生物化学中的蛋白质表达和纯化
生物化学与基础分子生物学实验
生物化学与基础分子生物学实验本实验旨在增进学生对于生物化学与基础分子生物学知识的理解，同时也希望借此机会增强学生的实验动手能力和实验数据分析能力。
本实验主要分为两部分，第一部分是生物化学实验，主要包括蛋白质的提取、纯化和酶促反应的研究。
第二部分是基础分子生物学实验，主要涉及DNA的提取、PCR扩增和凝胶电泳检测等。
一、生物化学实验1. 蛋白质的提取蛋白质的提取是研究蛋白质功能和结构的基础。
常用的蛋白质提取方法有机械破碎法、化学破碎法和生物学破碎法等。
本实验以细胞生物学破碎法为主要方法，即利用超声波或手工研磨等方法将细胞破碎。
其中，手工研磨可以选择石英砂或三氧化二铬等研磨介质。
破碎过程中需加入适量浓度等渗液和抑制剂，以防止蛋白质的降解和氧化。
2. 蛋白质的纯化蛋白质的纯化是进一步研究蛋白质结构和功能的关键。
常用的蛋白质纯化方法包括离子交换、凝胶过滤、透析、亲和层析和电泳等方法。
本实验以离子交换和凝胶过滤为主要方法。
其中，离子交换可利用正离子交换和负离子交换两种模式进行，考虑到蛋白质电荷状态的不同以及离子交换树脂的不同选择，从而使得目标蛋白质与其它蛋白质的区分度大大增加。
凝胶过滤则利用凝胶的孔径大小进行分离纯化。
3. 酶促反应的研究酶促反应是生物化学研究的重要组成部分，可以研究酶的特性、动力学以及酶对于特定底物和抑制剂的亲和性等。
本实验选择酶促细胞色素C氧化为模型反应。
反应中需要考虑诸多因素，如温度、pH、反应时间等，同时还需考虑反应体系中酶、底物和抑制剂的摩尔比例关系。
二、基础分子生物学实验1. DNA的提取DNA的提取是基础分子生物学实验的关键步骤，其目的是提高纯度和量。
常用的DNA提取方法有化学法、机械法、热平衡法和离心法等。
本实验以盐酸摇法为主要方法进行DNA的提取。
其中将细胞经过适当处理后加入盐酸和β-己糖苷酯，在恒温和摇动条件下分离得到DNA。
2. PCR扩增PCR是分子生物学中的核心技术之一，是一种复合酶链反应。
蛋白质分离技术的发展及意义
蛋白质分离技术的发展及意义引言：蛋白质是生物体中最重要的基础分子之一，对于生命活动起着不可替代的作用。
蛋白质分离技术的发展可以追溯到19世纪末20世纪初，随着生物学和生物化学研究的深入，蛋白质分离技术也随之不断发展。
本文主要介绍了蛋白质分离技术的发展历程及其在科学研究和应用领域中的意义。
一、蛋白质分离技术的发展历程1.经典的分离技术：最早期的蛋白质分离技术主要是通过溶液的物理化学性质进行分离，如共沉淀法、浓缩法和盐析法等。
这些方法简单易行，但分离效果有限，只能分离出少量的重要蛋白质。
2.电泳技术的发展：20世纪50年代，琼斯等人首次利用凝胶电泳技术分离蛋白质，标志着蛋白质分离技术的重大突破。
随后，人们陆续发展出了多种不同类型的电泳技术，如凝胶电泳、等电聚焦电泳和二维电泳等。
这些电泳技术不仅可以分离蛋白质，还可以从复杂的混合物中分离出不同电点或分子量的蛋白质。
3.亲和层析技术的出现：20世纪60年代，罗尔夫和鲍尔等人首次提出了亲和层析技术，该技术根据蛋白质与亲和树脂之间的特异性结合进行分离。
亲和层析技术具有高效、灵敏、特异性强等优点，成为了蛋白质分离技术中的重要方法。
4.质谱技术的应用：20世纪80年代以后，质谱技术开始得到广泛应用，特别是质谱与分离技术相结合，进一步提高了蛋白质的分离和鉴定能力。
如基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）等技术的出现，使得蛋白质分离技术的分辨率和准确性大大提高。
二、蛋白质分离技术的意义1.生命科学研究：蛋白质是生命的重要组成部分，研究蛋白质的分离和功能可以深入了解生物体的结构和生理过程。
蛋白质分离技术可用于鉴定蛋白质的种类、数量和分子量，从而揭示蛋白质的功能和相互作用关系。
通过蛋白质分离技术，研究人员可以挖掘出分离和鉴定妨碍细胞生长和发育的病理因素，并为疾病的治疗提供新的靶点和方法。
2.药物研发和生物医药产业：蛋白质分离技术在药物研发和生物医药产业中起着重要的作用。
生物化学重点笔记(基本知识)
生物化学重点绪论一、生物化学的的概念：生物化学（biochemistry)是利用化学的原理与方法去探讨生命的一门科学，它是介于化学、生物学及物理学之间的一门边缘学科。
二、生物化学的发展：1．叙述生物化学阶段：是生物化学发展的萌芽阶段，其主要的工作是分析和研究生物体的组成成分以及生物体的分泌物和排泄物。
2．动态生物化学阶段：是生物化学蓬勃发展的时期。
就在这一时期，人们基本上弄清了生物体内各种主要化学物质的代谢途径。
3．分子生物学阶段：这一阶段的主要研究工作就是探讨各种生物大分子的结构与其功能之间的关系。
三、生物化学研究的主要方面：1．生物体的物质组成：高等生物体主要由蛋白质、核酸、糖类、脂类以及水、无机盐等组成，此外还含有一些低分子物质。
2．物质代谢：物质代谢的基本过程主要包括三大步骤：消化、吸收→中间代谢→排泄。
其中，中间代谢过程是在细胞内进行的，最为复杂的化学变化过程，它包括合成代谢，分解代谢，物质互变，代谢调控，能量代谢几方面的内容。
3．细胞信号转导：细胞内存在多条信号转导途径，而这些途径之间通过一定的方式方式相互交织在一起，从而构成了非常复杂的信号转导网络，调控细胞的代谢、生理活动及生长分化。
4．生物分子的结构与功能：通过对生物大分子结构的理解，揭示结构与功能之间的关系。
5．遗传与繁殖：对生物体遗传与繁殖的分子机制的研究，也是现代生物化学与分子生物学研究的一个重要内容。
第一章蛋白质的结构与功能一、氨基酸：1．结构特点：氨基酸(amino acid)是蛋白质分子的基本组成单位。
构成天然蛋白质分子的氨基酸约有20种，除脯氨酸为α-亚氨基酸、甘氨酸不含手性碳原子外，其余氨基酸均为L-α-氨基酸。
2．分类：根据氨基酸的R基团的极性大小可将氨基酸分为四类：①非极性中性氨基酸(8种)；②极性中性氨基酸(7种)；③酸性氨基酸(Glu和Asp)；④碱性氨基酸(Lys、Arg和His)。
二、肽键与肽链：肽键(peptide bond)是指由一分子氨基酸的α-羧基与另一分子氨基酸的α-氨基经脱水而形成的共价键(-CO-NH-)。
基础生化实验-蛋白质纯化
蛋白质纯化一、目的:利用金属亲和性管柱(metal affinity column)来大量纯化带有affinity tag的基因重组蛋白。
二、原理:由于六个Histidine 所组成的His Tag (metal affinity tag)可与Ni2+ bind，所以利用基因重组技术在表现的蛋白质加上His Tag，再以金属亲和性管柱(Ni-NTA) (此His- tag序列可与带二价正电的阳离子相螯和)及liquid chromatography来大量纯化蛋白质。
三、试剂与器材:1.loading(binding) buffer (10mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HClPh7)✧细菌回溶成为蛋白质的载体以保持活性2.wash buffer (20mM imidazole,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)3.elution buffer (20mM EDTA,0.3M NaCl,50Mm Tris-HCl,Ph7)上课补充:✧蛋白质很脆弱，需要在特殊的buffer里。
四、仪器与设备:FPLC(速液相色谱仪)五、步骤:1.将管柱架在铁架上，把亲和性胶体悬浮装填于管柱内。
2.以2~3倍CV loading buffer清洗管柱后，注入蛋白质样本。
3.以wash buffer梳洗，2到3倍column体积。
4.用wash buffer和elution buffer进行线性梳洗，并收集流出液体，以FPLC UV monitor上的OD280数据读取样品流出与否，并观察冲离液之曲线图。
上课补充:✧胞内型分泌需要用超音波破菌，因为会放热所以要放在冰中使用。
✧线性梳洗为加入elution buffer会有颜色变化会把镍离子跟imidazole冲洗掉，剩下胶体溶液。
✧其中imidazole和Histidine类似也会和镍离子结合所以会竞争，可拿来洗涤蛋白质。
2019_2020学年高中生物第四章生物化学与分子生物学技术实践第一节生物成分的分离与测定技术第1课时蛋白质的
第1课时 蛋白质的分离与提取学习导航明目标、知重点难点掌握电泳法分离大分子的原理。
(重点) 运用常用的方法提取和分离蛋白质。
(重、难点)[学生用书P48]一、阅读教材P 71～72分析蛋白质的分离与纯化 1．生物细胞中的蛋白质提取(1)在提取蛋白质时，可以采用研磨与超声波结合的方法将生物组织或细胞完全破碎，使蛋白质从细胞中释放出来，并使其溶解在适当的抽提液中。
(2)抽提液的选择需要根据蛋白质的特性而定，一般酸性蛋白质用偏碱性溶液抽提，碱性蛋白质用偏酸性溶液抽提，脂蛋白等则可用有机溶剂抽提。
2．蛋白质的分离方法(1)离心沉降法：通过控制离心速度，使分子大小、密度不同的蛋白质发生沉降分层。
(2)薄膜透析法：利用蛋白质分子不能透过半透膜的特性，使蛋白质与其他小分子化合物分离的方法。
(3)凝胶色谱法①概念：根据蛋白质分子量的大小差异对其进行有效分离的方法。
②原理a ．凝胶⎩⎪⎨⎪⎧形态：微小的多孔球体组成：大多由多糖类化合物构成结构：内部具有很细微的多孔网状结构b ．分离的过程进入凝胶颗粒内 部的难易程度路程移动速度小分子 蛋白质 容易较长 较慢大分子 蛋白质无法进入 较短 较快二、阅读教材P73～77完成血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及凝胶色谱法分离血红蛋白的操作1．血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳配制试剂→准备器材→架滤纸桥→浸泡薄膜→细心点样→平悬薄膜→实施电泳→染色→漂洗→脱色。
2．凝胶色谱法分离血红蛋白样品处理→血红蛋白的释放、分离和透析→凝胶的制备→色谱柱的装填→样品的加入→洗脱与收集。
判一判(1)酸性蛋白质用酸性溶液抽提，水溶性蛋白质用透析液抽提，脂溶性蛋白质用稀碱性溶液抽提。
(×)(2)电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其电性相反的电极移动的过程。
(√)(3)电泳时泳动速度取决于带电颗粒的大小、形状、所带静电荷多少。
(√)(4)离心沉降法和薄膜透析法分离蛋白质的原理是一样的。
(×)(5)凝胶色谱法是根据蛋白质分子量的大小而对其进行有效分离的方法。
ha tag分子量
ha tag分子量摘要：1.HA tag 简介2.HA tag 分子量3.HA tag 的应用4.结论正文：1.HA tag 简介HA tag，即His-tag，是一种用于蛋白质表达和纯化的标签。
它通常由6 个组氨酸（His）残基组成，并在蛋白质的C 末端。
这种标签可以使蛋白质在表达宿主细胞中更容易被检测和纯化。
HA tag 在不同表达系统中的分子量可能会有所不同，但通常分子量约为10kDa。
2.HA tag 分子量HA tag 的分子量主要取决于其组成的氨基酸残基数量和类型。
如前所述，标准的HA tag 由6 个组氨酸残基组成，因此其分子量相对较小。
在常见的表达系统中，HA tag 的分子量大约为10kDa（即10,000 道尔顿）。
需要注意的是，这个值可能会因为表达宿主细胞、表达载体以及其他表达条件等因素而有所变化。
3.HA tag 的应用HA tag 广泛应用于蛋白质表达和纯化过程中，具有以下优点：（1）HA tag 可以提高蛋白质的表达水平，使得目标蛋白质在细胞内更容易被检测和纯化。
（2）HA tag 可以用于蛋白质的纯化。
由于组氨酸残基具有较高的负电荷，可以通过离子交换或凝胶过滤等方法进行纯化。
（3）HA tag 可以用于蛋白质的定量。
通过测量含有HA tag 的蛋白质的分子量，可以推算出目标蛋白质的表达量。
（4）HA tag 可以方便地进行蛋白质的检测。
由于组氨酸残基在蛋白质中具有较高的亲和力，可以通过Western blot 等方法检测蛋白质的表达。
4.结论HA tag 作为一种广泛应用于蛋白质表达和纯化的标签，具有分子量适中、易于检测和纯化等优点。
这些优点使得HA tag 成为分子生物学、生物化学和生物技术研究领域的重要工具。
生物化学第一章蛋白质化学
组成蛋白质的元素：
主要元素组成： 碳(C) 50% ~ 55% 氧(O) 19% ~ 24% 氢(H) 6% ~ 8% 氮(N) 13% ~ 19% 硫(S) 0% ~ 4%
少量的 磷(P)、铁(Fe)、铜(Cu)、锌(Zn)和碘(I)等
蛋白质元素组成特点：
各种蛋白质含氮量很接近，平均为16％
故可根据以下公式推算出蛋白质的大致含量： 样品中蛋白质的含量〔g〕
脱水作用
脱水作用
－－
碱
酸－
－
－
－－ －
不稳定的蛋白质颗粒
带负电荷的蛋白质
溶液中蛋白质的聚沉
〔三〕蛋白质的变性、沉淀与凝固
1. 蛋白质的变性〔denaturation〕 在某些理化因素作用下，蛋白质的构
象被破坏，失去其原有的性质和生物活性， 称为蛋白质的变性作用。
变性后的蛋白称为变性蛋白质。
常见的变性因素：
2. 极性中性氨基酸
R-基含有极性基团； 生理pH条件下不解离。 包括7个：
甘氨酸(Trp)、 丝氨酸(Ser)、
半胱氨酸(Cys)、 谷氨酰胺(Gln)、 天冬酰胺(Asn)、 酪氨酸(Tyr) 苏氨酸(Thr)
3. 酸性氨基酸
R-基有COOH(COO-)
带负电荷
4. 碱性氨基酸
R-基有NH2(NH3+)
牛胰核糖核酸酶的变性与复性
尿素或盐酸胍 β-巯基乙醇
透析
有活性
无活性
〔二〕一级构造与功能的关系 1.一级构造相似的蛋白质功能相似 一级构造不同的蛋白质功能不同
胰岛素的一级构造及种属差异
一级构造不同的蛋白质功能不同
ACTH 促肾上腺素皮质激素
MSH 促黑激素
蛋白质工程的基本流程
蛋白质工程的基本流程
蛋白质工程是一门综合性的学科，涉及生物化学、分子生物学、生物信息学等
多个学科的知识。
它是通过对蛋白质结构和功能的理解，利用现代生物技术手段对蛋白质进行改造和设计，以获得具有特定功能的蛋白质。
蛋白质工程的基本流程可以分为蛋白质筛选、蛋白质改造和蛋白质表达等几个步骤。
首先，蛋白质工程的第一步是蛋白质筛选。
这一步骤是通过对生物体内已有的
蛋白质进行筛选，找到具有特定功能或性质的蛋白质。
筛选的方法包括从天然资源中分离纯化蛋白质，或者通过生物信息学方法对已知蛋白质进行筛选和鉴定。
在这一步骤中，需要对蛋白质的结构和功能进行全面的了解，以便确定需要改造的目标蛋白质。
接着，蛋白质工程的第二步是蛋白质改造。
在确定了需要改造的目标蛋白质后，需要利用现代生物技术手段对蛋白质进行改造和设计。
这包括对蛋白质的基因进行重组、突变或者融合，以获得具有特定功能或性质的蛋白质。
在这一步骤中，需要运用基因工程、蛋白质结构预测等技术，对蛋白质进行精准的改造和设计。
最后，蛋白质工程的第三步是蛋白质表达。
经过蛋白质改造后，需要将蛋白质
的基因表达到宿主细胞中，以获得大量的目标蛋白质。
这一步骤涉及到对宿主细胞的选择、转染和表达条件的优化等多个方面。
在这一步骤中，需要对蛋白质的表达水平、纯化方法等进行全面的考虑，以获得高纯度、高活性的目标蛋白质。
总的来说，蛋白质工程的基本流程包括蛋白质筛选、蛋白质改造和蛋白质表达
等几个步骤。
通过对这些步骤的精准操作和优化，可以获得具有特定功能或性质的蛋白质，为生物医药、工业生产等领域提供重要的研究基础和应用前景。
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生物化学中的蛋白质表达和纯化蛋白质是细胞中最基本的生物大分子之一，具有重要的结构和
功能作用。
在生化实验研究中，常常需要大量的蛋白质作为实验
材料。
蛋白质表达和纯化技术是生物化学研究中的关键技术之一。
本文将简要介绍蛋白质表达和纯化的原理和方法。
一、蛋白质表达技术
蛋白质表达是将目的基因转录成RNA后再翻译成蛋白质的过程。
蛋白质表达主要有原核细胞和真核细胞两种方法。
原核细胞
表达系统主要利用大肠杆菌，真核细胞表达系统则使用哺乳动物
细胞，其主要的表达技术有以下几种：
（一）重组蛋白质大规模表达
重组蛋白质是指人为构建的同源或异源蛋白序列，利用基因工
程技术将其导入到表达宿主中进行高效表达的蛋白质。
大肠杆菌
是目前最常用的宿主。
一般来说，要将目的基因插入到选择性表
达载体中，选用合适的启动子和终止子，将目的蛋白质与标签结
合。
表达宿主随后被转化，蛋白质在生长过程中表达出来，随后进行纯化和鉴定。
（二）GST融合蛋白表达
GST融合蛋白是利用GST (glutathione S-transferase)标签的蛋白质，将GST和目的蛋白质融合在一起表达，然后通过Glutathione 亲和层析纯化方法纯化目的蛋白质。
GST融合蛋白可以提高目的蛋白质的稳定性和可溶性，使得其在细胞内表达更加稳定。
（三）His标签蛋白表达
His标签是一种聚组氨酸标签，可以与Ni2+螯合，因此可采用Ni2+亲和层析的方法纯化。
His标签融合蛋白表达时选择了较少的氨基酸标签，对目标蛋白的生物学性质和功能影响较小。
二、蛋白质纯化技术
蛋白质表达和纯化是蛋白质生物化学研究的关键。
通常情况下，表达宿主细胞中的蛋白质必须经过纯化才能得到纯净的蛋白质，
获得足够高纯度的蛋白质可用于测定其结构和功能。
（一）离子交换层析法
离子交换层析法是利用蛋白质负荷（或正荷）的离子性质与相
应的离子交换质团之间进行选择性结合的纯化方法。
离子交换层
析法分为阴离子交换层析和阳离子交换层析两种。
（二）凝胶过滤层析法
凝胶过滤层析法是利用分子量差异而进行分离的一种纯化方法。
凝胶过滤层析操作简单，包容性较强，可有效消除杂质，因此常
被用于初步纯化和柱前处理。
（三）亲和层析法
亲和层析法是通过靶标蛋白本身与某种化合物反应，形成化学
亲和作用进行分离纯化。
亲和层析法成本高，但可以快速、高效、
简便地获得高纯度的蛋白质样品，因此是实验室中最常见的蛋白质纯化方法。
（四）分子筛分离法
分子筛分离法是利用分子筛分离小分子和大分子，是利用小分子在固体表面的极静电吸引力，从而使大分子得以从混合体系中拓扑出的纯化方法。
总之，蛋白质表达和纯化技术是生物化学研究中至关重要的技术，为了得到足够高纯度的蛋白质，需要根据目标蛋白质的特性选择合适的表达宿主和纯化方法。
对于蛋白质表达和纯化中存在的问题，生化学家们还将继续进行深入的研究，不断完善生物化学技术理论，从而推动生物医学领域的进步。