第六章I_目的基因与载体的连接
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末端转移酶还可用于DNA片段末端的 标记。
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总结： 同聚物加尾法就是利用末端转移酶
的可催化dNTP加到单链或双链DNA 的３′-OH的能力，在目的DNA和质 粒载体上加入互补同聚物，两者再通 过互补同聚物间的氢键，形成重组子。
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优点：通过DNA加尾，既可以使两个 具平末端的DNA片段进行连接，也可 以使具平末端的DNA片段与粘性末端 的DNA片段进行连接。
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① 3‘凹端补平：使用大肠杆菌DNA聚
合酶I Klenow片段部分补平3’凹端，将
不匹配的3‘凹端转换为粘端；或者完全
补平，产生平端DNA分子，可与任何其
他平端DNA相连接。
5‘
3‘
3‘
5'
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② 3‘突端切除：T4噬菌体DNA聚合酶具 有强烈的3’-5’外切核酸酶活性，可将 3‘突端切除。
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转录
起始 点
插入功能基因
的位点
启动子 操纵子
表达
目的
基因
5’
调控
报告基因
机能
基因
3’
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二、连接前的处理
为了将目的基因重组于载体分子之中，需要将载 体DNA和目的基因分别进行适当处理，使其可以互 相连接，形成新的重组分子。 1.对载体的要求： 一般采用限制性内切酶法将载体DNA分子切割成可 与外源基因连接的线性分子.载体DNA通常有着许 多酶切位点．但是并不是所有的酶切位点都可用于 重组切割，理想的酶切位点应该符合下列几个条件: 1） 位于载体上特定的酶切位点要尽可能少,最好是 单一酶切位点,这样才能保证目的基因和载体DNA 以最高的几率正确组合.
1) 上述方法的缺点：由限制酶产生的具有粘性末端 的载体DNA分子，在连接反应中常发生自我环化作 用，并在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合 环状结构。
2) 解决方法：用细菌的碱性磷酸酶预先处理线性的载 体DNA分子，去除其5‘末端的磷酸基。
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（三）同聚物加尾法
末端脱氧核苷酸转移酶的作用底物可以是具 3′-OH末端的单链片段，也可以是具3'OH突出末端的双链片段。
此酶在不需要模板链的情况下，就能将脱氧 核苷酸加到单链的3‘-OH基团上，并按 5’→3’方向聚合。
当反应物中只存在一种脱氧核苷酸的时候， 便能构成由同一种类型核苷酸组成的尾巴， 如poly（dA）等，因此任何两条DNA分 子
(2) 对某一基因的上游序列进行调控机能分析， 则需考虑选择适当的报告基因，并将可能
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具有调控机能的目的基因置于报告基因 的上游适当位置。 ➢ 若调控基因可能有增强子（其特点一 是位置变化大、二是其作用无明显方 向性）作用，还应在报告基因下游适 当部位设计一个插入位点，以插入一 个功能基因，由此反映增强子的作用。
2、简要说明目的基因与载体DNA分子的5种 连接方法。
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③ 平端加上人工合成接头：合成接头是 自相互补的两个化学合成的寡核苷酸的 等摩尔混合物，而两个寡聚体可形成带 一个或多个限制性酶切位点的平端双链 体。因此在平端DNA加接头可为其亚克 隆操作增加一个或多个限制性酶切位点。
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三．基因与载体的连接(5种方法)
载体DNA和目的基因DNA的连接,按 DNA片段末端性质不同，可有下述不同的 连接方法：
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人工接头连接法的优缺点
优点：此法是进行DNA重组的一种既有效又实用 的手段，兼具有同聚物加尾法和粘性末端连接法 的优点，而且它可以根据实验的不同要求，设计 出具有不同限制酶位点的人工接头。若在体外连 接反应中增加人工接头的浓度，还会大大提高平 末端DNA片段间的连接效率。
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故在平端DNA片段连接工作中，常增加 DNA的浓度，同时用数倍于粘性末端连接 的连接酶处理，以期获得比较满意的连接 结果。
有时载体DNA片段是平末端，而目的基因 却是粘性末端，那就需要处理，使载体 DNA和目的基因的末端一致，通常是将目 的基因的粘性末端修饰成平末端，即添补 法和消除法。
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首先将人工合成的连杆与待连接的1种或 2种DNA片段连接起来；
再用适当的限制酶切割具人工合成的连杆 的目的DNA分子和克隆载体分子，使二 者都产生出彼此互补的粘性末端，这样便 可以按照常规的粘性末端连接法，将目的 DNA片段同载体连接成为重组分子。
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2.不同限制酶切位点连接:
由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段、 具有相同类型的粘性末端，彼此称为配伍(互补)末 端也可以采用粘性末端连接.
如，同尾酶切割可以产生完全配伍的粘性末端， 便于两个DNA片段的连接.用同属于GATC族的 Mbo1(vGATC)和BamHI(GvGATCC)；TCGA族的 Xho1(CvTCGAG)和Sal1(GvTCGAC)等等，共七族、 30多个限制性核酸内酶，切割DNA后，均可与相应 的配伍末端相互连接。
① 粘性末端连接法 ② 平端连接法 ③ 同聚物加尾连接法 ④ 人工接头连接法 ⑤ 加衔接物连接法
（一）粘性末端DNA片段的连接
1. 同一限制酶切位点连接: 由同一限制性核酸内切酶 切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要①酶 切割产生单链突出的粘性末端②酶切位点附近的DNA 序列不影响连接 .在连接酶的作用下即可形成重组 DNA分子.
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2、连接前的处理：末端的转换
当载体和外源DNA用同样的限制性内切 酶，或是用能够产生相同的粘性末端的同 裂酶等切割时，所形成的DNA末端就能够 彼此退火（相匹配、相配伍），可以被T4 连接酶共价地连接起来，形成重组体分子。
但是,当靶片段的末端与载体不匹配时，必 须转换其中一个或两个片段的末端形式以 便使之连接。这种末端的转换通常用以下 三种方式转换：
第6章I 目的基因与载体 的连接（重组）
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一.基因重组—基因工程的核心
1、 外源DNA片段同载体分子连接的方法，即 DNA分子体外重组技术，主要是依赖于限制 性核酸内切酶和DNA连接酶的作用.
基因重组: 就是利用 限制性内切酶及其他一 些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基 因．将两者连接起来，将目的基因插入于可 以自我复制的载体内，再转入受体细胞，以 期这种外源性的目的基因在受体细胞内得到 扩增或正确表达。
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第五章 复习题
一、填空题
1、若表达有价值的蛋白质，应考虑选用适当
的启动子、增强子等调节序列和终止序列，
要将目的基因置于启动子的转录起始点
的
位置，并审视“阅读框”是否正
确。
2、若对某一基因的上游序列进行调控机能分
析， 则需考虑选择适当的报告基因，并将可
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只要分别获得poly(dA)和poly(dT) 尾巴，就会彼此连接起来。这种连接 DNA分子的方法叫同聚物加尾法。
在特殊反应液(Co2+代替Mg2+)中， 平末端DNA也可以作底物, 而且4种 dNTP中任何一种都可以作反应的前 体，即给平末端DNA 3′-OH的末端， 加上4种同聚物“尾巴”。
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2、连接前的准备：
依不同的研究目的而定，认真设计最终构 建的重组体分子。需要考虑下列2个方面。 如果研究目的是：
(1) 表达有价值的蛋白质，要考虑选用适当的启 动子、增强子等调节序列和终止序列，要将目 的基因置于启动子的转录起始点的下游，并审 视“阅读框”是否正确，这些对表达融合蛋白 至关重要。
（二）平端连接
一些内切酶如HaeⅢ和HpaⅠ切割产生 DNA的片段没有粘性末端，而是平末端。
具有平末端的酶切载体只能与平末端的目 的基因连接。
T4DNA连接酶可催化相同或不相同的限制 性内切酶切割的平端间的连接。
平端连接比粘性末端连接要困难的多，其 连接效率很低，约有粘性末端连接的1%。
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2) 在酶切位点之前要有一个较强的启动子， 使插入的目的基因可在该启动子的指导下高 效表达。比如：高效表达质粒 pMH62l的 Bgl2位点前有一个OMP多肽基因启动子 OMPF，外源基因插入后可以表达出外源基 因与OMP多肽融合的蛋白。其突出优点是因 OMP多肽是细菌外膜蛋白(outer membrane protein, OMP)的主要成分，从 而可使外源基因能在细菌外膜上表达, 十分 有利于目的基因产物的收获和提取.
缺点：只对质粒载体有效；质粒和 cDNA上的同聚物长度难以控制相等， 影响克隆效率；用其转化宿主菌的效 率依不同菌株而有较大差异。
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（四）人工接头连接法
人工接头（DNA寡核苷酸连杆）是化 学合成的核苷酸寡聚体，可带有一个 或几个限制性酶切位点的平末端双链 寡核苷酸短片段（一般由8-12个核苷 酸组成）。如图所示。
缺点：如果待克隆的DNA片段或基因的内部，也 含有与所加的人工接头相同的限制酶切位点，这 样在酶切消化人工接头产生粘性末端的同时，也 会把克隆的外源基因切成不同的片段，从而为后 继的操作造成麻烦。
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（五）加DNA衔接物连接法
DNA衔接物也是人工合成的一小段双链寡 核苷酸，与人工接头不同的是一头为平整 末端（与双链目的DNA平端连接），另一 头带有某种限制酶的粘性末端（与载体的 相应粘端连接）。它在与双链目的DNA连 接后无需限制酶消化，便可与去磷酸化载 体DNA进行连接反应，如图所示。
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能具有调控机能的目的基因置于报告基
因的
适当位置。
3、若某一目的基因可能有增强子作用，则应
在报告基因
的适当部位设计一个
插入位点，以插入一个功能基因，并由此
来反映增强子的作用。
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二、简答题
1、在人工重组时，当目的基因DNA末端与 载体末端不匹配时，必须转换其中一个或 两个片段的末端形式以便使之连接。请说 出末端转换的主要方法和转换使用的主要 工具酶是什么？
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总结： 同聚物加尾法就是利用末端转移酶
的可催化dNTP加到单链或双链DNA 的３′-OH的能力，在目的DNA和质 粒载体上加入互补同聚物，两者再通 过互补同聚物间的氢键，形成重组子。
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优点：通过DNA加尾，既可以使两个 具平末端的DNA片段进行连接，也可 以使具平末端的DNA片段与粘性末端 的DNA片段进行连接。
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① 3‘凹端补平：使用大肠杆菌DNA聚
合酶I Klenow片段部分补平3’凹端，将
不匹配的3‘凹端转换为粘端；或者完全
补平，产生平端DNA分子，可与任何其
他平端DNA相连接。
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② 3‘突端切除：T4噬菌体DNA聚合酶具 有强烈的3’-5’外切核酸酶活性，可将 3‘突端切除。
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插入功能基因
的位点
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目的
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机能
基因
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二、连接前的处理
为了将目的基因重组于载体分子之中，需要将载 体DNA和目的基因分别进行适当处理，使其可以互 相连接，形成新的重组分子。 1.对载体的要求： 一般采用限制性内切酶法将载体DNA分子切割成可 与外源基因连接的线性分子.载体DNA通常有着许 多酶切位点．但是并不是所有的酶切位点都可用于 重组切割，理想的酶切位点应该符合下列几个条件: 1） 位于载体上特定的酶切位点要尽可能少,最好是 单一酶切位点,这样才能保证目的基因和载体DNA 以最高的几率正确组合.
1) 上述方法的缺点：由限制酶产生的具有粘性末端 的载体DNA分子，在连接反应中常发生自我环化作 用，并在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合 环状结构。
2) 解决方法：用细菌的碱性磷酸酶预先处理线性的载 体DNA分子，去除其5‘末端的磷酸基。
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（三）同聚物加尾法
末端脱氧核苷酸转移酶的作用底物可以是具 3′-OH末端的单链片段，也可以是具3'OH突出末端的双链片段。
此酶在不需要模板链的情况下，就能将脱氧 核苷酸加到单链的3‘-OH基团上，并按 5’→3’方向聚合。
当反应物中只存在一种脱氧核苷酸的时候， 便能构成由同一种类型核苷酸组成的尾巴， 如poly（dA）等，因此任何两条DNA分 子
(2) 对某一基因的上游序列进行调控机能分析， 则需考虑选择适当的报告基因，并将可能
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具有调控机能的目的基因置于报告基因 的上游适当位置。 ➢ 若调控基因可能有增强子（其特点一 是位置变化大、二是其作用无明显方 向性）作用，还应在报告基因下游适 当部位设计一个插入位点，以插入一 个功能基因，由此反映增强子的作用。
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③ 平端加上人工合成接头：合成接头是 自相互补的两个化学合成的寡核苷酸的 等摩尔混合物，而两个寡聚体可形成带 一个或多个限制性酶切位点的平端双链 体。因此在平端DNA加接头可为其亚克 隆操作增加一个或多个限制性酶切位点。
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三．基因与载体的连接(5种方法)
载体DNA和目的基因DNA的连接,按 DNA片段末端性质不同，可有下述不同的 连接方法：
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人工接头连接法的优缺点
优点：此法是进行DNA重组的一种既有效又实用 的手段，兼具有同聚物加尾法和粘性末端连接法 的优点，而且它可以根据实验的不同要求，设计 出具有不同限制酶位点的人工接头。若在体外连 接反应中增加人工接头的浓度，还会大大提高平 末端DNA片段间的连接效率。
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故在平端DNA片段连接工作中，常增加 DNA的浓度，同时用数倍于粘性末端连接 的连接酶处理，以期获得比较满意的连接 结果。
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首先将人工合成的连杆与待连接的1种或 2种DNA片段连接起来；
再用适当的限制酶切割具人工合成的连杆 的目的DNA分子和克隆载体分子，使二 者都产生出彼此互补的粘性末端，这样便 可以按照常规的粘性末端连接法，将目的 DNA片段同载体连接成为重组分子。
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2.不同限制酶切位点连接:
由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段、 具有相同类型的粘性末端，彼此称为配伍(互补)末 端也可以采用粘性末端连接.
如，同尾酶切割可以产生完全配伍的粘性末端， 便于两个DNA片段的连接.用同属于GATC族的 Mbo1(vGATC)和BamHI(GvGATCC)；TCGA族的 Xho1(CvTCGAG)和Sal1(GvTCGAC)等等，共七族、 30多个限制性核酸内酶，切割DNA后，均可与相应 的配伍末端相互连接。
① 粘性末端连接法 ② 平端连接法 ③ 同聚物加尾连接法 ④ 人工接头连接法 ⑤ 加衔接物连接法
（一）粘性末端DNA片段的连接
1. 同一限制酶切位点连接: 由同一限制性核酸内切酶 切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要①酶 切割产生单链突出的粘性末端②酶切位点附近的DNA 序列不影响连接 .在连接酶的作用下即可形成重组 DNA分子.
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2、连接前的处理：末端的转换
当载体和外源DNA用同样的限制性内切 酶，或是用能够产生相同的粘性末端的同 裂酶等切割时，所形成的DNA末端就能够 彼此退火（相匹配、相配伍），可以被T4 连接酶共价地连接起来，形成重组体分子。
但是,当靶片段的末端与载体不匹配时，必 须转换其中一个或两个片段的末端形式以 便使之连接。这种末端的转换通常用以下 三种方式转换：
第6章I 目的基因与载体 的连接（重组）
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一.基因重组—基因工程的核心
1、 外源DNA片段同载体分子连接的方法，即 DNA分子体外重组技术，主要是依赖于限制 性核酸内切酶和DNA连接酶的作用.
基因重组: 就是利用 限制性内切酶及其他一 些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基 因．将两者连接起来，将目的基因插入于可 以自我复制的载体内，再转入受体细胞，以 期这种外源性的目的基因在受体细胞内得到 扩增或正确表达。
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一、填空题
1、若表达有价值的蛋白质，应考虑选用适当
的启动子、增强子等调节序列和终止序列，
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2、若对某一基因的上游序列进行调控机能分
析， 则需考虑选择适当的报告基因，并将可
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在特殊反应液(Co2+代替Mg2+)中， 平末端DNA也可以作底物, 而且4种 dNTP中任何一种都可以作反应的前 体，即给平末端DNA 3′-OH的末端， 加上4种同聚物“尾巴”。
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2、连接前的准备：
依不同的研究目的而定，认真设计最终构 建的重组体分子。需要考虑下列2个方面。 如果研究目的是：
(1) 表达有价值的蛋白质，要考虑选用适当的启 动子、增强子等调节序列和终止序列，要将目 的基因置于启动子的转录起始点的下游，并审 视“阅读框”是否正确，这些对表达融合蛋白 至关重要。
（二）平端连接
一些内切酶如HaeⅢ和HpaⅠ切割产生 DNA的片段没有粘性末端，而是平末端。
具有平末端的酶切载体只能与平末端的目 的基因连接。
T4DNA连接酶可催化相同或不相同的限制 性内切酶切割的平端间的连接。
平端连接比粘性末端连接要困难的多，其 连接效率很低，约有粘性末端连接的1%。
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缺点：只对质粒载体有效；质粒和 cDNA上的同聚物长度难以控制相等， 影响克隆效率；用其转化宿主菌的效 率依不同菌株而有较大差异。
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（四）人工接头连接法
人工接头（DNA寡核苷酸连杆）是化 学合成的核苷酸寡聚体，可带有一个 或几个限制性酶切位点的平末端双链 寡核苷酸短片段（一般由8-12个核苷 酸组成）。如图所示。
缺点：如果待克隆的DNA片段或基因的内部，也 含有与所加的人工接头相同的限制酶切位点，这 样在酶切消化人工接头产生粘性末端的同时，也 会把克隆的外源基因切成不同的片段，从而为后 继的操作造成麻烦。
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DNA衔接物也是人工合成的一小段双链寡 核苷酸，与人工接头不同的是一头为平整 末端（与双链目的DNA平端连接），另一 头带有某种限制酶的粘性末端（与载体的 相应粘端连接）。它在与双链目的DNA连 接后无需限制酶消化，便可与去磷酸化载 体DNA进行连接反应，如图所示。
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因的
适当位置。
3、若某一目的基因可能有增强子作用，则应
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二、简答题
1、在人工重组时，当目的基因DNA末端与 载体末端不匹配时，必须转换其中一个或 两个片段的末端形式以便使之连接。请说 出末端转换的主要方法和转换使用的主要 工具酶是什么？