成，而不是蛋白质的激活。
2.2 分解代谢产物的调节 在发酵过程中，除形成链霉素外，还形成一种支路产物—甘露糖链霉素(又叫链霉素 B)。对大多数微生物来说，甘露糖链霉素的生物活性只有链霉素的20%-25%。直到 发酵后期才产生水解甘露糖链霉素的α-D-甘露糖苷酶，能迅速把甘露糖链霉素水解 成链霉素和甘露糖，反应如下： 甘露糖苷酶 链霉素-甘露糖 链霉素+甘露糖
链霉素（Streptomycin）是瓦克斯曼〔Waksman S.A.)于 1944 年从灰色链霉 菌 （Streptomyces,griseus）培养液中分离出来的一种碱性抗生素。链霉素是一种 相 当强的有机碱，也是一种多糖类化合物。其分子结构是由链霉肌、链霉糖和 N-甲 基-L-葡萄糖胺三部分以苷键相联结而成的。链霉素碱稳定性特别差，工业 产品主 要是其硫酸盐形式， 即硫酸链霉素(Streptomycin Sulfate)。
然而链霉素发酵液中绝大部分是菌丝体和未用完的培养基，以及各种各样的代谢产 物，如：蛋白质、多肽、色素和Ca2＋、Mg2＋离子等等，链霉素浓度远较各种杂质的低， 仅为5000单位/毫升左右。大量蛋白、多肽和高价离子(Ca2＋、Mg2＋)的存在对离子交换 吸附影响很大。 在离子交换处理前，一般采用蒸汽加热（70～75℃）方法使蛋白质凝固变性。添加 磷酸或一些络合剂如三聚磷酸等使高价离子草酸、磷酸生成不溶性沉淀物，然后通过板 框过滤或离心分离将这些沉淀物除去。这一预处理将导致10％以上的链霉素所添加的草 酸、磷酸或络合剂，既增加了链霉素提炼成本，又会降低产品纯度、污染环境。 同时所得的发酵滤液中仍存在许多蛋白、多肽和其它各种杂质，将会减少树脂的吸 附容量或污染树脂，造成树脂的沉降和堵塞，进而缩短树脂的寿命，增加 抗生素提炼的 成本。 此外采用离子交换法提炼链霉素，总收率不高，只达72％。同时需大量解吸液。解 吸液中链霉素浓度低，各种杂质如色素、金属离子等含量较高，造成下游工艺处理困难 ， 产品纯度不高。
第四章 链霉素制药
出发菌株多采用灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、 比基尼链霉菌和灰色链霉菌等
灰色链霉菌的孢子梗直而短，不呈螺旋彤，孢子数量很多，孢
了乃断裂而成，呈椭圆形，气生菌丝和孢子均呈白色，单菌落生长丰
满，呈梅花型或馒头型，直径为3-4mm，基质菌丝透明，在斜面背后
产生淡色色素。
2. 高产菌株的诱变
3. 终止阶段：阻止终止密码子与A位结合；阻止70S 亚基的解离。
转录
翻译 蛋白体蛋
白质结合，
起到了干扰
结核杆菌蛋
复制
白质合成的 作用，从而
杀灭或者抑
制结核杆菌
生长的作用。
agar plate 琼脂培养基
lawn of test bacteria 测试菌苔
filter papers soaked with test compounds
抗生素 种类
青霉素
产生菌 真菌产生
化学结构 β－内酰胺类
作用对象
作用机制
抗G+细菌的 影响细胞壁合成链霉素ຫໍສະໝຸດ 红霉素多粘菌 素四环素
灰黄霉 素
放线菌产 生
放线菌产 生
细菌产生
氨基糖甙类 大环内酯类 多肽类
放线菌产 生
真菌产生
四环素类 多烯类
抗G－细菌 影响蛋白质合成
抗G+细菌的 影响蛋白质合成
抗G－细菌 抗病毒
链霉素
氨基糖苷类抗生素
（二） 链霉素的理化性质
1.存在形式
链霉素游离碱为白色粉末。大多数盐类也是白色粉末或结晶，无
臭，味微苦。
链霉素分子中有三个碱性基团，其中两个是链霉肌上的强 碱性肌 基(pK=11.5)，第三个是葡萄糖胺上的弱碱性的甲氨其(pK=7.7)。所以， 链霉素在水溶液中随pH值不同可能以四种不同的型式存在。（浓度）
第三组的链霉素的生产
发酵液的过滤及预处理
• 发酵终了时，所产生的链霉素，有一部分是不菌 丝体相结合的。用酸、碱或盐作短时间处理以后， 不菌丝体相结合的大部分链霉素就能释放出开。 通过对发酵液进行适当的预处理，即可改善其流 体性能，降低滤饼比阻，提高过滤不分离的速率。
原斜面：培养恒温35——36℃，7天 斜面孢子：培养恒温34——35℃，6天 摇瓶种子：培养33——34℃，39.5hr转速250rpm， 装量80ml/750ml接种量一块斜面/瓶50——64hr 小罐种子：培养36±0.5℃25——30h转速60—— 300rmp，搅动功率5.5kw通气量2m3/min，罐压 0.03Mpa 中罐种子：培养36±0.5℃，25hr转速60——240rmp 接种量15%通气量1.5wm罐压0.03Mpa搅拌功率 大罐发酵36±0.5℃，136hr转速60——130rpm接种 量15%通气量0.75wm罐压0.04Mp搅拌功率115kw
• 化学结构式如下:
链霉素理化性质
1.物理性质 链霉素游离碱为白色粉末。其大多数 盐类也是白色粉末或结晶，无嗅，味微苦。 链霉素在中 性溶液中能以 三级阳离子形 式存在，所以 可以用离子交 换法进行提取。
2.稳定性 链霉素的水溶液 比较稳定，但其易受 pH和温度的影响较 大。短时间加热，如 在70 o C加热半小时 ， 对活性无明显影响。 100 o C加热10min， 活性约损失一半。最 稳定的pH是4.0~4.5。
• 发酵原理 链霉素是一种从灰链霉菌的培养液中提取的抗菌素， 属于氨基糖甙碱性化合物，它不结核杆菌菌体核糖 核酸蛋白体蛋白质结合，起到了干扰结核杆菌蛋白 质合成的作用，从而杀灭或者抑制结核杆菌生长的 作用。链霉素是含有链霉胍的氨基糖苷类抗生素族 中的主要成员由链霉胍、链霉糖和N甲基-L-葡萄糖 胺构成的糖，苷其结构式如下。链霉素中链霉糖部 分的醛基被还原成伯醇基后就成为双氢链霉，它的 抗菌效能和链霉素大致相同，目前临床上使用的是 链霉素或双氢链霉素的硫酸盐
原始编号：2273灰色链霉菌百欧博伟生物
原始编号：2273灰⾊链霉菌百欧博伟⽣物 原始编号：2273 灰⾊链霉菌 百欧博伟⽣物基本信息中⽂名称：灰⾊链霉菌灰⾊链霉菌属名：Streptomyces 种名加词：griseus 其它保藏中⼼编号：来源历史：中国农科院环发所药物⼯程研究室收藏时间：1990-8-18原始编号：2273原产国：中国资源归类编码：151****7101模式菌株：⾮模式菌株特征特性：在淀粉琼脂培养基上⽓⽣菌丝体为灰⾊、珠母灰，基内菌丝为浅松烟，⽆可溶性⾊素；孢⼦丝丛⽣、弯曲，孢⼦椭圆形；不胨化⽜奶；液化明胶；淀粉不⽔解；在酪氨酸培养基上不产⾊素；在柴斯纳培养基上不产硫化氢；利⽤葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、⿏李糖，不利⽤蔗糖、棉⼦糖、肌醇；纤维素上不⽣长；细胞壁含有DL-2.6⼆氨基庚⼆酸、⽢氨酸、核糖、半乳糖。
具体⽤途：分类 研究⽣物危害程度：四类致病对象：⽆分离基物：⼟壤采集地：四川培养基编号1：0012资源保藏类型：a:1:{i:0;s:6:培养物;}保存⽅法：a:3:{i:0;s:14:真空冷冻⼲燥法;i:1;s:8:矿物油法;i:2;s:10:定期移植法;}共享⽅式：a:4:{i:0;s:10:公益性共享;i:1;s:16:资源纯交易性共享;i:2;s:12:合作研究共享;i:3;s:14:资源交换性共享;}提供形式：冻⼲物本菌本菌形态特征形态特征灰⾊链霉菌是链霉素的产⽣菌，是⼟壤习居菌，具有典型的链霉菌的特征，主要是⽤于防治细菌感染，⽽且本⾝灰⾊链霉菌也是研究链霉菌的次⽣代谢调控的材料，如链霉菌阿A 因⼦的研究主要就是集中在灰⾊链霉菌中。
本菌本菌应⽤应⽤由灰⾊链霉菌(Streptomyces griseus)培养液提取⽽得的微⽣物蛋⽩酶。
⽩⾊粉末。
分⼦量20000。
易溶于盐⽔和稀盐溶液，最适pH 值7.8～8.0，最适温度60～80。
有极强的蛋⽩⽔解作⽤，可切断蛋⽩质所含肽键的80%。
能⽔解纤维蛋⽩、黏蛋⽩。
在体内能与其抑制物结合，使酶活性中⼼受到保护，输送⾄病变组织，⼜能同抑制物分离，恢复其酶活性。
链霉素
一级种子培养液
种子培养
27.5℃,4~8h 通气量1：1.6v/（v.min)
二级种子培养
种子培养
27.5℃,54~56h 通气量1：1.1v/（v.min)
三级种子培养液
发酵
28.5℃,180~220h 通气量1：0.85v/（v.min)
发酵液
提炼
发酵工艺
• 菌种发酵
将冷干管或沙土管保存的链霉素孢子接种到斜面培养基上， 于27℃下培养7天。待斜面长满孢子后，制成悬浮液皆入装 有培养基的摇瓶中，于27℃下培养45—48小时待菌丝生长旺 盛后，取若干摇瓶，合并其中的培养液将其接种于种子罐内 已灭菌的培养基中，通入无菌空气搅拌，在罐温27℃下培养 62-63小时，然后接入发酵罐内已灭菌的培养基中，通入无菌 空气，搅拌培养在罐温为27℃下，发酵约7-8天。
孢子柄直而短，丌呈螺旋。孢 子量多，呈椭圆球形。气生菌 丝和孢子都呈白色。单菌落生 长丰满，呈梅花形或馒头形。
链霉素发酵工艺流程
砂土孢子
孢子培养 27℃,7d
母斜面孢子
孢子培养 27℃,6d
子斜面孢子
摇瓶培养 27℃,68~72h
母瓶培养液
摇瓶培养
27℃,68~72h
种子培养
子瓶培养液
27℃,62~63h 通 气量1：1.4v/（v.min)
• 培养条件
1.温度
灰色链霉菌对温度敏感。据报道，z-38 菌株对温度 高度敏感：250℃时，发 酵单位为 1180 毫克/升 /118 小时； 27℃时,， 2041 毫克/升/118 小时； 29℃时， 2194 毫克升/104 小时，而 31 ℃时则为 414 毫克/升/72 小时。故认为链霉素生产适宜 培养 温度为 28.5℃左右。有些人认为丌一定在 24~31℃ 的范围，应随菌株丌同而 适宜温度有所改变。
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枯草芽孢杆菌原液涂板所得抑菌圈图片
2017/9/28 16
5、链霉素的活性鉴定
测得抑菌圈直径为 1.7cm，1.4cm,1.5cm 平均值为1.53cm
枯草芽孢杆菌稀释五倍涂板所得抑菌圈 图片
2017/9/28 17
5、链霉素的活性鉴定
测得抑菌圈直径为 1.8cm，1.4cm,1.5cm 平均值为1.57cm
及枪头、超净工作台等。
2017/9/28
9
2、斜面培养基的制备 2.1 高氏培养基：可溶性淀粉20g，硝酸钾1 g，氯化钠0.5 g，磷酸氢 二钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，琼脂20 g，水1000毫升， PH7.2—7.4（配制时注意，可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以
37℃培养12h，观察抑菌效果。
2017/9/28 8
实验材料的准备
1、实验器材 天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、 18mL × 180mL 试管、棉花、电炉、烧杯、报纸、记号笔、酒精灯、 接种环、250/500ml三角瓶、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、
接种环、涂布棒、旋转式摇床、4℃冰箱、37℃孵箱、各型号移液枪
28℃、200r/min旋转式摇床培养24h，观察菌丝体形态及浓度。 3、摇瓶大量发酵 待发酵培养基（50ml）灭菌后冷却到 30 ℃时，按接种量 8%-10%进 行接种，即每个发酵瓶加入5ml种子液。32℃、100r/min旋转式摇床 培养24h，发酵过程中，补加灭菌尿素以增加氮源，维持pH值。
2017/9/28
6
4、枯草芽孢杆菌的活化 将配制好的蛋白胨牛肉膏培养基斜面接种枯草芽孢杆菌，方法同灰色 链霉菌活化方法相同。28℃培养24h。
5、链霉素活性的鉴定
5.1 枯草芽孢杆菌悬液制备
加入1ml生理盐水于枯草芽孢杆菌斜面中，轻轻冲下菌落，取至新的 灭菌的1.5mlEP管内，备用。
量和质量的纯种过程。
种子扩培的一般过程是： 斜面菌种 → 一级种子培养（摇瓶） → 二级种子培养(种子罐) → 发酵。根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩
散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供
试品的效价。
2017/9/28
3
二、实验方法
1、灰色链霉菌的活化 1.1 培养基的制备 本实验原计划采用高氏培养基活化菌种，后因效果不佳，改用PDA培 养基培养。因此制备PDA培养基。
枯草芽孢杆菌稀释十倍涂板所得抑菌 圈图片
2017/9/28 18
5、链霉素的活性鉴定
平板上未见预期结 果，即透明的抑菌 圈，培养基上也未 长菌。
阳性对照，枯草芽孢杆菌原液涂板所得图片
2017/9/28
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四、结论
通过活化灰色链霉菌并将其大量发酵，离心获取产物即链 霉素；通过打孔加入链霉素，观察其抑菌圈大小判断链霉 素的效价，可评价制得链霉素的活性。
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2、种子液的制备
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Байду номын сангаас
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3、链霉菌的发酵
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4、枯草芽孢杆菌活化
由于斜面培养基太软，划线的时 候破坏了培养基，菌落也成片。
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5、链霉素的活性鉴定
测得抑菌圈直径为 1.2cm1.2cm,1.4cm 平均值为1.27cm
2.4 发酵液的制备
水解糖160g、尿素5g（单独灭菌）、MgSO40.5g、Na2HPO41.6g、
玉米浆 25~35g 、 FeSO4 和 MnSO4 各20mg/L ，消泡剂 0.3g ，，水 1000mL， pH7.2。
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三、实验结果
1、灰色链霉菌的活化
管中可见成片白色菌落，并且管底含有水。
上培养基中）。
2.2 PDA培养基：淀粉含量高的土豆、葡萄糖、琼脂。将土豆切成小 块，煮烂用纱布滤出土豆汁。将1000ml的土豆汁中加入葡萄糖20g，
琼脂15-20g。
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2.3 种子液的制备 豆饼粉 20g 、淀粉 40g 、酵母膏 5g 、蛋白胨 5g ，硫酸铵 3g ，硫酸镁 0.25g，磷酸二氢钾0.2g，碳酸钙4g，自来水1000mL、pH7.2-7.4。
划到斜面的顶部。注意勿将培养基划破，不要使菌体沾污管壁。
3 ）灼烧试管口，在火焰旁将棉塞塞上。接种完毕，接种环上的余菌 必须灼烧灭菌后才能放下。
4）斜面置于28℃恒温箱中，培养2~3d观察结果。
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2、种子液的制备 将活化的菌种斜面，在无菌的条件下，注入10mL 无菌水，震荡成孢 子悬浮液（孢子浓度约为8×104个/mL）。待发酵培养基灭菌后冷却 到28℃时，分别将孢子悬浮液接入三角瓶中，接种量为2mL，标记。
1.2 斜面接种
1) 左手拿试管菌种，右手拿接种环，先将金属环烧灼灭菌，再将接种 环在空白培养基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻
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2) 左手将试管菌种放下，拿起斜面培养基。在火焰旁用右手小指和手 掌边缘拔下棉塞并夹紧，迅速将接种环伸入空白斜面，在斜面培养基
上轻轻划线，将菌体接种于其上。划线时由底部向上划一直线，一直
灰色链霉菌产链霉素
A
目
Contents
录
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C D E
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一、实验背景
灰色链霉菌是一种放线菌，而高氏一号斜面培养基是一种合成培 养基，可用于培养放线菌。种子扩大培养是发酵工程的一个组成部分， 指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜 面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养 ,最终获得一定数
5.2 枯草芽孢杆菌悬液的稀释 用生理盐水将悬液分别稀释5倍和10倍，备用。
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5.3 涂平板 将制备好的不同浓度的枯草芽孢杆菌悬液涂布于4个制备好的LB平板，
浓度分别为原液、5倍、10倍，第4个平板作为阳性对照，悬液浓度为
原液。
5.4 打孔 将涂布好的平板用1ml枪头打3个孔，孔径光滑均一。 5.5 加样 将发酵液取10ml于10mlEP管内，2000r/mim离心5min，取上清加 于每个孔内，加满为止，但不能溢出。阳性对照的孔内加入一定浓度 的链霉素液。