第五章双向凝胶电泳(2D-PAGE)
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蛋白质样品的制备 双向电泳 凝胶中的蛋白 混合肽 肽指纹图 肽序列质谱数据 数据搜索 新的或已知蛋白 蛋白转录后修饰的鉴定 蛋白质质量 N端测序 图像分析 溶液中的蛋白
转印ห้องสมุดไป่ตู้膜上的蛋白
2. 双向电泳技术的发展及原理
双向凝胶电泳的发展 双向凝胶电泳的基本原理
双向凝胶电泳的发展
双向凝胶电泳的思路最早是由Smithies 和Poulik提出 (Smithies O, Poulik MD. Two-dimensional electrophoresis of serum proteins. Nature, 1956, 177: 1033)，蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移率 (free-solution mobility)， 在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。 随后，Raymond发明了聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Raymond S, Weintraub L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science, 1959, 30:711)，双向电泳的支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶 (Margolis J, Kenrick KG. Two-dimensional resolution of plasma proteins by combination of polyacrylamide disc and gradient gel electrophoresis. Nature, 1969, 221: 1056-1057)， 这即是双向凝胶电泳 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D PAGE)。 同年，2D PAGE在原理上又有了新的发展，以第一向为蛋白质等电聚焦 的双向凝胶电泳技术建立起来，即IEF-PAGE (Dale G, Latner AL. Isoelectric focusing of serum proteins in acrylamide gels followed by electrophoresis. Clin Chim Acta, 1969, 24: 61-68；Macko V, Stegemann H. Mapping of potato proteins by combined elctrofocusing and electrophoresis identification of varieties. Hoppe-seyler’s Z Physiol. Chem, 1969, 350: 917-919)。
第五章 双向凝胶电泳 (2D-PAGE)
蛋白质组分析的技术路线 双向凝胶电泳技术的发展及原理 仪器简介
样品制备
技术流程
1. 蛋白质组分析的技术路线
要求
流程 技术路线
蛋白质组分析的首要要求
将来自于全细胞、组织或生物体中所包 含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测
和分析 。
生物学问题 的提出
双向凝胶电泳的基本原理
先将蛋白质根据其等电点在 pH 梯度胶内进行等电聚焦，然后按照它们的 相对分子质量大小进行 SDS-PAGE 第二次电泳分离。 第一向进行等电聚焦 (isoelectric focusing, IEF)，由于蛋白质具有两性解离 和等电点特性，将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，会向与其所 带电荷相反的电极方向移动。移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并 随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白迁移至其等电 点 pH 位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。当蛋白扩散到低于其等 电点 pH 区域时，带正电荷，在电场的影响下重新向阴极移动。同样，如果蛋 白质扩散到高于其等电点的 pH 区域时，则带负电，在电场的作用下会向阳极 移动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的 pH 梯度介质 区域内。目前常使用预制胶条 (IPG, immobilized pH gradient) 用于蛋白质的等 电聚焦分离，将聚焦好的 IPG 胶条在含有 SDS 的缓冲液中平衡。 第二向是将在 IPG 胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到 SDS-PAGE凝 胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量 (MW) 大小与第一向相垂直的分离。沿 垂直的方向进行 SDS-PAGE 电泳，按分子量大小进行分离。样品经过电荷和 质量两次分离后，得到等电点和分子量的信息。
实验模型 的设计 感兴趣 蛋白点 的切取
实验组和对照组 样品的制备
蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离 图像扫描和初步分析
胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图、微测序分析 质谱结果的生物信息学分析和比对 新蛋白质的发现
蛋白信息的 初步获得
其它实验 的进一步 验证
蛋 白 质 组 分 析 流 程
蛋白质组研究的基本技术路线
20世纪70年代初，在第二向电泳中又使用了十二烷基磺酸钠 (SDS) (Barrett T, Gould HJ. Tissue and species specificity of non-histone chromatin proteins. Biochim Biophys Acta, 1973, 294: 165-170；Martini OHW, Gould H. J. Enumeration of rabbit reticulocyte ribosomal proteins. J Mol Biol, 1971, 62: 403-405；Stegemann H. proteinfraktionierungen in polyacrylamid und die anwendung auf die genetische analyse bei pflanzen. Angew Chem, 1970, 82: 640)，使第二向电泳基本上根据蛋白质的相对分子质量来分离，从而奠定了 现代双向凝胶电泳的基础，即IEF-SDS PAGE。 1975年，O’Farrell、Klose和Scheele分别对双向凝胶电泳做进一步的优 化，建立了高分辨率的双向凝胶电泳 (O’Farrell PH. High resolution twodimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem, 1975, 250:4007-4021； Klose J. protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik, 1975, 26:231-243；Scheele GA. Two-dimensional gel analysis of soluble proteins. J Biol Chem, 1975, 250:5375-5385)。 此项技术是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离并展示的分离技术，一 般能分离1000 – 3000个蛋白质点，最好的胶能分离得到11000个左右的蛋白质 点。
转印ห้องสมุดไป่ตู้膜上的蛋白
2. 双向电泳技术的发展及原理
双向凝胶电泳的发展 双向凝胶电泳的基本原理
双向凝胶电泳的发展
双向凝胶电泳的思路最早是由Smithies 和Poulik提出 (Smithies O, Poulik MD. Two-dimensional electrophoresis of serum proteins. Nature, 1956, 177: 1033)，蛋白质第一向电泳是根据其自由溶液迁移率 (free-solution mobility)， 在滤纸条上进行；第二向电泳方向与第一向垂直，在淀粉胶上进行。 随后，Raymond发明了聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Raymond S, Weintraub L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science, 1959, 30:711)，双向电泳的支持介质逐渐转向聚丙烯酰胺凝胶 (Margolis J, Kenrick KG. Two-dimensional resolution of plasma proteins by combination of polyacrylamide disc and gradient gel electrophoresis. Nature, 1969, 221: 1056-1057)， 这即是双向凝胶电泳 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2D PAGE)。 同年，2D PAGE在原理上又有了新的发展，以第一向为蛋白质等电聚焦 的双向凝胶电泳技术建立起来，即IEF-PAGE (Dale G, Latner AL. Isoelectric focusing of serum proteins in acrylamide gels followed by electrophoresis. Clin Chim Acta, 1969, 24: 61-68；Macko V, Stegemann H. Mapping of potato proteins by combined elctrofocusing and electrophoresis identification of varieties. Hoppe-seyler’s Z Physiol. Chem, 1969, 350: 917-919)。
第五章 双向凝胶电泳 (2D-PAGE)
蛋白质组分析的技术路线 双向凝胶电泳技术的发展及原理 仪器简介
样品制备
技术流程
1. 蛋白质组分析的技术路线
要求
流程 技术路线
蛋白质组分析的首要要求
将来自于全细胞、组织或生物体中所包 含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测
和分析 。
生物学问题 的提出
双向凝胶电泳的基本原理
先将蛋白质根据其等电点在 pH 梯度胶内进行等电聚焦，然后按照它们的 相对分子质量大小进行 SDS-PAGE 第二次电泳分离。 第一向进行等电聚焦 (isoelectric focusing, IEF)，由于蛋白质具有两性解离 和等电点特性，将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，会向与其所 带电荷相反的电极方向移动。移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并 随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白迁移至其等电 点 pH 位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。当蛋白扩散到低于其等 电点 pH 区域时，带正电荷，在电场的影响下重新向阴极移动。同样，如果蛋 白质扩散到高于其等电点的 pH 区域时，则带负电，在电场的作用下会向阳极 移动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的 pH 梯度介质 区域内。目前常使用预制胶条 (IPG, immobilized pH gradient) 用于蛋白质的等 电聚焦分离，将聚焦好的 IPG 胶条在含有 SDS 的缓冲液中平衡。 第二向是将在 IPG 胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到 SDS-PAGE凝 胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量 (MW) 大小与第一向相垂直的分离。沿 垂直的方向进行 SDS-PAGE 电泳，按分子量大小进行分离。样品经过电荷和 质量两次分离后，得到等电点和分子量的信息。
实验模型 的设计 感兴趣 蛋白点 的切取
实验组和对照组 样品的制备
蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离 图像扫描和初步分析
胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图、微测序分析 质谱结果的生物信息学分析和比对 新蛋白质的发现
蛋白信息的 初步获得
其它实验 的进一步 验证
蛋 白 质 组 分 析 流 程
蛋白质组研究的基本技术路线
20世纪70年代初，在第二向电泳中又使用了十二烷基磺酸钠 (SDS) (Barrett T, Gould HJ. Tissue and species specificity of non-histone chromatin proteins. Biochim Biophys Acta, 1973, 294: 165-170；Martini OHW, Gould H. J. Enumeration of rabbit reticulocyte ribosomal proteins. J Mol Biol, 1971, 62: 403-405；Stegemann H. proteinfraktionierungen in polyacrylamid und die anwendung auf die genetische analyse bei pflanzen. Angew Chem, 1970, 82: 640)，使第二向电泳基本上根据蛋白质的相对分子质量来分离，从而奠定了 现代双向凝胶电泳的基础，即IEF-SDS PAGE。 1975年，O’Farrell、Klose和Scheele分别对双向凝胶电泳做进一步的优 化，建立了高分辨率的双向凝胶电泳 (O’Farrell PH. High resolution twodimensional electrophoresis of proteins. J Biol Chem, 1975, 250:4007-4021； Klose J. protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik, 1975, 26:231-243；Scheele GA. Two-dimensional gel analysis of soluble proteins. J Biol Chem, 1975, 250:5375-5385)。 此项技术是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离并展示的分离技术，一 般能分离1000 – 3000个蛋白质点，最好的胶能分离得到11000个左右的蛋白质 点。