线粒体自噬研究方法
细胞自噬机制和线粒体运输的相互作用研究
细胞自噬机制和线粒体运输的相互作用研究随着科学技术的不断发展，生物学研究的深入，细胞自噬机制和线粒体运输的相互作用也逐渐受到了重视。
自噬是一种细胞内的新陈代谢过程，它可以将细胞内的旧有细胞膜、蛋白质、细胞核等进行分解和重构，从而维持细胞内环境的稳定性。
而线粒体则是细胞内的能量合成和细胞呼吸中心，如果线粒体发生损伤或不正常，则会导致细胞代谢能力下降，引发疾病的发生。
早在20世纪50年代，生物学家就已经发现了细胞自噬现象，但直到20世纪90年代才开始对其进行系统的研究。
随着研究的深入，我们发现，自噬和线粒体运输之间存在着紧密的联系。
细胞自噬机制是一个高度调控的生物学过程，由多种蛋白质同步协作完成。
其中，自噬体（Autophagosome）的形成是自噬过程的一个核心环节。
在线粒体质量合适时，线粒体上会有PINK1（PTEN诱导蛋白酶体的寡肽酶1）和Parkin（肌病蛋白）调控它的运作，这个机制被称作质量选择性自噬过程（selective autophagy）。
在细胞合适的状态下，PINK1在线粒体外膜磷酸化，然后Parkin会被激活加入到损伤的线粒体上。
Parkin会通过HSPA9的贴附靶向线粒体。
接下来，针对线粒体的Ubiquitin血腥腺素酯酶（Ubiquitin protease）USP30被Parkin调控降解，从而防止USP30过度分解线粒体及其组件。
在线粒体外膜磷酸化方面，Parkin通过导致PINK1的外膜堆积。
一般而言，自噬是通过分解旧有的膜蛋白酯酶进行的。
但是，在线粒体发生损伤或异常时，会出现质量选择性自噬的过程。
在这个过程中，PINK1和Parkin会促进自噬体的合成，将异常的线粒体包裹在自噬体内，然后使其进入到溶酶体内，进行降解。
这个过程被称作线粒体质量选择性自噬（Mitophagy）。
除了参与自噬过程，线粒体还可以影响到自噬的过程。
研究表明，线粒体的状态和数量对细胞内的自噬过程有着重要的影响。
线粒体自噬 糖脂代谢
线粒体自噬糖脂代谢
线粒体自噬是一种细胞自我保护的机制，通过清除受损或功能异常的线粒体，维持细胞内环境的稳定。
线粒体自噬与糖脂代谢之间存在密切联系，以下是一些相关点：
线粒体在糖脂代谢中起关键作用。
线粒体是细胞内的“动力工厂”，负责产生ATP，这是细胞的主要能源。
糖脂代谢过程中，葡萄糖和脂肪酸等营养物质在线粒体内被氧化分解，释放出能量供细胞使用。
因此，线粒体的正常功能对于维持糖脂代谢平衡至关重要。
线粒体自噬有助于维持线粒体质量。
在高糖或高脂环境下，线粒体容易受到损伤，导致功能异常。
线粒体自噬能够识别并清除这些受损的线粒体，防止它们对细胞造成进一步伤害。
通过维持线粒体质量，线粒体自噬有助于保障糖脂代谢的正常进行。
线粒体自噬与糖尿病心肌病的关系。
糖尿病是一种糖脂代谢异常的疾病，长期的高糖环境会导致心肌细胞内线粒体受损，进而引发心功能障碍。
研究表明，线粒体自噬在抑制糖尿病心肌病的发生中起到重要作用。
通过及时有效降解受损线粒体，线粒体自噬能够减轻心肌细胞的损伤，保护心脏功能。
总之，线粒体自噬与糖脂代谢之间存在密切的联系，它们共同维护着细胞的正常功能和内环境的稳定。
深入研究线粒体自噬与糖脂代谢之间的调控机制，有望为糖尿病等代谢性疾病的治疗
提供新的思路和方法。
线粒体自噬电镜特征
线粒体自噬电镜特征
线粒体自噬是一种细胞自噬过程，是细胞内部的一种重要的代谢途径。
线粒体自噬的主要功能是清除老化、受损或异常的线粒体，以维持细胞内线粒体的正常功能。
电镜是一种非常重要的工具，可以用来观察线粒体自噬的电镜特征。
线粒体自噬的电镜特征主要表现在以下几个方面：
1. 线粒体的形态变化
在线粒体自噬过程中，线粒体的形态会发生明显的变化。
在正常情况下，线粒体呈现出长条状或椭圆形状，但在自噬过程中，线粒体会逐渐变得圆形或球形，并且体积会逐渐缩小。
这是因为线粒体自噬过程中，线粒体内部的膜系统会逐渐分解，导致线粒体体积缩小。
2. 线粒体内部的膜系统
线粒体自噬过程中，线粒体内部的膜系统也会发生明显的变化。
在自噬初期，线粒体内部会形成一些小囊泡，这些小囊泡是由线粒体内部的膜系统分解而来。
随着自噬的进行，这些小囊泡会逐渐融合，形成一个大的囊泡，最终将整个线粒体包裹起来。
3. 线粒体的降解
线粒体自噬的最终目的是将老化、受损或异常的线粒体降解掉。
在
自噬过程中，线粒体内部的膜系统会逐渐分解，释放出一些酶类物质，这些酶类物质可以将线粒体内部的蛋白质、脂质等有机物质降解掉。
最终，线粒体会被完全降解掉，释放出一些有用的物质，供细胞再利用。
线粒体自噬是一种非常重要的细胞自噬过程，可以清除老化、受损或异常的线粒体，以维持细胞内线粒体的正常功能。
通过电镜观察线粒体自噬的电镜特征，可以更加深入地了解线粒体自噬的机制和过程，为研究细胞自噬提供了重要的参考。
《基于PINK1-Parkin通路探讨针刀干预膝骨关节炎兔软骨细胞线粒体自噬的作用机制》
《基于PINK1-Parkin通路探讨针刀干预膝骨关节炎兔软骨细胞线粒体自噬的作用机制》基于PINK1-Parkin通路探讨针刀干预膝骨关节炎兔软骨细胞线粒体自噬的作用机制一、引言膝骨关节炎（KOA）是一种常见的关节疾病，其发病机制复杂，涉及多种细胞和分子过程。
近年来，线粒体自噬在KOA的发病和治疗过程中受到了广泛关注。
PINK1/Parkin通路作为线粒体自噬的关键调控机制，在维持细胞内环境稳定和保护细胞免受损伤方面具有重要作用。
针刀作为一种非侵入性的治疗方法，已被证实对KOA有较好的治疗效果。
本文旨在探讨基于PINK1/Parkin通路，针刀干预膝骨关节炎兔软骨细胞线粒体自噬的作用机制。
二、材料与方法2.1 实验动物与分组选用健康成年兔作为实验对象，建立KOA模型，并随机分为四组：正常对照组、模型组、针刀治疗组和药物对照组。
2.2 针刀干预与药物治疗针刀治疗组进行针刀治疗，药物对照组给予相应药物治疗。
模型组和正常对照组分别进行相应处理。
2.3 实验方法与检测指标通过免疫组化、Western blot等方法检测各组软骨细胞中PINK1、Parkin、线粒体自噬相关蛋白等指标的表达情况，以及软骨细胞的形态学变化。
三、结果3.1 PINK1/Parkin通路在KOA中的表达变化实验结果显示，KOA模型组软骨细胞中PINK1、Parkin等线粒体自噬相关蛋白的表达明显降低，表明PINK1/Parkin通路的活性降低。
3.2 针刀干预对软骨细胞线粒体自噬的影响针刀治疗后，针刀治疗组软骨细胞中PINK1、Parkin等线粒体自噬相关蛋白的表达明显升高，线粒体自噬活动增强。
同时，软骨细胞的形态学改变也得到改善。
3.3 机制探讨通过进一步研究发现，针刀干预可能通过激活PINK1/Parkin 通路，促进软骨细胞线粒体自噬，从而减轻KOA的病理损伤。
此外，针刀治疗还可能通过调节其他相关信号通路，如NF-κB、MAPK等，发挥抗炎、抗氧化等作用，进一步促进软骨细胞的修复和再生。
线粒体自噬在糖尿病相关认知障碍中的研究进展2024(全文)
线粒体自噬在糖尿病相关认知障碍中的研究进展2024（全文）摘要糖尿病相关认知障碍是在糖尿病病程中发生的认知功能减退，严重影响糖尿病患者的生活质量。
线粒体功能障碍是糖尿病相关认知障碍重要的发病机制之一。
线粒体自噬是线粒体质量控制体系的重要成分，起到清除细胞内受损线粒体、维持线粒体质量、保护线粒体功能的作用，对维持线粒体的健康形态与正常功能至关重要。
该文就线粒体自噬在糖尿病相关认知障碍中起到的作用和机制进行综述，以期为糖尿病相关认知障碍的防治提供理论依据。
认知障碍是糖尿病常见的合并症。
糖尿病显著增加了认知障碍相关疾病的风险［1 ］。
据报道，糖尿病使全因痴呆的风险增加1.25倍，阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）风险增加1.43倍，血管性痴呆风险增加1.91倍［2 ］。
认知障碍导致糖尿病患者生活质量下降、经济负担增加，特别是在年幼患者和年老患者中，影响前者的神经功能发育、加剧后者的失能，增加家庭照护的负担［3 ］。
因此，探究糖尿病相关认知障碍的机制有助于为防治糖尿病相关认知障碍提供新的理论依据和研究方向。
线粒体功能障碍在糖尿病相关认知障碍中的作用日益凸显［4 , 5 ］。
认知功能的基础是高度依赖能量的神经元的生存与活动。
同时，神经胶质细胞和神经元之间的代谢合作，如神经递质再摄取、氧化应激防御和能量底物传递也依赖于能量可用性。
线粒体不仅负责能量生成，同时也产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）、调控细胞内Ca 2+稳态、免疫反应和细胞凋亡等，对维持细胞生存至关重要。
线粒体自噬是细胞中一种选择性自噬的过程，是线粒体质量控制体系的重要组成成分，通过选择性清除受损线粒体，起到维持正常线粒体的数量与质量、保护线粒体功能的作用［6 ］。
线粒体自噬的异常是造成线粒体功能异常的机制之一。
因此，本文就线粒体自噬在糖尿病相关认知障碍中起到的作用和机制进行综述，以期为糖尿病相关认知障碍的防治提供新的方向与理论依据。
线粒体自噬探针的研究进展
收稿日期：２０２００６１６ 修回日期：２０２００６３０基金项目：南京晓庄学院校级科研项目（Ｎｏ．２０１８ＮＸＹ４９）．作者简介：杨枫辉，南京晓庄学院环境科学学院２０２０届毕业生，研究方向：分析技术．通信作者：张长丽，南京晓庄学院环境科学学院副教授，研究方向：药物制备与分析．Ｅ ｍａｉｌ：ｃａｒｂｏｎ３１４＠１６３．ｃｏｍ２０２０年１１月第６期南京晓庄学院学报ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＮＡＮＪＩＮＧＸＩＡＯＺＨＵＡＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＮｏｖ．２０２０Ｎｏ．６线粒体自噬探针的研究进展杨枫辉，仲 文，张长丽（南京晓庄学院环境科学学院，江苏南京２１１１７１）摘 要：线粒体自噬（Ｍｉｔｏｐｈａｇｙ）是细胞自我降解调节功能失调的细胞器，并通过溶酶体进行营养循环的过程．线粒体作为组织内稳态必不可少的能量发生器以及程序性凋亡和坏死细胞死亡的通道，其核心功能使得线粒体的质量和数量需受到严格控制．线粒体自噬在细胞代谢和调节生理机能中起到着至关重要的作用，因此检测线粒体自噬的方法有着非常重要的研究价值．荧光探针是检测线粒体自噬的主要方法之一，该文主要综述了近些年对线粒体自噬探针的研究进展，旨在为相关领域的研究提供参考．关键词：线粒体；线粒体自噬；荧光探针；荧光成像中图分类号：Ｏ６５７．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９７９０２（２０２０）０６００２７０８线粒体是人体内一种特别的细胞器．真核细胞在其中进行氧化和能量转换，其具有自身的遗传物质和体系，但是由于具有的基因数量少，所以是一种半自主的细胞器［１］．一方面，线粒体是能量转换的工厂和基础；另一方面，线粒体代谢过程中所产生的活性氧的数量也会间接地导致细胞的死亡．所以为了维持体内线粒体的数量，受毁坏或不必要的线粒体应被及时的消灭［２３］．大量研究发现，细胞主要经由自噬机制选择性的消除不需要以及无效的线粒体，这个进程被称之为线粒体自噬（Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌａｕｔｏｐｈａｇｙ或Ｍｉｔｏｐｈａｇｙ）［４］．线粒体自噬指在活性氧、营养缺乏、细胞衰老等外界刺激的作用下，细胞内的线粒体发生去极化出现损伤，损伤线粒体被包裹进自噬体中并与溶酶体融合，从而完成线粒体的降解，维持细胞内环境的稳定［５］．此过程可用图１表示．图１ 线粒体发生自噬示意图［１］自噬过程涉及生理学，化学等多种交叉学科，检测线粒体自噬对于肿瘤的预防和治疗有十分重要的参考价值，近几年也有科学实验表明，适当加快线粒体自噬可以减少脑中风的危害［６］，因此对于线粒体自噬的检测一直都是研究自噬领域的热门．—７２—１ 线粒体自噬探针线粒体自噬检测技术包括电子显微镜（ＥｌｅｃｔｒｏｎＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ＥＭ）［７］、免疫印迹技术（ＩｍｍｕｎｏＢｌｏｔｔｉｎｇＴｅｓｔ，ＩＢＴ）和流式细胞技术（ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＣＭ）［８］等．但是，这些检测方法耗时长且成本昂贵，而荧光探针方便快捷［９］．利用荧光标记技术来追踪线粒体自噬的动态过程，是重要有效的实时检测方式．当线粒体发生自噬时，线粒体以及溶酶体自身的一些物理或化学性质会发生变化，且线粒体和自噬体之间的微环境存在明显差异，如在受损的线粒体被酸性自溶酶体包裹，氧化胁迫下，营养缺乏的细胞中可以观察到线粒体酸化［１０１１］；线粒体自噬同时也是溶酶体降解过程［１２］，线粒体自噬发生时，溶酶体与线粒体进行膜融合过程中溶酶体的黏度［１３］变化；当线粒体膜电位［１４］下降时，引起Ｐｉｎｋ１蛋白在损伤线粒体上的积累，能够吸引Ｐａｒｋｉｎ到损伤的线粒体上．Ｐａｒｋｉｎ使得线粒体外膜上的很多蛋白发生泛素化，从而介导线粒体自噬的发生；线粒体自噬过程中隔离膜的大量形成（自噬体等），线粒体的极性下降，研究表明癌细胞中的极性较低［１５］也可以看出线粒体自噬过程中极性呈下降趋势等．根据所检测线粒体所处环境性质的不同，可以设计不同的探针．从分子结构变化的发光机理，可以设计不同识别基团的探针．以及新型发光材料的应用，也解决了普通发光机理材料的缺陷．１．１ 基于分子内电荷转移机制探针分子内电荷转移（ＩｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒＣｈａｒｇｅＴｒａｎｓｆｅｒ，ＩＣＴ）原理是电子给体或电子受体本身充当识别基团的一部分［１６］．当识别基团和待测物结合后，作为识别基团的供电子部分或拉电子部分的推拉电子能力发生改变，使得体系中π电子发生重排，从而导致吸收光谱、发射光谱发生变化，表现为光谱发生红移或蓝移． （ａ ｈ）诱导自噬的过程中细胞在０ｍｉｎ（ａ和ｅ）、３０ｍｉｎ（ｂ和ｆ）、９０ｍｉｎ（ｃ和ｇ）和１２０ｍｉｎ（ｄ和ｈ）的荧光共聚集图像；（ｉ）探针１的结构式；（ｊ）探针１在含１ ０％ＤＭＳＯ不同ｐＨ值溶液中荧光光谱图（ｐＨ＝３ ０；３ ４；４ ０；４ ６；５ ０；５ ４；５ ８；６ ０；６ ８；７ ０；７ ４和８ ０）；（ｋ）荧光强度对数与ｐＨ之间的线性关系图２ 探针Ｃｙ ＮＨ２结构、性质及细胞成像［１７］Ｔａｎｇ［１７］团队成功地设计和合成了一个基于分子内电荷转移（ＩＣＴ）机制的近红外（ＮｅａｒＩｎｆｒａｒｅｄ，ＮＩＲ）荧光探针Ｃｙ ＮＨ２，检测活细胞的自噬过程，探针可以选择性的聚集在线粒体上（图２）．在生理条件（ｐＨ值约７ ４）作用下，基于ＩＣＴ效应，电子从伯胺转移到染料上，ＮＩＲ荧光消失，探针只显示绿色荧光．在酸性条件下，伯胺被酸化，ＩＣＴ过程被破坏，ＮＩＲ荧光恢复，探针的绿色荧光消失，所以在线粒体自噬过程中，线粒体被溶酶体融合形成自溶酶体，探针被质子化，ＩＣＴ过程被破坏，在６３９ｎｍ处激发状态下表现出较强的近红外荧光，其绿色荧光消失．Ｃｙ ＮＨ２实现了活细胞自噬过程的实时成像．将ＭＣＦ ７（ＭｉｃｈｉｇａｎＣａｎｃｅｒＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ ７，一种人乳腺癌细胞株）细胞与Ｃｙ ＮＨ２在３７℃下孵育３０ｍｉｎ，用ＰＢＳ洗涤以除去残留的探针，在无血清培养基中记录荧光实时图像．随着时间的延长，红色通道的荧光强度越来越强；绿色通道的荧光变弱，这意味着探针在自噬过程中被质子化，认为此探针可以检测细胞自噬过程．因此Ｃｙ ＮＨ２是一种能对自噬进程进行高选择性和高灵敏度成像的荧光探针．其课题组还测定了不同ｐＨ条件下探针的荧光强度，对荧光强度对数与ｐＨ值之间进行了线性拟合，Ｒ２＝０．９９，标明二者之间有很好的相关性．扭曲分子内电子转移（ＴｗｉｓｔｅｄＩｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒＣｈａｒｇｅＴｒａｎｓｆｅｒ，ＴＩＣＴ）［１８］，是ＩＣＴ中一种特殊的形式，通常发生在具有共轭体系的荧光分子中，且含有推－拉电子基团，推电子基团与荧光基团通过可以旋转的单键相连；当荧光团被激发，由于分子内电荷转移，导致原来与芳环共平面的电子给体绕着单键旋转，而与芳环平面处于正交状态，原来的共轭系统被破坏，部分电荷转移变成完全的电子转移，形成了ＴＩＣＴ激发状态，原有的ＩＣＴ形式的荧光消失．不发射或者发射弱的长波荧光是ＴＩＣＴ的特点．Ｌｉ［１３］课题组设计了一种探针ＮＩ ＶＩＳ，它是一种近红外探针，因此具有背景荧光低以及穿透度高的优点．—８２— （ａ）探针ＮＩ ＶＩＳ的化学结构式；（ｂ）Ｍｉｔｏ ＴｒａｃｋｅｒＧｒｅｅｎ（Ａ）和ＮＩ ＶＩＳ（Ｂ）的细胞荧光共聚焦成像；（ｃ）ＮＩ ＶＩＳ在不同黏度的溶液中的荧光发射光谱；（ｄ）ＮＩ ＶＩＳ在不同黏度溶液中的荧光寿命光谱图３ 探针ＮＩ ＶＩＳ的结构及其性质检测［１３］此探针通过黏度相关的荧光变化来对线粒体进行检测，同时是一种基于ＴＩＣＴ机理设计的探针．探针ＮＩ ＶＩＳ通过喹啉基团和苯基通过共轭连接基连接，在低黏度条件下高速旋转，导致荧光猝灭，在高黏度条件下可以抑制旋转，恢复其荧光．季铵盐基团带来水溶性的特性，有助于与线粒体的共定位．此外，大的共轭结构和强的电子推送 拉力使探针具有近红外发射特性，从而产生较高的穿透深度和较低的背景荧光．因为其测量受到黏度的影响，此课题组检测了不同黏度条件下的强度和选择性（如图３），数据表明此探针具有良好的灵敏度，选择性和线粒体靶向能力． （ａ）未经预处理的Ｈｅｌａ细胞在暗视野中的图像；（ｂ）图像ａ的细胞明场图；（ｃ）用探针ＣＭ ＢＨＮＢＤ和ＭＴＲ预处理的细胞在５１５ｎｍ激发下的荧光图像；（ｄ）在４８８ｎｍ激发下细胞的荧光图像；（ｅ）ｃ和ｄ的叠加图像；（ｆ）ｅ图中白框区域的放大图像．色带代表在各种ｐＨ值下的颜色变化 图５ 探针ＣＭ ＢＨＮＢＤ和ＭＴＲ在Ｈｅｌａ细胞ＯＳＳ模型中测定线粒体ｐＨ［１９］Ｃｈｅｎ［１９］课题组设计并合成一种新的荧光探针ＣＭＢＨＮＢＤ（图４），可以检测线粒体酸度．探针基于扭曲分子内电荷转移，响应ｐＨ值的变化，它们的线性范围覆盖较宽的ｐＨ值（２．００～７．００）［１１］．两种探针还具有出色的膜通透性，良好的光稳定性和很低的细胞毒性．营养剥夺会破坏线粒体并导致线粒体自噬．在线粒 （ａ）探针ＣＭ ＢＨＮＢＤ的化学结构式；（ｂ）探针ＣＭ ＢＨＮＢＤ对ＨｅＬａ细胞荧光成像图４ 探针ＣＭ ＢＨＮＢＤ的结构及其细胞荧光成像［１９］体中，活性氧（ＲｅａｃｔｉｖｅＯｘｙｇｅｎＳｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）作为其信号分子［２０］，发挥着至关重要的作用，但是超过限定值的ＲＯＳ会损害包括线粒体在内的各种细胞器［２１］，在刺激状态下，氧化应激可能促进线粒体吞噬或细胞凋亡．其中探针ＣＭ ＢＨＮＢＤ用于ＨｅＬａ细胞的ＯＳＳ模型中以评估线粒体的ｐＨ．用ＣＭ ＢＨＮＢＤ（３．０μＭ）和线粒体标记物（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒＲｅｄ，ＭＴＲ）预处理细胞ＯＳＳ模型，然后通过共聚焦显微镜获取荧光图像，根据细胞荧光强度的分布，发现线粒体呈现出非均质的酸化．使用ＣＭ ＢＨＮＢＤ和ＭＴＲ在ＨｅＬａ细胞中进行了共定位分析（图５），结果表明，探针ＣＭ ＢＨＮＢＤ可用于线粒体自噬过程可视化．通过ＣＭ ＢＨＮＢＤ对细胞成像，发现大多数线粒体酸化至ｐＨ值小于７．０，有些线粒体ｐＨ值降至５．０以下；还有一些线粒体甚至被酸化至ｐＨ值为３．９２，显示出比简单的氧化应激或饥饿模型更高的酸化程度．实验还观察到的酸度与受损的线粒体被酸性自溶酶体包裹的事实；结果还表明，在氧化胁迫下，营养缺乏的细胞中可以观察到线粒体进一步酸化．基于ＴＩＣＴ机理设计的探针具有优异的选择性、灵敏度和响应性，可以用于细胞线粒体自噬系统过程高灵敏成像．１．３ 基于ＡＩＥ发光机理设计的荧光探针“浓度猝灭”效应（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｑｕｅｎｃｈｉｎｇ，ＡＣＱ）［２２］是传统荧光材料的缺点之一，其深深的限制了发光材料在实际状态下的应用，主要表现为在浓度较高的环境下荧光材料会亮度减弱甚至不发光．２００１年，唐本忠教授课题组发现六苯基噻咯（ＨＰＳ）在乙腈溶液中几乎不发光［２３］．但加入不良溶剂使ＨＰＳ溶解度下—９２—降，聚集析出的过程中，荧光却显著增强．这一现象与传统的ＡＣＱ现象恰好相反，他们将其命名为聚集诱导发光（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄＥｍｉｓｓｉｏｎ，ＡＩＥ）现象［２３］．其主要机制是分子内旋转受限（ＲｅｓｔｒｉｃｔｅｄＩｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒＲｏｔａｔｉｏｎ，ＲＩＲ）［２４］，利用这个原理制备的材料因为其与众不同的发光原理，使其具有了检测灵敏度高，选择性好，荧光稳定性好等优点［２５］，在化学物理学以及各种交叉学科中都已得到广泛应用． （ａ）探针ＴＰＥ Ｐｙ ＮＣＳ的化学结构式；（ｂ）ＨｅＬａ细胞探针ＴＰＥ Ｐｙ ＮＣＳ和溶酶体标记物ＬＴＲ同时染色，记录线粒体自噬发生过程 图６ 探针ＴＰＥ Ｐｙ ＮＣＳ的结构及其对线粒体自噬的检测［２６］张卫杰博士［２６］因此设计并合成了一种基于ＡＩＥ发光机理的荧光探针ＴＰＥ Ｐｙ ＮＣＳ．ＴＰＥ Ｐｙ ＮＣＳ既有能和线粒体膜相结合的正电荷也有与线粒体蛋白氨基发生反应的ＮＣＳ基团，所以在细胞内，此探针可以与负膜电位的线粒体通过电吸引特性结合并形成化学键牢固的结合在线粒体上．用该探针和溶酶体标记物ＬＴＲ（ＬｙｓｏｓｏｍａｌＭａｒｋｅｒＲｅｄ）同时染色细胞，显现出标记黄色的线粒体和红色标记的溶酶体，两种颜色在自噬过程中会持续发生变化，线粒体标记的区域的红色颜色会在扫描时明显发生强度下降，慢慢会与绿色标记的溶酶体区域重叠，最终会模糊不清（图６ｂ所示）．此观测过程表示此探针具有优秀的光稳定性，是良好的自噬检测工具．Ｗａｎｇ［２７］课题组设计了治疗型探针ＴＰＡ３，此探针基于聚集诱导发射机制设计，可以在发生自噬时动态地追踪线粒体（图７ａ）．此外．首次在共聚焦显微镜下对线粒体和溶酶体有关的线粒体动态过程进行了原位监测，提供了一种实时系统监测方法． （ａ）探针ＴＰＡ３的化学结构式及其聚集机理；（ｂ）ＴＰＡ３与脂质体及脂质体在水溶液中的扫描电镜图像；（ｃ）用不同的ＬＥＤ光曝光时间对ＬＴＲ和ＴＰＡ３染色的ＨｅＬａ细胞的共定位成像图图７ 探针ＴＰＡ３的结构及性质［２７］一旦功能异常的线粒体通过吞噬作用形成自噬体，担任“清道夫”的溶酶体就开始通过融合和迁移清除受损和老化的线粒体，从而完成线粒体吞噬过程［２７］．因此，将探针和溶酶体标记物同时作用于细胞，进行细胞共定位成像，随着ＬＥＤ光照射时间的增加，黄色荧光的区域（溶酶体标记物的绿色荧光和ＴＰＡ３染色的红色荧光的重合区域）逐渐增加，由图７所示，表明自噬体和溶酶体逐渐融合．结果进一步证明了探针ＴＰＡ３能够示踪早期线粒体细胞凋亡，并且追踪线粒体自噬过程．Ｃｈｅｎ［１４］课题组将ＡＩＥ的聚集态发光特性与Ｉｒ（ＩＩＩ）配合物发磷光特点结合在一起，设计了一系列探针，该组探针在高聚合状态下荧光强度会增强，具有良好的光稳定性、对线粒体优异靶向性，可用于线粒体成像示踪（图８）．探针采用具有螺旋桨状的给电子结构的三苯胺（ＴＰＡ）基团［２８］，该结构带来ＡＩＥ特征；结合苯基 咪唑 菲咯啉衍生物铱（ＩＩＩ）络合物［２９］．荧光探针相比，磷光探针大多是基于重金属离子的配合物，如铱（Ｉｒ）、铂（Ｐｔ）、钌（Ｒｕ）等，其具有磷光寿命长、发光效率高以及较大的斯托克斯位移、发光颜色可调、避免了体系中背景荧光散射的干扰等优点，这些优点使得磷光探针作为识别生物分子和离子客体等的优秀候选者而被大量的研究．通过共聚焦显微镜和电感耦合等离子体质谱法（ＩＣＰ ＭＳ），利用Ｉｒ配合物在较短的培养时间内可以对线粒体进行成像．五环金属铱（ＩＩＩ）配合物（ＩＲ１ ＩＲ５）表现出ＡＩＥ特性，这些Ｉｒ（ＩＩＩ）配合物被用作具有良好光稳定性的线粒体探针．在低浓度（５００ｎＭ）的短成像时间段（８ｍｉｎ）中，线粒体生理范围内没有磷光强度波动，Ｉｒ１ Ｉｒ５选择性且有效地定位了线粒体．细胞摄取实验的结果表明，这些Ｉｒ（ＩＩＩ）配合物通过非内吞性主动转运方法穿过细胞膜．其中探针Ｉｒ１和ＬＴＧ（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒＧｒｅｅｎ）一起成功地监测了ＣＣＣＰ（Ｃａｒｂｏｎｙｌｃｙａｎｉｄｅ３ ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｏｎｅ）诱导的线粒体．—０３— （ａ）Ｉｒ１ Ｉｒ５配合物的化学结构式；（ｂ）Ｉｒ１ Ｉｒ５的共焦光图像；（ｃ）二甲基亚砜聚对苯二甲酸丁二醇酯（ＤＭＳＯ ＰＢＳ）混合物中Ｉｒ１的发射光谱图８ Ｉｒ１ Ｉｒ５配合物的结构及性质［１４］借助这种方便而有效的线粒体探针，可以解决线粒体跟踪中出现的问题，不仅包括短期动态变化，还包括ｐＨ波动，剧烈的形态变化和膜电位损失．这种线粒体特异性探针扩展了ＡＩＥ金属环化铱（ＩＩＩ）配合物探针的分子库，有望成为一系列生物学成像，动态监测研究的有用工具，并有助于深入了解与疾病有关的线粒体过程．ＡＩＥ材料的引入大大改善了荧光分子浓度使用受限带来的荧光度下降的缺点．良好的光稳定性也为长期观察自噬提供了可能性，但是在活体检测时还需考虑诸多因素，做进一步改良．１．４ 基于ＥＳＩＰＴ机理设计的荧光探针当探针分子受光激发后，发生在激发态分子内部邻近的质子给体与质子受体之间的质子转移反应［３０］，此现象称为激发态分子内质子转移（Ｅｘｃｉｔｅｄ ｓｔａｔｅＩｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｔｏｎＴｒａｎｓｆｅｒ，ＥＳＩＰＴ）．同时金属离子可以经由不同的信号传导间接或直接的影响自噬，反过来，自噬也会影响细胞中金属离子的含量．金属离子以信号分子的形式分布在各个信号通路中，从而直接或间接地参与生命细胞的各种活动，其中就包括细胞的自噬，也可以通过不同的信号启动细胞的自噬．例如人体内含有丰富的金属离子Ｍｇ２＋，因为其存在于线粒体中，所以它可以间接的影响细胞的代谢功能；浓度较高的Ｆｅ３＋也会引起细胞的氧化，加快活性氧的细胞死亡，导致细胞发生自噬；细胞也会根据体内Ｃａ２＋的含量发生一系列的激活和停止自噬的活动．因此，可以基于上述原理开发对金属物质敏感的荧光探针．图９ 荧光探针ＨＨＱ的结构式［３１］如郑曼丽博士［３１］合成了一种Ｍｇ２＋敏感的有机小分子荧光探针８ 羟基喹啉衍生物ＨＨＱ，结构如图９所示．因为Ｍｇ２＋大量存在于线粒体中，ＨＨＱ可以对线粒体自噬过程利用荧光显微镜进行实时的监测成像，还能监测自噬体与溶酶体融合的过程．当检测时，探针以劫持蛋白的方式进入自噬体，其高选择性会实时定位线粒体，实现可视化的检测和追踪．当探针工作时，产生激发态分子内质子转移，阻止探针发光，当线粒体发生自噬时，其释放的大量Ｍｇ２＋配位形成荧光配合物ＨＨＱ Ｍｇ２＋，ＥＳＩＰＴ被阻断后发射出蓝色荧光，自噬体和溶酶体融合伴随着自噬逐渐结束，导致ＨＨＱ Ｍｇ２＋在ｐＨ≤５下分解，荧光消失．因为金属探针本身毒性会大大加快细胞的死亡，导致自噬的发生，这就会对荧光探针检测成像产生很大的干扰．此探针细胞存活率大于９０％，毒性较小，几乎不会对细胞本身的代谢产生影响，不会干扰荧光成像，有很好的利用价值． （ａ）ＨＱＯ的化学结构式；（ｂ）在无血清培养基中与ＨＱＯ孵育的细胞的实时共聚焦成像图１０ ＨＱＯ的结构及其细胞成像［３２］基于ＥＳＩＰＴ机理设计的金属离子的探针灵敏度高、成本低、便于进行实时检测．但对元素选择性差，检测过程中可能也会对其他元素也产生响应，因此排除其他金属的干扰是此类荧光探针的研究热点．１．５ 同时检测线粒体和溶酶体的探针现有技术中，检测线粒体自噬的探针可能需要同时使用两种不同的荧光染料分别对线粒体和溶酶体进行染色来对自噬过程进行监测，而且溶酶体参与细胞本身的吞噬作用，细胞内吞作用和自噬过程，溶酶体探针不止会染色线粒体的自噬溶酶体，相反因为选择性弱会对所有溶酶体进行染色，这是传统探针的缺陷．ＨＱＯ［３２３３］（２，６ Ｂｉ（２ （３，３ ｄｉｍｅｔｈｙｌ １ ｐｒｏｐｙｌｉｎｄｏ ｌｉｎ ２ ｙｌｉｄｅｎｅ）ｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ） ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｏｎｅ）是上官棣华课题组设计出的一种荧光探针（图１０），克服了监测活细胞中线粒体自噬过程中需要两种染料的缺点。
线粒体自噬受体蛋白BNIP3的研究进展
线粒体自噬受体蛋白BNIP3的研究进展*吴梦瑶1，张卉1，王陆2，姚咏明1△（1解放军总医院医学创新研究部转化医学研究中心，北京100853；2解放军总医院第一医学中心重症医学科，北京100853）Advances in study of mitophagy receptor protein BNIP3WU Mengyao1，ZHANG Hui1，WANG Lu2，YAO Yongming1△（1Translational Medicine Research Center， Medical Innovation Research Division of the Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853， China；2Department of Critical Care Medicine， the First Medical Center of the Chinese PLA GeneralHospital， Beijing 100853， China. E-mail： c_ff@）［ABSTRACT］B-cell leukemia/lymphoma 2 （BCL-2）/adenovirus E1B 19 kD interacting protein 3 （BNIP3） is an atypical BCL-2 family protein containing the BCL-2 homology 3 （BH3）-only domain. As a mitophagy receptor， BNIP3 is a key factor of apoptosis. This review aims to outline the pathway of BNIP3-mediated mitophagy and its regulatory pathway at molecular level，and further discuss the involvement of BNIP3-mediated mitophagy in various human diseases，thereby providing a new direction for exploring clinical treatment strategies for these diseases.［关键词］BNIP3蛋白；线粒体自噬；线粒体；细胞凋亡［KEY WORDS］BNIP3 protein； mitophagy； mitochondria； apoptosis［中图分类号］R329.2+8； R363.2 ［文献标志码］A doi： 10.3969/j.issn.1000-4718.2023.03.020作为细胞的“能量工厂”，线粒体源源不断地生产三磷酸腺苷（adenosine triphosphate， ATP），参与细胞内多个生物合成过程，为机体细胞提供着支持生命活动过程所必需的能量，在调控细胞生长、代谢和死亡等方面发挥重要作用［1］。
线粒体生物学性状及细胞衰老和自噬的研究
线粒体生物学性状及与细胞衰老和自噬的关系摘要：线粒体除了为细胞生理活动提供能量外，还参与了其他生命过程的调控。
线粒体DNA 是哺乳动物细胞内唯一的核外遗传物质, 具有独特的生物学特性, 由于其裸露无组蛋白保护且缺乏有效的修复系统, 易受外源性因素影响发生突变并且在细胞内累积。
从线粒体呼吸链逸出形成的活性氧导致线粒体膜通透性升高，线粒体跨膜电位降低，ATP合成减少，持续的活性氧氧化作用使线粒体DNA 损伤增多，导致线粒体结构功能严重受损，促进细胞衰老甚至死亡，线粒体DNA 突变在人类衰老及许多退行性变疾病中的作用已被广泛证实, 退行性变化往往会诱导自噬的有关潜力。
在这里,我们讨论了线粒体生物学性状及自噬和衰老之间的关系和影响,以及可能因素调解抗衰老作用和自噬的机制。
关键词:线粒体，DNA突变，活性氧，细胞衰老，自噬作用Abstract: In addition to providing energy for the cell mitochondria physiological activities, but also involved in the regulation of other life processes. Mitochondrial DNA in mammalian cells is the only genetic material outside the core, has a unique biological characteristics, mutations due to its non-histone proteins exposed the lack of effective protection and repair system vulnerable to exogenous factors and accumulate within the cell. Reactive oxygen escaping from the formation of the mitochondrial respiratory chain, resulting in mitochondrial membrane permeability increased, reduced mitochondrial transmembrane potential, ATP synthesis decreased ROS continuous oxidation increased mitochondrial DNA damage, causing serious damage to mitochondrial structure and function, and promote cell aging and even death, mitochondrial DNA mutations in human aging and many degenerative diseases role has been widely demonstrated degenerative changes tend to be related to the potential of inducing autophagy. Here we discuss the biological characteristics and mitochondrial autophagy and the relationship between aging and influence, as well as aging effects and mediate the anti-aging effects of autophagy.Keywords: mitochondria, DNA mutation, reactive oxygen species, cell senescence, autophagy线粒体是真核细胞内特殊的细胞器，除了为细胞生理活动提供能量外，还参与了其他生命过程的调控，如细胞凋亡、细胞内钙平衡、活性氧(reactive oxygen species, ROS) 产生等等。
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线粒体自噬研究方法
线粒体自噬是细胞内一种重要的生理过程，其研究方法主要有以下几种：
1. 透射电镜技术（TEM）：这是研究自噬发生的最直接、最可靠的手段。
透射电镜可以观察到线粒体自噬体和线粒体自噬溶酶体的形成和结构特征，从而判断自噬是否发生。
2. 荧光显微镜技术：通过荧光标记的方法，可以观察线粒体自噬的动态过程，例如使用荧光探针标记技术对线粒体和自噬体进行共定位。
此外，还可以利用荧光基因标记技术对线粒体和自噬体进行共定位分析。
3. 免疫印迹技术（IB）：通过检测线粒体蛋白的表达量变化，可以反映线粒体自噬的活性。
通常选取线粒体基质蛋白、线粒体膜蛋白等作为检测目标，以全面反映线粒体总量的变化。
4. 流式细胞技术（Flow cytometry, FC）：这是一种单细胞定量分析和分选的手段，可以通过定量检测线粒体荧光强度的变化来反映线粒体的损伤程度。
5. 分子生物学技术：例如通过基因敲除或转基因技术，研究特定基因对线粒体自噬的影响；通过蛋白质组学方法，研究参与线粒体自噬的蛋白质的相互作用和调控机制。
这些方法各有特点，需要根据具体的研究目的和实验条件选择合适的方法。