化学合成的DNA小片段快速连接
生物化学重点_第十一章dna的生物合成
生物化学重点_第十一章D N A的生物合成work Information Technology Company.2020YEAR第十一章 DNA的生物合成一、中心法则：① DNA的自我复制将遗传信息由亲代传递给子代；② 转录：以DNA为模板合成RNA；③ 翻译：mRNA指导蛋白质的生物合成，从而决定生物的表现型。
DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则。
但在少数RNA病毒中，其遗传信息贮存在RNA中。
因此，在这些生物体中遗传信息的流向是④ RNA通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代；⑤ 通过反转录将遗传信息传递给DNA，再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质，二、DNA复制的特点：1．半保留复制：DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semiconservative replication)。
DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的实验所证明。
2．需要引物(primer)：DNA聚合酶必须以一段具有3'端自由羟基（3'-OH）的RNA作为引物，才能开始聚合子代DNA链。
3．半不连续复制：由于DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA链，因此两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。
以3'→5'方向的亲代DNA链作模板的子代链在聚合时基本上是连续进行的，这一条链被称为前导链(leading strand)。
而以5'→3'方向的亲代DNA链为模板的子代链在聚合时则是不连续的，这条链被称为随后链(lagging strand)。
DNA在复制时，由随后链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazaki fragment)。
三、DNA复制的条件：1．底物：以四种脱氧核糖核酸(deoxynucleotide triphosphate)为底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。
第13章 DNA生物合成(简明生物化学)
Dna A辨认复制启始点，然后引物酶进入（DnaG 蛋白） ，加上解螺旋酶、 DnaB蛋白和DnaC蛋 白等，与DNA的起始复制区域形成引发体。
DNA聚合酶Ⅲ 由其β亚单位辨认引物，新链的 第一个脱氧核苷酸与引物的3-OH形成磷酸二酯键， 开始复制
滚动环式：单向复制，低等生物如质粒 共价闭环双链分子的正链由核酸内切酶在一特
定位点切开，游离出的5’-磷酸基末端固定在细胞膜 上，然后以环状负链为模板，从正链的3’-OH末端 延长形成正链。不需要另外合成引物。
3′ 5′
5′
3′
领头链
5′Leabharlann 5′ 随从链3′ 3′
5′
（二）引发体的生成
复制过程需要引物--短链RNA
拓扑异构酶 单链结合蛋白 解链酶 引物酶及引发体 DNA聚合酶 DNA连接酶 引物
冈崎片段
领头链 3′ 5′
随从链 3′
5′
五、 DNA连接酶（ligase）
• 催化两段DNA之间的连接
′
5P
3′ OH
+ 5′ P
γ
P O-
β
O PO Oα-
3′
OH
DNA
ligase +AMP
5′ P
PPi
O 3′ OH
一种是全部轻的14N-14N。为1∶1； 3代：仍有两种分子，但14N-14N增多，为
1∶3； 4代：两者比为1∶7。
DNA半保留复制的证据
细菌 （含15N-DNA)
普通培养基
第一代
普通培养基
普通DNA
普通DNA 重DNA
第二代
重DNA
第十二章 生物化学DNA合成
复制叉
复制泡的两个复制叉向相反方向移动，双链不断解开， 复制不断向两侧推进。新合成的子代链与亲本链互补，并 形成双螺旋结构的子代DNA。
复制叉会合 处复制终点
连续合成
复制起点
复制起点
亲代 亲代 DNA DNA
不连续合成
复 制
三、DNA是半不连续复制的
3′
5′
新链合成是从5′→3′端进行 的其中一条链从起始点开始连 续合成，并与复制叉前进方向 一致——前导链
DNA复制起始必须精确受到调控，因为每个生命周期复制只 发生一次。现已知，复制起始的时序受到DNA甲基化和细菌 细胞质膜相互作用的影响。
E.Coli 的 oriC DNA是由Dam甲基化酶甲基化的，而甲基化
发 生在回文顺序（5′）GATC的腺嘌呤N6 (m6A)，大肠杆菌的
oriC区密布GATC顺序（在245bp的DNA链中含有11个GATC）
P ～ P ～ P
5′
A
5′→3′聚合酶活性
3′ 5′
P P P P P P P P P P P
PPi
P P P P P P
A G C A T C G T A G C A T C G T T C G T A 3′-OH
P P P P
5′
聚合酶催化形成3′磷酸酯键使
单核苷酸随即被添加到3′端
Ⅰ型DNA聚合酶用胰蛋白酶温和处理，可以把5′→3′核
亚基数
1 6（同亚基） 1
功能
识别原点，在特异位点打开DNA双链 DNA解螺旋酶 辅助DnaB与原点结合
HU
引物酶（DnaG) SSB RNA聚合酶 TopoⅡ Dam甲基化酶
19
60 75.6 454 400 32
生物化学简述dna复制过程
生物化学简述dna复制过程DNA复制是指在细胞分裂过程中，DNA分子通过一系列酶的协同作用，复制成两条完全相同的DNA分子的过程。
这个过程是生物体遗传信息传递的基础，也是细胞分裂的前提。
DNA复制的过程可以分为三个主要步骤：解旋、复制和连接。
DNA分子的双螺旋结构需要被解旋。
在细胞分裂的准备阶段，酶复合物会结合到DNA分子的起始位点，解开DNA双螺旋结构，形成一个称为“复制起始点”的开放区域。
该复制起始点是DNA复制的起点，也是DNA复制酶的结合位点。
然后，DNA复制酶开始复制DNA分子。
在复制起始点，一个名为DNA聚合酶的酶复合物结合到DNA分子上，开始合成新的DNA 链。
DNA聚合酶在复制过程中，沿着DNA模板链读取碱基序列，并将对应的互补碱基加入到新合成的DNA链上，形成一个完全相同的DNA分子。
这个过程称为链合成。
在DNA复制过程中，有两个新合成的DNA链是以不同的方式合成的。
一个新合成的链称为“领先链”，它可以沿着DNA模板链连续地合成。
另一个新合成的链称为“滞后链”，它必须以片段的形式合成。
DNA聚合酶在滞后链上合成片段时，需要不断地重新结合到DNA模板链上，形成一个个短的DNA片段。
这些片段称为“Okazaki片段”。
新合成的DNA链需要被连接在一起。
在DNA复制过程中，另一个酶复合物称为DNA连接酶，负责将领先链和滞后链上的DNA片段连接在一起，形成连续的DNA链。
这个过程称为连接。
整个DNA复制过程是一个高度协调和精确的过程。
在细胞分裂过程中，每次DNA复制都需要在正确的时间和位置进行，以确保每个细胞都能获得完整的遗传信息。
此外，DNA复制过程还需要保证复制的准确性，以避免遗传信息的错误传递。
总结起来，DNA复制是生物体遗传信息传递的基础，也是细胞分裂的前提。
它通过解旋、复制和连接三个主要步骤，将DNA分子复制成两条完全相同的DNA分子。
这个过程需要一系列酶的协同作用，以确保复制的准确性和时机的控制。
DNA操作技术
个切割位点。如Bgl II只有6个，BamHI只
有5个，而SalI只有2个，意味着λDNA中
GC含量少于50%。
这种方法只能粗略的估计，只有实验能子（溶液）
酶
缓冲液（一般pH值7.4, 含Mg2+, NaCl, 还原剂如dithiothreitol稳定酶阻止 活）
1.1 核酸酶
作用：降解 磷酸二酯键 分为： 外切酶 内切酶
1.1 核酸酶
Bal 31(来自于细菌Alteromonas espejiana) 单链特异的核酸内切酶活性，
双链特异的内切酶活性。 依赖于Ca2+ 用途： 构建限制酶图谱 产生末端缺失突变 DNA超螺旋线性化
1.1 核酸酶
E. coli外切酶III
识别GATC。也有一些酶识别兼并序
列，如HinfI来自于Haemophilus influenzae品系Rf，识别GANTC，N
代表A, G, T, C。
2.4 限制性内切酶产物
钝端（平端） 粘性末端
粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末 端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成 氢键，所以称为粘性末端。
1.1 核酸酶
RNase H（E. coli）
–降解RNA:DNA杂交分子中 的RNA。
1.2 连接酶
广泛存在于各种生物中，连接3‘端羟基 和5’端磷酸形成磷酸二酯键。在DNA复 制、修复、以及 体外重组
过程中起
重要作用。
1.2 连接酶
T4-DNA连接酶 –连接粘性末端、平端 –修复双链DNA或RNA-DNA杂交
2.2 限制性内切酶分类
限制性核酸内切酶可分为三大类：
– I类 –II类* –III类
生物化学 第十五章 DNA的生物合成
(二)与DNA复制有关的酶和蛋白质（原核生物）
5´ 3´
解旋酶 解链酶 引物酶和引 发体
SSB
RNA引物
DNA聚合 酶III DNA聚合 酶I
3´
5´
RNA引 物
3´
5´
1.DNA聚合酶 DNA聚合酶Ⅰ polⅠ
(1) 具5′
3′聚合酶活性
将脱氧核糖核苷三磷酸 dNTP 逐个添加到具有 3 ′ — OH 末端的 多核苷酸链上形成3， 5—磷酸二酯键。
4. 引发酶（引物合成酶）
引物的合成由引发酶催化完成，这些酶 在模板单链DNA上识别特殊序列，合成RNA引 物。它本身没有活性，需要与“引发前体” 结合在一起，形成“引发体”后才有活性。
复制早期易发生碱基参入错误，用 RNA较好，然后通过polⅠ的5′ 3′端 核酸外切酶的活性切去，代之以dNMP，可 消除最初阶段的错误。
• 2、方向 • DNA复制可以朝一个方向（单向复 制，unidirectional），也可以朝两个相反 方向进行（双向复制，bidirectional，主 要）。
•
DNA复制一般是对称的，两条链同时 进行，也有不对称的，一条链复制完后 再进行另一条链的复制。 • 在迅速生长的原核生物中，第一个染 色体DNA分子的复制还未完成，第二个 DNA分子就在同一个起始点上开始复制。
+
50 复制
转化率
功能
0 .05
修复
1999年发现聚合酶 和，它们涉及DNA的错误倾向修 复（errooune repair）
polⅠ不是DNA复制酶，理由：
A、该酶合成 DNA 速度太慢，只是细胞 内DNA复制速度的1%； B、持续合成能力较低，而细胞内 DNA 复制不会频繁中止； C、许多基因突变都会影响DNA复制， 但都与polⅠ无关。
人工合成基因的方法
人工合成基因的方法人工合成基因是指通过化学方式合成人工DNA或RNA的过程。
它是基因工程领域中的一项重要技术，可以用于研究基因功能、生物医学研究以及生物制药等领域。
人工合成基因的方法可以分为两大类：体外合成和体内合成。
体外合成是利用化学合成的方法在试管中合成人工DNA或RNA。
这一过程通常涉及到三个关键步骤：设计、合成和校对。
首先，合成人工基因需要进行设计。
在设计过程中，研究人员需要明确所需的基因序列，并考虑一些重要的因素，如启动子的选择、是否需要加入标签序列以及是否需要进行构建基因家族等。
其次，合成人工基因需要进行化学合成。
化学合成是指通过将DNA或RNA的核苷酸单元逐个连接起来，逐步构建所需的基因序列。
对于小型基因，这一步骤可以通过使用自动合成仪器进行实现。
而对于较长的基因，则可能需要采用分段合成的策略，将多个片段逐步连接在一起，最终得到完整的基因序列。
最后，合成人工基因需要进行校对。
在合成过程中，由于一些化学反应的不准确性，可能会导致错误的核酸序列出现。
因此，在合成完成后，需要对合成产物进行测序分析，以确保所合成的基因序列的准确性和完整性。
体内合成是指利用活细胞内的合成系统，通过引入合成基因的方法合成人工DNA或RNA。
这一方法相比于体外合成，具有更高的效率和准确性。
体内合成的方法主要有两种：质粒复制和化学合成。
质粒复制是指将所需的基因序列插入到质粒DNA中，并通过转化、转染等方法将质粒DNA导入到细胞内。
在细胞内，质粒DNA会通过细胞自身的复制系统进行复制，从而实现人工基因的合成。
这一方法的优点是操作相对简单，适用于合成较短的基因。
但是，由于依赖于细胞自身的复制系统，合成效率和准确性可能受到一些限制。
化学合成是指直接将化学合成的DNA或RNA引入到细胞内。
这一方法相对于质粒复制而言，可以合成更长的基因序列，并且合成效率和准确性更高。
但是，化学合成的DNA或RNA需要通过适当的手段导入到细胞内，比如利用脂质体、电穿孔等方法。
DNA合成技术及其应用
DNA合成技术及其应用DNA合成技术是一种分子生物学技术，主要利用化学反应合成DNA，可以在实验室中合成各种DNA序列。
DNA是现代生命科学中极其重要的一种分子，它是生命体内基因信息的存储和传递介质。
DNA合成技术的应用领域非常广泛，涉及基因工程、药物研发、生物传感器、纳米技术、医疗等众多领域。
DNA合成技术的原理DNA是由四种核苷酸（腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鳞状细胞素）组成的长链分子。
DNA合成技术利用化学合成方法，按照预先设计的序列将这些核苷酸连接成为一条特定的DNA分子。
一般来说，DNA合成技术主要通过和氧化磷酸酰胺（phosphoramidite）的化学反应实现。
氧化磷酸酰胺带有化学反应所需的活性酯基，可与肽键形成缩合物，并与DNA前体中的核苷酸质子化羟基反应形成磷酸酯键，从而实现肽键和磷酸酯键之间的连接。
DNA合成技术的优势DNA合成技术的主要优势在于，可以合成任意长度和序列的DNA分子，从而实现在实验室中定制特定的DNA序列。
并且与传统的限制酶和连接酶方法相比，DNA合成技术具有更高的精度和效率。
此外，由于合成过程在重复性、可控性和高通量方面表现出色，因此它可以应用于各种基因工程和合成生物学领域的任务。
DNA合成技术的应用1.基因工程领域DNA合成技术在基因工程领域中应用最为广泛。
使用DNA合成技术可以制备基因序列、片段和基因编辑工具（例如CRISPR-Cas9），这是许多基因工程应用领域所必须的基础。
例如，基因编辑可以用于治疗许多疾病（例如癌症和遗传病）。
2.药物研发领域使用DNA合成技术，可以制备具有抗癌活性的免疫疗法药物，该药物通过发挥癌细胞和免疫系统之间复杂相互关系的优势来治疗恶性肿瘤。
此外，DNA合成技术可以帮助人们开发新型药物，包括蛋白质药物和RNA药物。
3.生物传感器领域生物传感器是用于测量生物大分子（例如DNA、蛋白质和病毒）的浓度或活性的技术。
DNA合成技术可以制备具有特定序列的DNA引物，它们可以与目标分子很好地结合，并用于生物传感器中。
生物化学第四节 真核生物DNA生物合成过程
第四节真核生物DNA生物合成过程2015-07-14 71109 0真核生物的基因组复制在细胞分裂周期的DNA合成期（S期）进行。
细胞周期进程在体内受到微环境中的增殖信号、营养条件等诸多因素影响，多种蛋白因子和酶控制细胞进入S期的时机和DNA合成的速度。
真核生物的DNA合成的基本机制和特征与原核生物相似，但是由于基因组庞大及核小体的存在，反应体系、反应过程和调节都更为复杂。
一、真核生物复制的起始与原核生物基本相似真核生物DNA分布在许多染色体上，各自进行复制。
每个染色体有上千个复制子，复制的起始点很多。
复制有时序性，就是说复制子以分组方式激活而不是同步启动。
转录活性高的DNA在S期早期就进行复制。
高度重复的序列如卫星DNA、连接染色体双倍体的部位即中心体( centrosome)和线性染色体两端即端粒(telomere)都是S期的最后才复制的。
真核生物复制起始点比E．coli的oriC短。
酵母DNA复制起始点含11bp 富含AT的核心序列：A(T)TTTATA(G)TTTA(T)，称为自主复制序列(autonomous replication sequence，ARS)。
真核生物复制起始也是打开双链形成复制叉，形成引发体和合成RNA引物。
但详细的机制，包括酶及各种辅助蛋白起作用的先后，尚未完全明了。
复制的起始需要DNA pol α和pol δ参与，前者有引物酶活性而后者有解旋酶活性(表14-2)。
此外还需拓扑酶和复制因子(replication factor，RF)，如RFA、RFC等。
增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen，PCNA)在复制起始和延长中具有关键作用。
PCNA为同源三聚体，具有与E．coli DNA聚合酶Ⅲ的β亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动的DNA夹子，在RFC的作用下PCNA结合于引物-模板链；并且PCNA使pol δ获得持续合成的能力。
dna化学合成的原理
dna化学合成的原理宝子们！今天咱们来唠唠DNA化学合成的原理，这可是个超酷的事儿呢！DNA啊，大家都知道它是生命的密码本。
那化学合成它，就像是我们自己动手打造这个密码本一样。
简单来说呢，DNA化学合成就是用化学的方法一个一个地把核苷酸连接起来，组成我们想要的DNA序列。
咱先来说说核苷酸。
核苷酸就像是DNA的小零件，它有三个部分呢。
一个是磷酸基团，就像是小零件的连接头，负责把一个个核苷酸串起来；还有一个是五碳糖，这就像是小零件的身体部分，稳稳地支撑着整个结构；最后就是碱基啦，碱基可不得了，它就像密码一样，A、T、C、G这四种碱基不同的排列组合就代表着不同的遗传信息。
那在化学合成的时候，我们就像是小工匠一样。
首先得有一些特殊的化学试剂，这些试剂就像是我们的工具。
我们从一端开始，先把第一个核苷酸固定在一个特殊的载体上。
这个载体就像是一个小工作台，让我们的合成工作能稳稳地进行。
然后呢，我们就开始加入下一个核苷酸。
这个时候啊，就要用到一些化学反应啦。
比如说，我们要让新加入的核苷酸的磷酸基团和已经在载体上的核苷酸的羟基发生反应，这样就能把它们连接起来啦。
这个反应就像是把两个小零件用胶水粘起来一样，不过这个“胶水”可是很神奇的化学试剂哦。
在这个过程中，我们还得特别小心碱基的配对。
你想啊，A只能和T配对，C只能和G配对，这是DNA的规则，就像我们玩游戏得遵守游戏规则一样。
要是不小心配错了，那这个DNA可就乱套了，就像密码本被打乱了密码一样。
所以啊，化学家们在合成的时候得时刻盯着，确保碱基配对正确。
而且哦，合成DNA可不是一下子就能完成的。
这是一个逐步的过程，一个一个核苷酸地往上加。
每加一个核苷酸，都要经过一系列的反应和检测。
就像我们搭积木，一块一块小心翼翼地往上搭，还得时不时检查一下搭得对不对。
有时候呢，还会遇到一些小麻烦。
比如说，可能会有一些副反应发生，就像我们做饭的时候偶尔也会有糊锅的情况一样。
这些副反应可能会导致合成的DNA不纯，或者是合成的效率不高。
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化学合成的DNA小片段快速连接(1)
2010-05-16 22:05
摘要:描述一种快速连接DNA小片段的方法。
可以在90分钟内完成整个复杂的DNA小片段与载体的连接。
关键词:DNA小片段快速连接
Rapid Ligation of small synthetic DNA fragments Abstract: A method of rapid ligation of small synthetic fragments DNA to a vector, which can be completed in 90 minutes, is described in this article. And after the phosphorylation of DNA fragments, the ligation became more effective.
Key words: Small fragments of DNA , Rapid Ligation
化学合成的DNA小片段连接一直是载体构建过程中常见而麻烦工作之一，在构建病毒特异抗原决定簇的原核表达载体，RMCE(recombinase mediated cassette exchange,重组酶介导的盒式交换)基因打靶载体，以及RNA干扰载体的时候,都需要将一段长约几十个碱基对的DNA序列定向的连接到载体上。
经典的方法是“首先合成DNA小片段寡核苷酸单链,经退火互补后形成双链,然后酶切回收后连接于载体上”[1]。
但实验过程比较复杂,而且DNA小片段在琼脂糖分离困难,回收效率低，同时没有充分考虑到化学合成的寡核苷酸链末端缺乏活化的磷酸基团和不易用限制性内切酶切割的特点，导致小片段的连接不易一遍成功，可重复操作性差。
因此,DNA小片段的连接是一个需要迫切解决的技术问题。
本研究采用直接化学合成两条互补的带有内切酶粘性末端的寡核苷酸单链，在高浓度ATP存在的情况下，利用T4 PNK（T4 Polynucleotide Kinase，T4
多聚核苷酸激酶）在寡核苷酸链末端加磷，然后单链退火形成双链，跳过胶回收步骤，直接连接的方法，从而实现了在载体上快速连接化学合成的DNA小片段。
极大的减少了试验时间，省去了DNA小片段胶回收的工序，可操作性更强。
下面以一个具体例子来描述具体操作步骤:
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验试剂
干扰载体pGenesil-1、DNA回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自Axygen公司、限制性内切酶Bam HⅠ/Hin d Ⅲ、T4 PNK和T4 DNA连接酶均为TaKaRa公司产品，ATP二钠为普通医用注射液购自药店。
1.1.2寡核苷酸序列合成
设计带有Bam HⅠ/Hin d Ⅲ粘性末端的寡核苷酸序列（退火后，如图1）GATCCGCCTCAT TAACACCCCCTTCTTCAAGAGAGAAGGGGGTGTTAATGAGGTTTTTTGGA AA和AGCT TTTCCAAAAA ACCTCATTAACACCCCCTTCTCTCTTGAAGAAGGGGGTGTTAATGAGG CG 由上海英俊公司（invitrigen）合成。
图 1 设计的两条寡核苷酸单链退火后形成的双链结构
1.2方法
1.2.1寡核苷酸单链加磷及退火反应（大约40分钟完成）
利用PCR仪完成
将合成的寡核苷酸链稀释成100mM,然后各取1μL
5μL ATP-Na
4μL T4 PNK
5μL 10×T4 PNK buffer
加ddH2O到50μL
37℃反应30min，反应完毕后直接升温至95℃保温5min,关闭PCR仪，使其自然冷却到室温。
1.2.2连接和转化
取2μL 与酶切后的pGenesil-1载体片段在T4 DNA连接酶作用下16度进行连接，持续30min左右,转化用TSS(Transformation and storage solution)制备的高效DH5α感受态细菌[2],于37℃培养16h。
1.2.3 质粒的提取、鉴定和测序分析
采用试剂盒提取质粒,应用Bam HⅠ/Hin d Ⅲ酶切鉴定阳性克隆,测序由华大
基因（北京）公司完成。
序列比对使用DNAMAN完成。
2结果与分析
2.1阳性质粒鉴定结果
应用Bam HⅠ/Hin d Ⅲ酶切鉴定阳性质粒,可见化学合成的小DNA片段已经成功连接在pGenesil-1载体上。
2.2 测序结果
测序结果显示化学合成大寡核苷酸序列成功的连接到了pGenesil-1载体上（图2）。
图2. 构建成功的载体测序结果
a.合成的DNA小片段与载体比对，
b.构建的载体测序图,划线序列即为“DNA小片段”
3讨论
化学合成的寡核苷酸几乎必定带有游离的5’羟基[1]。
虽然T4 DNA连接酶的buffer中也含有一定含量的A TP，可以在连接的同时对寡核苷酸链加磷，无论是T4 DNA连接酶还是T4 PNK催化的DNA末端加磷反应是可逆反应，没有足够大量的A TP存在就不能保证产生连接反应需要所需的足量磷酸化DNA片段，同时连接是在双链退火后才进行的，导致T4 DNA连接酶催化的加磷反应实际是发生在DNA已经形成双链的情况下，这种情况下磷酸化反应将优先在没有退火的单链进行，不利于退火双链末端磷酸化，所以我们设计了利用
T4 PNK对化学合成的寡核苷酸在单链状态下进行单独加磷。
根据勒沙特列原理（Le Chatelier's principle），只有在A TP过量的情况下，磷酸化反应才能充分正向进行，在本研究中我们利用A TP二钠替代A TP，除A TP二钠的成本比较低之外，还充分考虑到了这样可以克服A TP不稳定的缺陷。
在过量的A TP二钠存在的条件下，反应30min后，直接升温到95℃，并作用5min，可以使T4 PNK失活，同时打开不正确的链间聚合和链内聚合，使其自然降温到室温，退火反应趋向于吉布斯自由能最小（即ΔG<0，ΔG=ΔG max），使得让变性的DNA单链大部分退火形成正确的双链状态（图1）。
由于退火时间的缩短，同时也减少了末端磷酸化的单链自连现象的发生。
参考文献:
[1]. Sambrook J and Russell D W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed). Beijing: Science press, 2002, (in Chinese)26~66
[2].Chung, C.T., S.L. Niemela and R.H. Miller, One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc Natl Acad Sci U S A, 1989. 86(7): p. 2172-5.。