微生物纯培养的分离方法
第二章 微生物的纯培养
干燥保藏法 将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料 上保藏。 如砂土管保藏法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真 菌保藏，保藏时间几至几十年。
几种常用菌种保藏方法的比较
方法名称 斜面低温保藏法 石蜡油封存法 主要特点 传代培养，4℃保藏 石蜡油隔绝空气，室温或 4℃保藏 沙土管作载体，干燥器中抽 真空，室温或4℃保藏 适用范围 各种微生物的短期保藏。 各种微生物的中短期保藏， 不适用某些能分解烃类的菌 种。 产孢子微生物和芽孢细菌的 长期保藏，不适用对干燥敏 感的微生物 保藏期 1-6个月 1-2年
微生物学
第二章 微生物的纯培养和显微技术
基本概念
1、微生物的纯种分离：
将多种混杂的微生物，经某种技术或方法分离 或纯化的过程。
2、微生物的培养物（culture)：
在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物 群体。 纯培养物（pure culture)：在人为规定的条件下 培养、繁殖得到的只有一种微生物的培养物。
方
法
1、传代培养保藏方法
①斜面低温保藏法
方法：菌种管置4℃冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 。 低温可减缓生长速度，单细胞仍有一定的活动条
件，一般4～6个月必须传代一次。
优点：方便，不受条件限制，各类微生物均可。 缺点：时间短、传代多、易退化。
②石蜡油低温保藏法：
原理：在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡， 达到菌体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态， 同时石蜡油还防止水分蒸发，
第一节 微生物的分离和纯培养
一、无菌技术（aseptic technique）
在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他
微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术被称为
实验二微生物的分离纯化_图文_图文
④真空冷冻干燥法 加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干 燥。 适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活 时间长，是目前最好的保藏方法。 ⑤液氮超低温保藏法 将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低 温冰箱中（ -196℃）。 适用于各种微生物的较理想的保藏方法。
几种常用菌种保藏方法的比较
方法名称
实验二微生物的分离纯化_图文_图文.ppt
内容提要
• 分离 • 纯化 • 形态观察
（1）接种
• 半固体培养基：穿刺接种 • 液体培养基接种 • 普通琼脂培养基：涂布平板，平板划线接种，斜
面划线接种 • 浅盘固体接种
划线接种注意要点
• 划线时接种环与平皿约成30-40度角,轻轻接触, 以腕力在琼脂表面轻快滑动,不能划破琼脂.
同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落
（4）菌种保藏
• 最常见的保藏方法：斜面 • 细菌的保藏：甘油保藏 • 真菌的保藏：石蜡油保藏、孢子保藏
菌种保藏的方法
菌 种 保 藏 方 法
连续在培养基上（内）移种
生活态 传代培养保藏法 连续在活宿主上（内）移种
固体斜面
湿法 半固体琼脂柱
真菌分离
• 利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落 分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是 利用营养成分的减少而使生长减慢，并由此 限制真菌的迁涉生长。
• 一般采用PDA培养基 • 改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分
离。 • 有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分
离培养时应加以考虑。
（2）纯化
2、琼脂平板在使用前应置于37℃培养箱中孵育l 、2天。
3、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应 调节到与试样的生态系统参数值相近。
采用哪些方法可获得微生物的纯培养
1.采用哪些方法可获得微生物的纯培养？（15分）2.试拟出从土壤中分离枯草杆菌蛋白酶产生菌株的主要实验步骤。
（20分）3.要对实验室内的空间及表面进行消毒可采用哪些消毒方法？如何评价你所采用的消毒剂对空气中微生物的杀灭效果？（25分）4.要快速测定自来水中的大肠菌群是否超标可采用哪些方法？试列出其中一种测定方法的基本操作过程。
（20分）5.酶联免疫吸附实验（ELISA）的基本原理是什么？如何用此方法检测样品中是否含有乙肝病毒表面抗原（HBSAg）？（20分）参考答案：1、采用哪些方法可获得微生物的纯培养？参考答案平板分离法（稀释涂布平板法、稀释混合平板法、平板划线法）；单细胞挑取法。
2、试拟出从土壤中分离枯草杆菌蛋白酶产生菌株的主要实验步骤。
参考答案取土样——制备土壤悬液——加热处理（如：80℃水浴处理10 min）—制备稀释液——含奶粉（如：含10%脱脂奶粉）的营养琼脂平板分离（涂布平板法或平板划线法）——培养——挑菌（选择产生透明圈的菌落）。
3、要对实验室内的空间及表面进行消毒可采用哪些消毒方法？如何评价你所采用的消毒剂对空气中微生物的杀灭效果？参考答案方法：紫外线照射；化学药物：喷雾（0.2%过氧乙酸、1%漂白粉澄清液……），气体熏蒸（福尔马林等）。
检测杀灭效果：将制备好的普通营养琼脂平板，于消毒前和消毒后分别放于室内的4角和中央，暴露采样15 min，然后放培养箱培养24-48h，观察结果。
对消毒前、后各5个板，分别求其平均菌落数及计算杀灭率。
4、要快速测定自来水中的大肠菌群是否超标可采用哪些方法？试列出其中一种测定方法的基本操作过程。
参考答案方法：快速测定仪测定、纸片法、滤膜法、多管发酵法（常规）。
滤膜法基本操作过程：滤膜和滤器的灭菌和安装 , 过滤水样，培养（用灭菌镊子夹取滤膜边缘，将滤膜移放在伊红美兰平板上，滤膜截留细菌面向上，滤膜与培养基完全贴紧，两者间无空隙。
平皿倒置于37℃温箱培养22h～24h。
微生物纯培养的方法
微生物纯培养的方法微生物纯培养，这可真是个神奇又有趣的领域啊！你知道吗，就好像在一个大大的微生物世界里去寻找那独一无二的宝贝。
微生物啊，它们无处不在，土壤里、水里、空气里，甚至我们的身体上都有它们的身影。
而纯培养呢，就是要把其中的一种微生物单独分离出来，让它在一个特定的环境里茁壮成长。
这可不是一件容易的事儿，但一旦成功，那可太有成就感啦！想想看，就像在一群调皮的小孩子中，准确地找到那个最特别的，然后给他一个专属的空间，让他尽情发挥。
我们要给微生物准备一个最舒适的家，合适的温度、湿度、营养，一个都不能少。
这就像是给小宝贝准备最合身的衣服和最美味的食物一样。
有时候，要找到合适的培养基就像是在茫茫大海中寻找那根能救命的稻草。
得不断尝试，不断探索，直到找到那个能让微生物欢快生长的“魔法配方”。
这过程中可能会失败很多次，但别灰心呀，每一次失败都是离成功更近一步呢！分离微生物的方法也有很多种呢，比如划线法，就像是在画布上精心描绘一幅美丽的图画，一点点地把微生物分开。
还有稀释法，就好像把一大碗汤稀释成一小碗，让其中的微生物更容易被发现和分离。
得到了纯培养的微生物，那就像是拥有了一件绝世珍宝。
可以仔细地研究它的特性、功能，看看它能给我们带来什么样的惊喜。
说不定它就是那个能解决大问题的关键呢，比如帮助我们制造新药，或者改善环境。
微生物纯培养真的是一个充满挑战和机遇的领域啊！它需要我们有足够的耐心和细心，就像呵护一朵娇嫩的花朵一样。
虽然过程可能会很艰难，但当看到那纯净的微生物菌落时，一切都值得啦！所以啊，不要害怕困难，大胆去尝试吧，去探索微生物世界的奥秘！微生物纯培养，绝对值得我们去深入研究和探索，它会给我们带来意想不到的收获和惊喜！。
微生物的分离和纯化实验原理及步骤
实验五微生物的分离和纯化
实验目的：
掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。
实验原理：
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的方法有简易单细胞挑取法；平板分离法。
本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，包括两个方面
1．选择适合于待分离微生物的生长条件等要求或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物；2．微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通
过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成的。
单个菌落并不一定保证是纯培养，纯培养的确定除观察其菌落特征外还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。
实验器材：
1．菌种米曲霉 (Aspergillus oryzae)。
2．培养基高氏Ⅰ号培养基，牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。
3．溶液或试剂 10%酚，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂。
4．仪器或者其他用具无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板等。
单菌落分离法
单菌落分离法在分离培养基上由一种纯菌落长出的子细胞，称为纯菌落。
单菌落就是一个微生物纯培养。
它的出现常意味着微生物纯度高，容易鉴别与计数，因此是一种重要的菌种鉴定方法。
单菌落分离法主要用于从混杂在一起的各种微生物群体中分离某一特定微生物。
实验时，应选择一种已知其纯度的标准菌株，采取的方法和培养基组成与生产工艺相同，将混杂在一起的各种微生物样品（如水、牛肉膏蛋白胨培养基、血琼脂培养基、鸡肉膏蛋白胨培养基）分装到烧杯或三角瓶内，各加入1-2毫升无菌水，加入3-5滴荧光素标记的细菌的特异性抗生素，轻轻摇动混匀，制成含有标准菌株的平板，并使平板表面平整、光滑。
2、涂布平板后，应立即放在37 ℃的温箱内培养。
室温下24小时左右应有80%左右的单菌落形成。
观察结果时，取少量平板，涂在载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下计数。
在进行检验之前，应先测量混合液中微生物的菌数，然后进行显微镜计数。
3、通过对菌液进行摇动，使未固定的微生物从平板表面被摇散而沉淀，并随液体的流动而分布到底部，再利用吸管吸取少量菌液涂在载玻片上，然后将其置于显微镜下计数。
其原理类似于肉汤稀释法。
应注意的是：在向液体培养基中加入液体的速度要慢，待接种平板上长出新生菌落后才能再加入液体；向平板内加液的速度也不宜过快，以免搅乱平板内微生物的菌落，影响计数。
单菌落分离法具有操作简便，耗时短，操作过程中需要设备简单，所用设备及试剂消毒方便等特点。
本法具有快速、简便、容易掌握等优点。
但在使用单菌落分离法时，还存在某些问题，如有些微生物不能繁殖，而某些微生物又可以在较短时间内大量繁殖，使结果偏高，但这种误差一般较小，而且当微生物纯度较低时，仍能分离出相当数量的微生物，故可以认为，该法对纯菌落的检出具有较好的灵敏度，只要所用的纯菌落形成时间短，又具有足够的数量，则这种方法仍能提供较多的可供鉴定的微生物菌种。
另外，该法还有一定的局限性，例如在进行纯菌落检查时，必须使用已知浓度的菌株，若该菌株已广泛地用于食品和医药等行业，则就不适合用单菌落分离法。
环境工程微生物学实验八 细菌纯种分离、培养和接种技术
南昌大学实验报告学生姓名：学号：专业班级：实验类型：√验证□综合□设计□创新实验日期：实验成绩：实验八细菌纯种分离、培养和接种技术一、实验目的：1、学习从环境（土壤、水体、活性污泥、垃圾、堆肥等）中分离、培养微生物，掌握一些常用的分离和纯化微生物的方法；2、学会几种接种技术。
二、实验基本原理：自然界中的微生物总是杂居在一起，即使一粒土或一滴水中也生存着多种微生物。
要研究其中的某一种微生物，首先必须将它分离出来。
受污染的土壤或水体中，微生物的数量和污染物的降解之间存在着显著的关系.为了提高污染物降解速率,常需接种一些能降解目标污染物的高效菌。
从经过富集、驯化培养的样品中筛选目标菌株，往往是获得高效降解菌的有效方法。
根据目标微生物特定的营养要求，设计相应的选择培养基。
是快速高效获得目标菌的关键步骤。
土壤是微生物生活的大本营，有“微生物的天然培养基”之称，同其他生物环境相比它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离纯化的到许多有价值的菌株，事实上，生产、工程上很多有益菌株都是从土壤中分离得到的。
从复杂的微生物群体中获得只含有一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
微生物纯种分类的方法有很多，常用的方法有两类一类是单细胞挑取法，采用这种方法能获得微生物的克隆纯种，但对仪器条件要求较高，一般实验室不能进行。
另一类是单菌落分离（平板分离法），该方法简便是微生物学实验中常采用的的方法。
通过形成单菌落获得纯种的方法有平板划线法、平板浇注（稀释混合平板法）、平板表面涂布法。
此次实验采取的是平板分离法，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化。
其原理包括两方面：1、在适合于待分离微生物的生长条件下（如营养、酸碱度、温度与氧等）培养微生物，或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
微生物的分离、接种和培养技术
微生物的分离、接种和培养技术一、实验的目的和内容目的：掌握微生物接种和分离纯化技术，掌握无菌操作技术。
内容：用平板划线法分离微生物；学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。
二、基本原理在自然界中，各种微生物是在互为依赖的关系下共同生活的。
因此，为了取出特定的微生物进行纯培养，必须从中把他们分离出来。
微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本操作技能。
无菌操作是微生物接种技术的关键。
接种是将微生物或微生物悬液引入新鲜培养基的过程。
由于实验目的、培养基种类及实验器皿等不同，所用接种方法不尽相同。
斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种操作均以获得生长良好的纯种微生物为目的。
分离培养微生物时，要考虑微生物对外界的物理、化学等因素的影响。
即选择该类微生物最适合的培养基和培养条件。
在分离、接种、培养过程中，均需严格的无菌操作，防止杂菌侵入，所用的器具必须经过灭菌，接种工具无论使用前后都要经过灭菌，且在无菌室或无菌箱中进行。
三、材料及器材（一）菌种：大肠杆菌、枯草杆菌，金黄色葡萄球菌，酵母菌。
（二）培养基：肉汤培养基试管斜面，肉汤半固体培养基，肉汤固体培养基试管斜面，肉汤固体培养基平板，查氏培养基试管斜面，查氏培养基平板。
易（三）仪器及其他工具：接种环，接种针，接种钩，镊子，酒精灯，火柴，酒精棉，试管架，标签纸，恒温培养箱等。
四、方法与步骤（一）接种。
1、试管菌种转接：试管细菌菌种转接主要用于菌种的活化、分离、纯化。
（1）将菌种试管与待接种的试管培养基依次排列，挟于左手的拇指与其他四指之间，用右手的无名指与小指和手掌边拔出棉塞并挟住。
（2）置试管口于酒精火焰附近。
（3）将接种工具垂直插入酒精火焰中烧红，再横过火焰3次，然后再放入有菌试管中，在管壁上停留片刻待其冷却。
（4）取少许菌种置于另一支试管中，按一定的接种方式把菌种接种到新的培养基上。
（5）取出接种工具，试管口和棉塞进行火焰灭菌。
（6）重新塞上棉塞。
（7）烧死接种工具上的残余菌，把试管和接种工具放回原处。
微生物菌种分离和鉴定技术
微生物菌种鉴定技术
表征（表型）特征 形态特征 生理和代谢特征 生态特征
遗传（基因型）特征 蛋白质比较 核酸碱基组成 核酸序列
分子标尺
多相鉴定技术 Polyphasic Identification
新型显色培养基：
利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物 的培养基 。
微生物快速分离、计数方法
Petrifilm Plate (3M)
微生物快速分离、计数方法
3M Petrifilm Plate
Aerobic Count Plate Coliform Count Plate Rapid Coliform Count Plate E. coli /Coliform Count Plate Enterbacteriaceae Count Plate Yeast and Mold Count Plate Staph. aureus Express Count Plate Environmental Listeria Plate
单细胞（孢子）分离
选择培养基分离
传统选择性培养基
血平板：适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。 巧克力血平板：其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标
本。 中国蓝平板或伊红美蓝平板：可抑制革兰阳性细菌，有选择地促进G-菌生长，
是较好的弱选择性培养基。 麦康凯平板：具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。 SS琼脂：有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。 碱性琼脂：用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。 血液增菌培养基：用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。 营养肉汤：用于标本及各类细菌的增菌
微生物的接种分离和纯培养
穿刺接种技术：用接种针从菌种斜面上挑取 少量菌体并竖直穿刺到半固 体培养基中；
接种无菌操作步骤
1. 将菌种斜面和待接种新鲜斜面夹在左手 的食指、中指和无名指之间，大拇指按在两 只试管中间。右手旋松棉塞，便于拔出； 2. 右手拿接种环，竖直伸入火焰中，环端 及伸入试管中部分均充分灭菌；
I
冷却至 45℃左右
每皿约倒入15ml
肉汤培养基
II
III
0.2ml 0.2ml
0.2ml
微生物的计数
血球计数法 平板活菌计数法
计繁殖数法只适宜于单细胞状态的微生物 或丝状微生物产生的孢子
血球计数法
一、实验原理
血球计数器是一特制的厚载玻片，上面 刻有一定面积的方格，将盖玻片盖上后，由 于两者之间存在着距离使之形成一定容积的 小室。滴入待测样品后，使样品均匀充满小 室，在显微镜下计算小室内的菌数，换算成 单位体积的样品中所含的菌数。
度。
思考题
1. 微生物的纯种分离通常采用那些方法，并说明个 方法的特点。
2. 什么叫微生物的污染？如何防止？ 3. 从两种方法计数得出的菌液浓度是否一致？分析
误差产生的原因，由此比较一下两者的优缺点及 各自的适用范围。 4. 平板活菌计数中，为何选择生长有25～250个菌 落的平板？
碰到火焰，以免烧死菌体 6. 血球计数器要洁净干燥，滴入菌液时在盖玻片与
载玻片间不能有气泡 7. 血球计数时显微镜光线不宜太亮
实验安排（三人一组）
斜面接种：每组三支 液体接种：每组三支（大肠、四联、枯草各一支） 穿刺接种：每组二支（四联一支、变形一支） 平板划线分离：每人划一块平板（混合菌液) 稀释分离：I、II、III各一块平板（混合菌液) 血球计数：写出小格数目，并算出酵母菌液