杆状病毒表达蛋白
非洲猪瘟病毒p30蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与免疫检测
·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报非洲猪瘟病毒p30蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与免疫检测摘 要：p30蛋白是非洲猪瘟病毒（ASFV ）免疫原性最强的结构蛋白之一，由CP204L 基因编码。
本研究利用Bac-to-Bac 昆虫杆状病毒真核表达系统将ASFV 中CP204L 插入pFastBac1载体下游，将形成的重组质粒pFastBac-p30以转座子的形式插入到DH10Bac 中的杆状病毒穿梭质粒（Bacmid ）中，筛选出重组Bacmid-p30后，将Bacmid-p30转染Sf9细胞，并继续传代3次，获得重组杆状病毒，命名为rBac-p30。
分别通过间接免疫荧光（IFA ）和免疫印迹（Western blot ）鉴定了ASFV 阳性血清可特异性识别Sf9细胞中表达的p30。
以此真核表达p30蛋白包被ELISA 板，可区分ASFV 阴阳性血清。
以上结果表明，本研究初步建立了检测ASFV 血清抗体的间接ELISA 方法，为后续建立非洲猪瘟抗体检测方法和p30亚单位疫苗研究奠定基础。
关键词：非洲猪瘟病毒；p30蛋白；杆状病毒表达系统中图分类号：S852.65文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）04-0170-06Production and Immunological Detection of African Swine Fever Virus p30 byBaculovirus Expression SystemLIAO Xinxin 1,2, ZHONG Qiuping 2, SHI Xinjin 2, WEI Changqing 2, SUN Haiwei 2, LIU Yingnan 2,AO Qingying 2, XIE Zhenhua 2, WU Jing 1, CHEN Hongjun 2(1. Hunan Engineering Research Center of Livestock and Poultry Health Care, Colleges of V eterinary Medicine, Hunan Agricultural University,Changsha 410128, China; 2. Shanghai V eterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)收稿日期：2021-11-01基金项目：十三五国家重点研发专项资助项目（2018YFC08400400，2017YFD0502300）；自然科学基金联合基金项目重点支持项目-区域创新发展联合基金项目（U19A2039）作者简介：廖欣欣，女，硕士研究生，临床兽医学专业通信作者：邬静，E-mail：****************.cn；陈鸿军，E-mail：***************.cn Abstract: The p30 protein encoded by CP204L gene is one of the most immunogenic structural proteins of African swine fever virus (ASFV). In this study, the Bac-to-Bac insect baculovirus eukaryotic expression system was used to insert CP204L in ASFV into the downstream of pFastBac1 vector, and the resulting recombinant plasmid pFastBac-p30 was inserted into Baculovirus shuttle plasmid (Bacmid) in DH10Bac as a transposon. After screening the recombinant Bacmid-P30 was transfected into Sf9 cells, and the recombinant Baculovirus rBac-p30 was obtained expression of p30 protein. Indirect immunofl uorescence (IFA) and Western blot were used to identify p30 expression in Sf9 cells by ASFV positive serum specifi city. The recombinant p30 protein was used to coat ELISA plates to distinguish positive and negative serum samples of ASFV . The development of an indirect ELISA method laid the foundation for further establishment of an ASFV antibody detection method and p30 subunit vaccine research.Key words: African Swine fever virus; p30 protein; baculovirus expression system2023,31(4):170-175廖欣欣1,2，钟秋萍2，史馨瑾2，魏常青2，孙海伟2，刘英楠2，敖清莹2，谢振华2，邬 静1，陈鸿军2（1.湖南农业大学动物医学院 畜禽保健湖南省工程研究中心，长沙410128；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241· 171 ·廖欣欣等：非洲猪瘟病毒p30蛋白在杆状病毒表达系统中的表达与免疫检测第31卷第4期非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起的猪的一种热性、急性、高度接触性传染病[1]。
杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定)
昆虫细胞的培养
Atmosphere：air, 100%
Temperature：27.0—28.0 ℃
Primer-Forward（IFN-γ/IL-4/β-actin）
Primer-Reverse（IFN-γ/IL-4/β-actin） 2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix cDNA ROX H2O
1µ l（10 µ M）
1µ l（10 µ M） 12.5 µ l 1µ l 0.05 µ l 9.45 µ l 总25 µ L
Subculturing：
pipetting across the monolayer scraping cell scrapers hitting the flask against the palm of your hand
Preservation：
90% serum, 10% DMSO 严格程序降温，-80 ℃过夜后转移液氮保存。
每次包被板子条件一致， 4 ℃ 16-18h。 方阵滴度确定最佳抗原包被浓度。
2. 血清样品不溶血，防止干扰结果。
3. 设置空白孔（不加血清），统计结果时，所有实验组的 OD值先减掉背景值，再计算比值和滴度。
中和抗体
微量中和实验技术
中和实验 固定血清—稀释病毒法（用的很少）
获得重组杆状病毒——转染Sf9 cells
1. 小提好的Bacmid DNA，置4 ℃不超过1周 2. 转染试剂：Cellfectin® ⅡReagent 3. 转染后细胞的形态变化
杆状病毒表达系统简介-9页精选文档
体外基因表达系统包括原核细胞系统和真核细胞系统。
原核细胞系统主要是大肠杆菌细胞，它操作简便、周期短收益大及表达产物稳定，但是表达基因的相对分子质量有限，不宜过大，且不能对表达产物进行一些翻译后加工、修饰。
真核细胞系统包括 CHO等哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞等。
昆虫细胞表达系统(即杆状病毒表达系统)具有独特的生物学特性，日益受到人们的重视。
1、杆状病毒的生物学特性杆状病毒只来源于无脊椎动物，虽然已发现600多种杆状病毒，但进行分子生物学研究的不到20种。
杆状病毒的基因组为单一闭合环状双链DNA分子，大小为80～160 kb，其基因组可在昆虫细胞核复制和转录。
DNA复制后组装在杆状病毒的核衣内，后者具有较大的柔韧性，可容纳较大片段的外源DNA插入，因此是表达大片段DNA的理想载体。
其中，用作外源基因表达载体的杆状病毒，目前仅限于核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)。
该病毒颗粒在细胞内可由多角体蛋白包裹形成长度约1~5 m 的包含体病毒，呈多角体形状。
核型多角体病毒有两种形式：一种为包含体病毒(occluded virus，OV)，另一种则为细胞外芽生病毒(budded virus，BV)。
它们在病毒感染中扮演的角色不同，包含体病毒是昆虫间水平感染的病毒形式，昆虫往往是食入污染OV的食物后引起感染。
包含体病毒外层裹了一层蛋白晶体，即为29 000的多角体蛋白，它对病毒的水平感染起以下作用：①保护病毒颗粒在外界传播过程中免遭环境因素的破坏而失活。
②保证病毒颗粒在适当的位置释放，引起感染。
昆虫中肠上皮局部的强碱性环境(pH=10.5)，可使病毒颗粒释放蛋白酶溶解多角体。
BV病毒是个体内细胞间的感染形式，由细胞芽生出BV，进入血淋巴系统中感染其它部位的细胞或直接在临近细胞内感染。
近几十年，有关杆状病毒基因结构、功能和表达调节的研究进展迅速，其中研究最深入的是苜蓿银蚊夜蛾(autogra— phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclear polyhedro-sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
杆状病毒表达系统 杆状病毒滴度测定 全攻略
细胞因子的ELISA检测：
（1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为4×106 cells/ml的细 胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。 （2）臵37 ℃，5 % CO2温箱中培养72 h后，收取细胞上清。 （3）详细阅读说明书的实验步骤（不同牌子试剂盒稍有不 同），严格按要求操作。 标准曲线是判定实验的质量。
外周血单核细胞的分离 ：
细胞因子的定量PCR检测：
（1）于24孔板中加入适量的相关刺激原（based on in vitro dose-response studies），然后将浓度为4×106 cells/ml的细 胞悬液加至各孔内，每孔1 ml。 （2）臵37 ℃，5 % CO2温箱中培养20 h，提取细胞总RNA并 测定 RNA浓度和纯度。 （3）取0.5 µ g RNA进行逆转录（TOYOBO反转录试剂）。 （4）定量PCR：
供体质粒pFastBac：靶基因位于杆状病毒特异启动子下游 DH10Bac：杆状病毒穿梭载体Bacmid + 辅助质粒
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
Bac-to-Bac 表达系统的组成和工作原理
Expermiantal outline
昆虫细胞的培养
Insect Cell Lines：
杆状病毒滴度测定
两种病毒滴度测定方法的比较： 空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染 周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细 胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or IFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法 （PFU/ml）更短。
应用杆状病毒表达系统有效表达PEDV_纤突蛋白
山西农业科学2022，50（5）：714-719Journal of Shanxi Agricultural Sciences doi:10.3969/j.issn.1002-2481.2022.05.15doi应用杆状病毒表达系统有效表达PEDV纤突蛋白郝建伟1，薛春宜2，曹永长2（1.晋中学院生物科学与技术系，山西晋中030600；2.中山大学生命科学学院/有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广东广州510006）摘要：为了解决猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）变异毒株纤突蛋白（S蛋白）分子质量大、难以表达的问题，研究采用Signal4.0软件预测S蛋白信号肽，构建表达替换信号肽S蛋白的重组质粒，鉴定正确后重组质粒转化DH10Bac感受态细胞并进行蓝白斑筛选，挑取白斑进行菌落PCR检测，检测无误后提取Bacmid DNA转染Sf9细胞，制备重组杆状病毒。
采用杆状病毒表达系统表达目的蛋白，采用免疫印迹法（West⁃ern blot）和串联式飞行时间质谱（MALDI-TOF-TOF）技术鉴定表达蛋白，采用SDS-PAGE半定量方法测定蛋白含量；以Balb/c小鼠为材料进行免疫试验，应用中和试验、ELISPOT试验测定小鼠抗体滴度及细胞因子水平。
结果表明，S蛋白氨基端20个氨基酸为蛋白信号肽，重组质粒经双酶切鉴定构建成功，经菌体PCR检测验证表达骨架构建完成，转染Sf9细胞后获得重组病毒rB-PEDV-S；重组病毒表达蛋白经Western-blot和MALDI-TOF-TOF鉴定为目的蛋白，蛋白质量浓度可达0.0086μg/μL；替换原有信号肽可有效提高S蛋白产量，以0.86μg/只剂量免疫小鼠后，可刺激小鼠产生IL-4，但血清抗体水平与PBS组无明显差异。
替换信号肽有助于S蛋白表达，利用表达蛋白免疫小鼠可有效刺激IL-4产生。
关键词：猪流行性腹泻病毒（PEDV）；杆状病毒；免疫印迹法；串联式飞行时间质谱；蛋白表达；疫苗中图分类号：S858.28文献标识码：A文章编号：1002‒2481（2022）05‒0714‒06Effective Expression of Spike Protein of PEDV with Expression System of Bac-to-BacHAO Jianwei1，XUE Chunyi2，CAO Yongchang2（1.Department of Biological Science and Technology，Jinzhong University，Jinzhong030600，China；2.School of Life Sciences，State Key Laboratory of Biocontrol，Sun Yat-sen University，Guangzhou510006，China）Abstract：In order to solve the problem of large molecular weight and difficult expression of spike protein(S protein)of the mutant strain of porcine epidemic diarrhea virus(PEDV),in this study,the S protein signal peptide was predicted by Signal software(Version4.0),and the recombinant plasmid expressing the replacement of signal peptide S protein was constructed. Then the recombinant plasmid was transfected into DH10bac competent cells after identification,the white-blue plaque selection tests were conducted,and white spots were selected for further colony PCR detection.After the detection was confirmed,the Bacmid DNA was extracted and transfected into Sf9cells to prepare recombinant baculovirus.The target protein was expressed by baculovirus expression system and the expressed protein was identified by Western blot and MALDI-TOF-TOF methods The protein content was determined by SDS-PAGE semi quantitative method.Balb/c mice were used for immune experiment. The neutralization experiment and ELISPOT experiment were to determine the antibody titer and cytokine level.The results showed that the20amino acids in the amino terminal of S protein were protein signal peptides.The recombinant plasmid was successfully constructed through identification by double enzyme digestion.The bacteria PCR detection confirmed that the construction of the expression skeleton was completed,then,the recombinant virus rB-PEDV-S was obtained after transfected into Sf9cells.The protein expressed by the recombinant virus was identified as the target protein by verification of Western blot and MALDI-TOF-TOF,and the protein concentration was0.0086μg/μL,which showed that replacing the original signal peptide would effectively increase the yield of S protein.Immunization of mice by the S protein with the dosage of0.86μg/mice could stimulate mice to produce IL-4,but there was no significant differences between serum antibody level and that in PBS groups.The results proved that replacement of signal peptide contributed to the expression of S protein,and immunization of mice with the expressed protein could effectively stimulate production of IL-4.Key words：Porcine epidemic diarrhea（PEDV）;baculovirus;Western-blot;MALDI-TOF-TOF;expression of protein;收稿日期：2021-12-15基金项目：“十三五”重点研发计划项目（2016YFD0500101）作者简介：郝建伟（1983-），男，山西大同人，高级兽医师，博士，主要从事动物病毒学研究工作。
利用杆状病毒表达载体系统表达重组乙型肝炎病毒核心蛋白
Ｉ ｓｉ ｔ ｆ Ｈｅ ａ ｉ ｓａ ｅ ，Ｔｏ ｇ ｉＨｏ ｐ ｔ ｌ ｎｔｔ ｅｏ ｐ ｔｃＤｉｅ ｓｓ ｕ ｎ Ｊ ｓ ｉａ ，Ｔｏ ｇ ｉ ｅ ｉａ ｌｅ ｅ， ｎ Ｊ ｄ ｃ ｌＣｏｌｇ Ｍ Ｈ ｕ ｚ ｏ ｇ Ｕｎｖ ｒｉ ｆ ｃｅ ｃ ｎ ｃ ｎ ｌｇｙ，Ｗ ｕ ａ ３ ０ ０ ａ ｈ ｎ ｉ ｅｓｔ ｏ Ｓ ｉｎ ｅａ ｄ Ｔｅｈ ｏｏ ｙ ｈ ｎ４ ０ ３
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第 ３ 卷 第 ６ 第 ７ ７页 ６ 期 ８
华 中科 技大 学 学 报 （ 医学 版 ）
Ａｃ ａ Ｍ ｅ ｉ ｃ ｅ ｈ ｏ Ｈｕ ｚ ｏ ｇ ｔ ｄ Ｕｎ ｖ Ｓ ｉＴ ｃ ｎ ｌ ａｈ ｎ
Ｖ０ ． ６ Ｎｏ ６ Ｐ ７ ７ Ｉ３ ． ． ８
林 菊 生
华 中 科 技 大 学 同 济 医 学 院 附属 同济 医 院 肝病 研 究 所 ， 汉 武 。 国 科 学 院 武 汉 分 院 病 毒 研 究 所 ，武 汉 中 ４ ０ ７ ３０ １
摘 要 目 的 利 用 杆状 病 毒 表 达 载 体 系 统 制 备 重 组 乙型 肝 炎 病 毒 核 心 蛋 白 。 方 法 构 建 含 有 ＨＢ Ｃ基 因 的 杆 状 Ｖ 病 毒 转 移 载 体 ｐ ａｔａ ｕ ｌ Ｖ ｒ， 化 大 肠 埃 希 菌 Ｄ ０ ａ 进 行 转 座 ， 取 重 组 Ｂ ｃ ｄＤ Ｆ ｓＢ ｃＤ ａ— ＨＢ ｃ ｅ 转 ｏ Ｈ１ Ｂ ｃ 提 ａｍｉ ＮＡ 转 染 昆虫 细 胞 Ｓ９ ｆ，
获 得 含 有 ＨＢ Ｃ基 因 的 重 组 杆 状 病 毒 。用 重 组 杆 状 病 毒 感 染 Ｓ９细 胞 进 行 乙 型 肝 炎 病 毒 核 心 蛋 白 表 达 ， 后 通 过 Ｖ ｆ 然 Ｓ ＳＰ Ｅ 电 泳 和 Ｗｅｔｒ ｌｔ 析 表 达 情 况 。 结 果 成 功 构 建 了 含 ＨＢ Ｄ － ＡＧ ｓｅｎｂｏ 分 Ｖ Ｃ基 因 的 重 组 杆 状 病 毒 ， 且 在 昆 虫 细 胞 而 Ｓ９中表 达 了 乙 型 肝 炎 病 毒 核 心 蛋 白 。结 论 ｆ
杆状病毒表达系统00000001
昆虫杆状病毒系统高效表达重组蛋白●杆状病毒表达系统介绍●杆状病毒蛋白表达系统的优势●杆状病毒表达载体系统（BEVS）●杆状病毒表达宿主细胞●表达优化条件●翻译后修饰对蛋白表达的影响●高通量表达●总结杆状病毒介绍1.杆状病毒是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒。
2.杆状病毒在其生命周期中有两种不同的形态：一种为出芽型病毒（budded virus, BV），另一种为包含体病毒（Occlusion‐derived virus, OV）。
3. BV由糖蛋白GP64包裹的单一囊膜蛋白和膜蛋白构成。
4. OV由蛋白结晶基体包裹的多囊膜病毒粒子。
5. 研究最多的杆状病毒株为苜蓿银蚊夜蛾(autogra—phacalifornica)多核型多角体病毒(multiple nuclearpolyhedro‐sis virus，MNPV)，简称AcMNPV或AcNPV。
6. AcMNPV只侵染鳞翅类幼虫。
杆状病毒生命周期●早期（0‐6h PI）•核衣壳迁移到细胞核•病毒DNA释放•开始早期基因表达●晚期（6‐24h PI）•更多DNA复制•新产生的核衣壳离开细胞核，随后在离开细胞质•的过程中得到囊膜蛋白•产生新的出芽病毒●极晚期Courtesy: Dr. Linda Lua, The University of Queensland, Australia •出芽病毒减少•核衣壳在细胞核内得到囊膜蛋白形成MNPVs•MNPVs以多晶体形式出芽，主要是多角体蛋白，形成包含体病毒。
多角体启动子是杆状病毒表达载体系统的主要元件。
优点缺点大肠杆菌成本低、表达量高。
缺乏蛋白质翻译后加工机制；目的蛋白不可溶，蛋白生物活性低。
酵母表达量高，可以翻译后加工，易实现高密度发酵。
蛋白质量不理想。
哺乳动物细胞重组蛋白生物活性高。
成本高；表达水平低，技术和环境要求高。
昆虫细胞重组蛋白生物学活性高；表达水平高；能同时表达多个基因。
重组蛋白糖基化程度低。
利用昆虫-杆状病毒表达系统制备HPV16E6蛋白
利用 昆虫 一杆 状 病 毒 表 达 系统 制 备 ＨＰ １ Ｅ Ｖ ６ ６蛋 白
郑 瑾 ， 任 斐 ，余 翔 ，来 宝 长 ， 一 理 王 ．
（ 西安交通大学 生物医学信息工程教育部重点实验室／ 西安交通大学疫苗研发 中心 ，陕西 西安 ７ ０６ ） １０ １
摘要： 目的 利用昆虫 一 杆状病毒表达 系统高效表达 Ｈ Ｖ ６ ６蛋 白。方法 将 Ｈ Ｖ ６ ６基 因克 Ｐ １Ｅ Ｐ １Ｅ
根过 氧化 物 酶 标 记 的抗 鼠 ＩＧ为 Ｄ Ｋ ｇ Ａ Ｏ公 司 产 品 ， Ｈ Ｖ ６ ６特异 性 引 物及 Ｍ１／ Ｕ Ｐ １Ｅ ３ ｐ Ｃ引物 由西 安 沃尔 森生 物技术有 限公 司合成 ，Ｂ培 养基 ， 糖凝 胶 电 Ｌ 琼脂
末端 比较保守 ， １６ １５位氨基酸是 ｐ３ 白的 第 ０ —１ ５蛋 结合 部位 。Ｅ ６蛋 白是 一种 多功 能蛋 白 ， 还 能激 活 它
—
亚公司产品， 胎牛血清为杭州 四季青公司产品， ｒ ｅ Ｇａ ｃ
Ｓ培养 基 ， Ｅ Ｌ Ｅ ＴＮ Ｃ Ｌ Ｆ Ｃ ＩＥ及 Ｐ Ｄ Ｖ Ｆ膜 为 Ｉｖｒｇｎ公 ｎｉｏｅ ｔ
６ 氨基 酸所 形成 的保 守 区域 Ｊ ６蛋 白 Ｃ一 ２位 。Ｅ
司产品， Ｐ １Ｅ 单克隆抗体为 Ｍ ｒ 公司产品， Ｈ Ｖ６６ ｅｋ ｃ 辣 康 的 恶 性 肿 瘤 之
一
如下 。
，
已证实宫 颈癌 的发 生与 高危 型人乳 头瘤 病毒
（ ｕ ｎＰｐｌｍ ｖ ｕ ， Ｐ 感 染 关 系 密切 ， 别 Ｈ ｍａ ａｉｏ ａｉ ｓ Ｈ Ｖ） ｌ ｒ 特 是 Ｈ Ｖ１ Ｐ ６和 １ ８型感 染 与宫 颈癌 发生 的关 系 已十分
收稿 日期 ：０ ８０ － ２０ －３２ ６ 基金项 目： 教育部博 士点基金 资助项 目（ ０７ ６ ８ ９ ） ２ ０ ０ ９０ ７ 作者简介 ： 郑瑾 （９ ３ ） 女 ， １７ 一 ， 陕西 西安人 ， 西安交通大学讲师 ， 博士 ， 从事预 防性肿瘤疫 苗研究 。
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杆状病毒表达蛋白1 donor vector的构建1.1 外源基因的连接1.2 转化1.2.1 取10μL连接产物放入100μL感受态细胞中。
1.2.2 冰浴30min。
1.2.3 42℃，90s。
1.2.4 马上放入冰浴中，2min。
1.2.5 加入800μL LB培养基，37℃，150rpm摇1hr。
（LB 37℃预热）1.2.6 取200μL涂Amp+LB平板。
1.2.7 37℃，恒温培养箱，倒置培养12-16hr。
1.3 鉴定1.3.1 挑取10个单菌落于Amp+LB培养基中，37℃，225rpm，摇过夜。
1.3.2 小量提取质粒，操作步骤见附录2。
1.3.3 用SalI及XbaI双酶切鉴定连接结果。
1.3.4 取1ml菌液测序。
1.4 菌种的保存1.4.1挑取单菌落于1-2ml Amp+LB培养基中。
1.4.2 37℃，225rpm摇至平稳期。
1.4.3 0.85ml细菌培养物+0.15ml灭菌甘油，混匀。
1.4.4 -80℃保存。
2 转座2.1 转座反应2.1.1 将DH10Bac放入冰中备用。
2.1.2 轻轻混匀，取100μL DH10Bac细胞于遇冷的15ml圆底灭菌管中。
2.1.3 加入下列质粒DNA并轻混匀。
pFastBac TM construct 1ng(5μL)pFastBac TM control 1ngPUC19 control 50pg2.1.4于冰中放置30min。
2.1.5 42℃，热激45s，不要摇动。
2.1.6 马上放入冰浴中，2min。
2.1.7 加入900μL室温LB培养基。
2.1.8 37℃，225rpm摇4hr。
2.1.9准备一系列10倍稀释的细菌培养物（10-1、10-2、10-3），每板加入100μL的稀释菌液。
（平板为：50μg/ml kana、7μg/ml的genta、10μg/ml tet、100μg/ml Bluo-gal、40μg/ml IPTG）。
2.1.10 37℃，倒置培养48hr，挑取白斑进行分析。
2.2 鉴定2.2.1 挑取10个克隆于新鲜配制的LB平板中，画线，37℃倒置培养过夜。
2.2.2 挑取单菌落于LB液体培养基中，LB液体培养基含有50μg/ml kana、7μg/ml的genta、10μg/ml tet。
2.2.3 Bacmid DNA的提取，提取方法见附录3。
2.2.4 Bacmid DNA的PCR鉴定由于Bacmid DNA中含有M13的正向及反向引物序列，在转作子两端，所以可以用M13来扩增鞭毛蛋白基因。
M13 Forward :5-GTTTTCCCAGTCACGAC-3M13 Reverse :5-CAGGAAACAGCTATGAC-3反应的条件为：93℃ 3min，（94℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 5min）×25-35个循环，72℃ 7min。
2.2.5 取5-10μL PCR产物，0.7%琼脂糖电泳检测片段的大小，正确的片段大小为4000bp。
3 Bacmid DNA转染sf9昆虫细胞获得杆状病毒3.1 sf9昆虫细胞的培养（见附录4）。
3.2 Bacmid DNA 转染sf9昆虫细胞3.2.1 在6孔板中，每孔铺9×105个细胞，加入2ml含有抗生素（50u/ml的青霉素，50μg/ml 的链霉素）的sf-900II SFM培养基。
3.2.2 27℃至少培养1hr。
3.2.3 在灭菌管中混合Cellfectin及DNA。
将1μg DNA在100μL的sf-900II SFM培养基中稀释；将Cellfectin上下颠倒混匀5-10次，取出6μL，用100μL的sf-900II SFM培养基稀释；将稀释的DNA及Cellfectin混合，温和混匀，室温放置15-45min。
3.2.4 移去细胞中的培养基，加入2ml sf-900II SFM培养基洗涤，弃去洗涤液体。
3.2.5 在DNA：Cellfectin混合物中，加入800μL的sf-900II SFM培养基，温和混匀，加入细胞中。
3.2.6 27℃，培养5hr。
3.2.7 移去DNA：Cellfectin混合物，加入2ml含双抗的sf-900II SFM培养基。
3.2.8 27℃培养72hr，直到看到杆状病毒的标志。
如果转染效率高，72hr后就可看到细胞病变，如果转染效率不高，4-5天后才能看到。
3.2.9如果看到上述的细胞病变，将2ml的细胞收集于15ml的snap-cap管中。
3.2.10 500×g离心5min除去细胞及碎片。
3.2.11 将上清转移至新的灭菌15ml snap-cap管中，加入2%的胎牛血清，4℃避光保存，即为P1病毒。
4 杆状病毒的扩大培养4.1 在转染当天，准备sf9细胞，铺在6孔板中，每孔铺2×106个细胞，室温培养1hr。
4.2倒置显微镜观察细胞，确认是否已经贴壁。
4.3 加入适当量的P1病毒。
加入量计算方法为：转入病毒的量=MOI（pfu/cell）×细胞数量/病毒滴度（pfu/ml）P1病毒的滴度的范围在1×106---1×107 pfu/ml，MOI一般取0.05-0.1。
4.4 27℃，5%CO2培养箱中培养48hr。
4.5 48hr后，（视杆状病毒的构建情况，决定收集时间）收集病毒于15ml snap-cap管中。
4.6 500g离心5min。
4.7 将上清收集于新的15ml snap-cap管中，即为P2病毒。
4.8 4℃，避光保存。
5 杆状病毒滴度的测定5.1 4%低熔点琼脂糖培养基的配制5.1.1 微波炉加热或者70℃水浴,溶化4%低熔点琼脂。
当低熔点琼脂溶化后，将下列物品放入水浴中：空的100ml无菌瓶Sf-900(1.3×)培养基5.1.2 待低熔点琼脂溶化后，马上将低熔点琼脂、无菌瓶及Sf-900(1.3×)培养基放入超净台。
5.1.3 将30ml Sf-900(1.3×)培养基及10ml 4%低熔点琼脂放入100ml无菌瓶中，温和混匀。
5.1.4 准备好后，于40℃保存。
5.2 蚀斑试验5.2.1在转染当天，收获sf9细胞，并准备30ml细胞悬液，调整细胞密度为5×105/ml，于6孔板中每孔铺2ml细胞。
5.2.2 室温放置1hr，让细胞贴壁。
5.2.3 1hr后，用倒置显微镜观察细胞贴壁的状态，应该有50%细胞贴壁。
5.2.4 在sf-900II SFM中将病毒稀释8个浓度梯度（10-1—10-8）。
取0.5ml病毒放入4.5ml培养基中，稀释为10-1，然后从10-1浓度的病毒中取0.5ml病毒放入4.5ml培养基中，稀释为10-2，依此类推。
5.2.5 将6孔板中的培养基移去，马上加入1ml病毒稀释液。
5.2.6 培养1hr后，马上将放在40℃水浴的平板培养基放入超净台。
5.2.7 将病毒液取出，马上将2ml的平板培养基放入。
（动作要快，以免培养基凝固）。
5.2.8 室温放置10-20min。
5.2.9 将培养基放于27℃，5%CO2培养箱中培养。
5.2.10 在转染第四天时，用sf-900II SFM培养基配制1mg/ml的中性红溶液，抽滤除菌。
5.2.11 将1.5ml的1mg/ml的中性红溶液加入16.5ml的sf-900II SFM培养基中配制中性红溶液，混匀，然后放入40℃水浴中。
5.2.12 将4%的低熔点琼脂溶解，放入40℃水浴中，5min。
5.2.13取6ml 4%的低熔点琼脂加入中性红溶液中，40℃水浴保存。
5.2.14 迅速将配好的低熔点琼脂中性红溶液，按每孔1ml，加入6孔平板培养基中。
5.2.15 待凝固后，于27℃，5%CO2培养箱中继续培养3-6天。
5.2.16 在转染后第7-10天时，用细胞培养级别的水配制1mg/ml的中性红溶液2。
5.2.17 每孔加入0.5ml的1mg/ml的中性红溶液2，室温培养1-2hr。
5.2.18 小心用移液器取出多余的染液，计数。
5.3 病毒滴度的计算方法选择蚀斑数在3-20个的孔，病毒滴度的计算公式为：滴度（pfu/ml）=每孔蚀斑数×稀释倍数×1/ml接种量一般情况下，从杆状病毒中获得的病毒滴度为：P1：1×106----1×107P2：1×107----1×108如果得到的P1＜1×106或P2＜1×107，需要重新构建保种。
6 杆状病毒的纯化6.1用弯头吸管吸出一个清晰的蚀斑，放入1.5ml的灭菌管中，加入500μL sf-900II SFM完全培养基，漩涡混匀。
6.2 加入100μL的agarose plug solution，混匀。
6.3 27℃，5%CO2培养箱中培养72hr。
6.4 用15ml snap-cap管收集培养基，约2ml。
6.5 500×g离心5min。
6.6 将上清转移到一新的15ml snap-cap管中，4℃避光保存。
7蛋白的表达7.1 在24孔板中接6×105 cells/well，贴壁至少30min。
7.2 30min后，移去培养基，马上用新鲜的生长培养基清洗，加入300μL的新鲜培养基。
7.3 加入不同MOI的病毒（1，2，5，10，20）。
7.4 27℃，5%CO2培养箱中培养。
在不同的时间收集细胞（24hr,48hr,72hr,96hr）。
7.5 预冷的PBS(pH7.4)缓冲液洗涤细胞数次。
除尽残留液体，再加入500μL预冷的细胞裂解液(含有1×Protease inhibitor cocktail)，用橡皮刮刮下细胞收集至eppendorf管内，置冰浴裂解45min，每50μL细胞裂解物分装至一个eppendorf管中，置于-20℃或者-80℃贮存备用或直接用于表达情况分析。
重组病毒中和抗体滴定（改良法）分离被检血清，56℃灭活30 min 后，在96 孔细胞培养板中将血清作连续倍比稀释，从1∶2 至1∶256，每个稀释度作4 个重复，每孔50.0μL；用DMEM 将测好TCID50 的PRRSV 稀释为200 TCID50，并加入终浓度为20%的新鲜猪血清，然后将其加入所有加有被检血清的培养孔中，每孔50.0μL，37℃ 5 % CO2 培养箱中作用1 h，再于每孔中滴加2~5×105个/mL 的Marc-145 细胞悬液100.0 μL，轻轻摇匀后，放回培养箱中继续培养4~6 d，观察细胞病变情况，按Reed-Muench 两氏法计算被检血清中抗PRRSV 的特异性中和抗体的滴度。