淋巴细胞增殖功能的测定

淋巴细胞增殖功能的测定

淋巴细胞增殖和分化是机体免疫应答过程的一个重要阶段。因此，检测淋巴细胞增殖水平是细胞免疫研究和临床免疫功能检测的一种常用方法。

(一)原理

T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA),抗CD２、抗CD３McAb 作为多克隆刺激剂可选择性地刺激T细胞增殖；而抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体(SAC)、脂多糖(LPS，对小鼠有作用)则刺激B细胞发生增殖；美洲商陆(PWM)、肿瘤刺激剂PMA对T、B细胞的增殖均有刺激作用。最近发现,integrin家族中VLA组中某些受体与相应配体结合后也能活化T细胞。目前临床上最常选用PHA刺激PBMC, 根据形态学或氚标记胸腺嘧啶核苷(３H-TdR)掺入率测定T细胞的增殖水平。

(二)操作步骤

无菌从肝素抗凝血中分离外周血单个核细胞(PBMC)

洗涤后用10％FCS RPMI1640调整细胞数为1～2×10６／ml

↓

加入96孔培养板中，1～2×10５细胞／100μl／孔，每组设3孔。

加入最适剂量PHA，100μl／孔，同时设不加PHA阴性对照。如观察细

胞因子(如IL-2)或其它刺激物(PMA)对增殖功能的调节作用，则根据

加入因子的浓度而确定加入量，一般每孔最终体积为200μl

↓37℃、5％CO２孵育，66h

每孔加入0.5～1μci３H-TdR(50μl)

↓继续培养6～12h

用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集仪收集样品

于"9999"型玻璃纤维滤纸上

↓

烤干后β液闪仪计数

计算

1.增殖水平直接用CPM值表示。

2.也可用刺激指数(SI)表示:

PHA(或实验组)cpm-机器本底

SI＝───────────────

阴性对照组cpm-机器本底

(三)试剂和器材

1.PBMC或其它含淋巴细胞的悬液。

2.PHA或其它有丝分裂原、刺激物

3.闪烁液PPO(2，5-二苯茎恶唑)3～5g

POPOP[1，4双(5苯基恶唑)苯] 0.3～0.5g溶于1000ml二甲苯中。也可将POPOP加入少量二甲苯在37℃水浴上溶解后，再加PPO，然后补足二甲苯。

4.３H-TdR，一般临用时稀释

5.10％FCS RPMI1640, CO２孵箱

6. 细胞收集仪，β液闪仪

(四)注意事项

1.注意无菌操作。

2.PHA、ConA、PWM、LPS等在正式实验前均需摸索最适剂量或亚适剂量。犛I于厂家和批号不同丝裂原作用常有很大差别，如Wellcome公司PHA终浓度最适剂量为1～3μg ／ml，而广州医工所PHA约为20～100μg／ml。

3.根据实验需要,对不同种(人、小鼠、大鼠、兔、狗等)不同来源淋巴细胞(胸腺、脾脏、淋巴结、扁桃腺、外周血等)均应进行最适细胞浓度、犈`养时间和刺激物浓度的摸索。

MTT,CCK-8都只是检测细胞代谢活性的，但是细胞代谢活性的增强并不表示细胞一定增殖了，还要确定是否有新的DNA合成。我接触到一些药物对代谢活性和DNA合成的影响是不同步的。老外的质疑多半也是从这个方向去考虑的。