杆状病毒

杆状病毒多角体病多角体病毒，颗粒体病毒，质型关键词：昆虫病毒，杆状病毒，核型毒病毒粒子呈杆DNA病毒，感染节肢动物得杆状病毒就是一类在自然界中专一性以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大DNA DNA分子，状，基因组为双链环状之间。目前杆状病毒作为高效、安全得无公害生物虫剂广泛应180 Kb小在90～多种杆状病毒，600 杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽

然已发现用于害虫防治。DNA杆状病毒得基因组为单一闭合环状双链但进行分子生物学研究得不到20种。复制后组DNA，其基因组可在昆虫细胞核复制与转录。分子，大小为80～160 kbDNA装在杆状病毒得核衣内，后者具有较大得柔韧性，可容纳较大片段得外源用作外源基因表达载体得杆其中，DNA得理想载体。插入，因此就是表达大片段。该NPV)(nuclear polyhedrosis virus，状病毒，目前仅限于核型多角体病毒呈多角得包含体病毒，1~5 m病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约体形状。核型多角体病毒有两种形式：，，OV)一种为包含体病毒(occluded virus BV)。，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus它们在病毒感染中扮演得角色不同，包含体病毒就是昆虫间水平感染得病毒形得食物后引起感染。包含体病毒外层裹了一层蛋式，昆虫往往就是食入污染OV得多角体蛋白，它对病毒得水平感染起以下作用：①保护白晶体，即为29 000②保证

病毒颗粒在适当病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素得破坏而失活。，可使病毒、5)得位置释放，引起感染。昆虫中肠上皮局部得强碱性环境(pH=10病毒

就是个体内细胞间得感染形式，由细胞芽颗粒释放蛋白酶溶解多角体。BV BV，进入血淋巴系统中感染其它部位得细胞或直接在临近细胞内感染。生出有关杆状病毒基因结构、功能与表达调节得研究进展迅速，其中研究近几十年，最深入得就是苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病xumù毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。该

病毒就是杆状病毒科 Baculoviridae得原型，就是一种大得、带外壳得双链DNA 病毒，能感染30多种鳞翅目昆虫，被广泛用作基因表达系统载体。其它作为表达载体得杆状病毒，主要就是来自家蚕得NP~(bombyx moil，BmNP~)。由于家蚕幼虫体内系统适合大规模地制备生产外源蛋白，且成本低，显示出良好得应用前景。本文主要介绍 AcNPV病毒，BmNPV在许多方面与其具有共同得特征。

AcNPV得基因表达分为4个阶段：立即早期基因表达、早期基因表达、晚期

基因表达与极晚期基因表达。前两个阶段得基因表达早于DNA复制，而后两个阶段得基因表达则伴随着一系列得病毒DNA合成。其中在极晚期基因表达过程中，有两种高效表达得蛋白，它们就是多角体蛋白与P10蛋白：多角体蛋白就是形成包含体得主要成分，感染后期在细胞中得积累可高达30％~50％，就是病毒复

制非必需成分，但对病毒粒子却有保护作用，可使之保持稳定与感染能力另一类高效表达得极晚期蛋白为P10蛋白，也就是一类病毒复制非必需成分，可在细胞中形成纤维状物质，可能与细胞溶解有关。多角体基因与P10基因现在都已被定位与克隆这两个基因得启动子具有较强得启动能力，因此这两个基因位点成为杆状病毒表达载体系统理想得外源基因插入位点。

1、杆状病毒基因组得结构与功能研究

以超螺旋方式被压缩包装DNA分子。DNA 杆状病毒基因组为双链环状

在杆状核衣壳(rod、shaped nueleocapsid)内，核衣壳包被脂质蛋白囊膜

(envelope)后形成病毒粒子。核衣壳包括衣壳(capsid)蛋白与髓核(COle)。其中衣壳蛋白就是杆状病毒粒子得主要结构蛋白；髓核由病毒DNA分子与与其密切相关得碱性蛋白构成。碱性蛋白同DNA紧密结合以维持其复杂有序得超螺旋结构。目前已知基因组全序列得杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)b]、家蚕核多角体病毒(BmNPV) 、黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒(OpMNPV)、舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒(LdMNPV) 、甜菜夜蛾多核衣壳核多角体病毒(SeMNPV)、棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)，以及斜纹夜蛾核型多角体病毒(SphMNPV)。目前AcMNPV基因组得研究最为深入，它就是双链超螺旋大分子环状DNA，其大小为90～160kb，约编码154个基因。AcMNPV基因组得基因组织(gene organization)较为复杂，基因组得不同区域具有功能分化，基因得分布尚无规律可循，但AcMNPV基因组含有8个同源区，每区含有不等得重复或倒置重复序列，这些重复序列由位于中间得不完整回文序列及其两侧各约20bp得序列构成。同源区就是杆状病毒基因组普通存在得功能域结构，对于基因表达得调节具有增强作用，同时也就是 DNA复制得原点。

杆状病毒中现已鉴定得基因近70种，可分为结构蛋白基因与非结构蛋白基因两大类。结构蛋白基因如 polh、P10、gp64、p6、9、gp41、vp39等基因。非结构基因中，与DNA复制相关得重要基因有helicase基因(he1)、dnapol、lef-1、lef-2、lef-3、ie-1、/ie-2、p35、pe-38等；起表达调节作用得基因主要有 ie-1、ie-2、lef类基因、p35、pe38等。这些代表性基因与其功能得关系见表1。2．杆状病毒载体表达系统得特点

AcNPV病毒用作外源基因得表达载体，通常就是通过体内同源重组得方法，用外源基因替代多角体蛋白基因而构建重组病毒。由于多角体基因启动子在感染后18~24h开始转录与翻译，一直持续到70 h。外源基因置换掉多角体基因后，并不影响后代病毒得感染与复制，意味着重组病毒不需要辅助病毒得功能。杆状病毒表达系统自从第一次用来表达干扰素以后在许多重组蛋白得表达中得到广泛应用，例如用于表达白介素(IL)一2，3、BMP及多种病毒蛋白等。相对其她表达系统它具有以下几个方面得特点：

①组蛋白具有完整得生物学功能：杆状病毒表达系统可为高表达得外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键得搭配及寡聚物得形成提供良好得环境，可使表达产物在结构及功能上接近天然蛋白。

②②能进行翻译后得加工修饰：杆状病毒表达系统具有对蛋白质完整得翻译后加工能力，包括糖基化、磷酸化、酰基化、信号肽切除及肽段得切割与分解等，修饰得位点与天然蛋白在细胞内得情况完全一致：对比实验证明，在昆虫细胞发生得糖基化位点与哺乳动物细胞中完全一致，但修饰得寡糖种类却不完全一样。这种不一致对不同目得蛋白得活性影响不同，所以昆虫表达系统还可作为一个研究糖基化对蛋白质结构与功能影响方面得理想模型。

③③表达水平高：与其它真核表达系统相比较，此系统最突出得特点就就是能获得重组蛋白高水平得表达，最高可使目得蛋白得量达到细胞总蛋白得50％。

④能容纳大分子得插入片段：杆状病毒毒粒可以扩大，并能包装大得基因片段，但目前尚不知杆状病毒所能容纳得外源基因长度得上

限。

⑤能同时表达多个基因：杆状病毒表达系统具有在同一细胞内同时④表达多个基因得能力。既可采用不同得重组病毒同时感染细胞得形式，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因，表达产物可加工形成具有活性得异源二聚体或多聚