肌肉特殊染色
谈特殊染色及光镜观察与免疫组化在软组织肿瘤诊断中的应用
谈特殊染色及光镜观察与免疫组化在软组织肿瘤诊断中的应用目的探讨特殊染色及光镜观察与免疫组化在软组织肿瘤诊断中的应用。
方法选择特殊染色法、免疫组化染色法及电镜观察的方法。
结果特殊染色、免疫组化染色及电镜观察的辅助诊断，满足了临床病理诊断的要求。
结论特殊染色有助于诊断与鉴别诊断，在软组织肿瘤的诊断上具有重要作用，光镜观察HE切片是病理诊断的基础，是合理选择免疫组化染色的依据。
免疫组化染色对软组织肿瘤常用抗体进行标记，其诊断价值是很明显的。
标签：软组织肿瘤诊断；特殊染色＼光镜观察＼免疫组化；应用价值通常85%～90%的软组织肉瘤，通过光镜观察可做出正确诊断。
约l0%～15%的肉瘤，尤其是圆形、卵圆形或梭形类的肿瘤，因分化程度低，单纯用HE染色切片很难判断其组织来源，常需借助特殊染色、免疫组化染色及电镜观察辅助诊断，以满足病理诊断要求[1]。
1.特殊染色特殊染色有助于诊断与鉴别诊断[1]。
在软组织肿瘤的诊断上具有重要作用，常用的特染包括：①网状纤维染色：可区分血管内皮肉瘤和血管外皮瘤，血管内皮肉瘤可见网织纤维包绕血管构成，瘤细胞位于网织纤维包绕的管腔内，而血管外皮瘤则见网织纤维丰富，分布于血管周围瘤细胞之间，并呈辐射状分布。
此外，对鉴别腺泡状肉瘤、化感瘤及转移癌亦有帮助，网织纤维均包绕于瘤细胞巢周围；②Masson三色染色：可区分肌原纤维还是胶原纤维，肌原纤维显红色，胶原纤维显蓝色；③PTAH染色：瘤细胞内可查见蓝黑色横纹，有助于诊断横纹肌肉瘤；④PAS染色：腺泡状软组织肉瘤，瘤细胞胞浆内可见PAS阳性晶体状物质，除显示中性粘多糖外，亦可显示糖原（经淀粉酶消化后呈阴性），对含有糖原的软组织肿瘤，如横纹肌肉瘤、Ewing瘤、透明细胞肉瘤、平滑肌肉瘤及脊索样肉瘤等的诊断有一定辅助作用；⑤脂肪染色：对脂肪肉瘤的诊断有重要意义，但必须有相当数量、弥漫，小颗粒，绝不能仅见少数几个瘤细胞阳性就诊断脂肪肉瘤，在一些淋巴瘤、各种癌细胞及一些间叶组织肿瘤，如恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤等均可见脂肪染色阳性；⑥其它特殊染色：如黑色素，嗜银染色分别对转移性梭形细胞黑色素瘤，恶性间皮瘤及神经内分泌细胞肿瘤的诊断有重要意义。
病理技术卫生考试常考固定液与特殊染色总结
单纯固定液甲醛：能固定类脂和脂类，但必须冷冻切。
也可固定高尔基体、线粒。
是糖的保护剂。
体除去甲醛色素的方法：Verocay法，乙醇配氨水；Schride法。
重铬酸钾Zenker，Helly，Maximov，Regaud。
苦味酸：易燃易爆，强酸，糖类；可以软化皮肤，易于切片。
不宜用火棉胶包埋。
70%乙醇中加浓氨水去除固定产生的黄色。
三氯醋酸：SUSa液的主要成分，使蛋白沉淀，良好的脱钙剂。
升汞：针状结晶，组织收缩明显。
不能固定类脂和糖类。
可固定蛋白，固定后需用碘液脱汞乙醇：固定兼有脱水作用，糖原的固定，纤维蛋白和弹性纤维固定。
浓度80-95%。
醋酸：固定染色体，清楚的显示细胞核，但组织膨胀明显，尤其对于胶原纤维和纤维蛋白。
铬酸避光保存。
不能固定脂肪。
固定后流水冲洗大于24h。
饿酸延长固定时间，脆性增加，对染色不力。
1%高锰酸钾脱碘，固定后流水冲洗12-24h。
丙酮：酶组织化学。
丙酮对组织块的收缩作用强于乙醇，对糖原无固定作用。
异丙醇：是乙醇良好的替代品，组织收缩小，硬化作用较弱；不能再用于火棉胶的包埋。
叔丁醇：脱水后可不经透明，直接浸蜡。
电镜标本中常用作中间脱水剂。
环氧己烷：不引起组织收缩和硬化，常用于植物标本制作，价格贵。
四氢呋喃：既是脱水剂，又可以作为封片溶媒。
环己酮：代替乙醇作脱水剂和随后的浸蜡和包埋。
混合固定液B-5固定液：固定淋巴组织，配方无水醋酸钠-升汞-甲醛，染色前脱汞处理；Muller液：媒染和硬化神经组织，需常更换液体，固定作用缓慢。
Bouin液：结缔组织比较差。
不适宜长期固定（12-24h）。
固定后组织被染成黄色需用70%-80%乙醇洗涤。
Orth：胚胎，神经，脂肪均可。
需在暗处固定24h。
Carnoy液：胞质和胞核，染色体，糖原保存，尼氏体；不能保存脂类。
Helly固定液：含有氧化剂和还原剂，临时配制，久置失效。
PFG：肽类抗原固定，用于免疫电镜研究。
PLP和PLPD（含有过碘酸钠）Rossman：Zenker固定液：形态学研究常用固定液。
特殊染色程序试题及答案
特殊染色程序试题及答案一、选择题1. 下列哪项不是特殊染色的目的？A. 区分不同类型的细胞B. 识别细胞内的特定结构C. 增加细胞的美观性D. 帮助诊断某些疾病答案：C2. 特殊染色中常用的染色剂之一是：A. 苏木精B. 伊红C. 刚果红D. 甲基绿答案：C3. 免疫组化染色是一种特殊的染色技术，主要用于：A. 细胞计数B. 细胞形态学观察C. 检测细胞表面抗原D. 检测细胞内蛋白质表达答案：D二、填空题4. 特殊染色技术中的PAS染色主要用于检测_________。
答案：多糖和粘多糖5. 在病理学中，_________染色常用于识别真菌感染。
答案：Gomori甲酚紫6. 阿利新蓝染色可以用于检测_________。
答案：肌肉组织三、简答题7. 描述银染技术的基本原理及其在病理学中的应用。
答：银染技术是一种使用银颗粒对组织或细胞进行染色的方法。
其基本原理是利用银离子与组织中的特定蛋白质或多糖结合，然后通过还原剂将银离子还原为黑色的金属银颗粒，从而在光镜下形成可见的染色。
在病理学中，银染常用于显示神经纤维和网状纤维，有助于研究组织的神经分布和结构。
8. 解释为什么特殊染色在肿瘤学中非常重要。
答：特殊染色在肿瘤学中非常重要，因为它们可以揭示肿瘤细胞的独特特征，帮助病理学家进行更准确的诊断。
例如，免疫组化染色可以检测肿瘤细胞表面的特定抗原，从而确定肿瘤的类型和分级。
此外，一些特殊染色能够突出显示肿瘤细胞的代谢产物或特定酶的活性，这些信息对于了解肿瘤的生物学行为和制定治疗方案至关重要。
四、论述题9. 讨论特殊染色在临床诊断中的作用及其局限性。
答：特殊染色在临床诊断中扮演着重要角色，它们能够提供传统染色技术无法提供的信息。
例如，通过特殊染色可以识别特定的细胞类型、细胞内结构或生物分子，这对于许多疾病的诊断至关重要。
然而，特殊染色也有其局限性，包括成本较高、操作复杂、需要专业的技术人员进行解读等。
此外，某些特殊染色可能存在一定的假阳性或假阴性结果，因此需要结合临床症状和其他检查结果综合判断。
病理切片的特殊染色方法
病理切片的特殊染色方法1、Van Gieson苦味酸与酸性品红法【染色方法】(1)中性甲醛固定组织,石蜡切片;(2)组织切片脱蜡至水;(3)用Van Gieson液染1～5分钟;(4)倾去染液,直接用95％乙醇分化与脱水;(5)无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封固。
【结果】胶原纤维呈红色,肌纤维、胞质及红细胞呈黄色。
2、Masson氏结缔组织三合染色法【染色方法】(1)石蜡切片厚6μm,脱蜡至水;(2)0、2％冰醋酸水溶液浸泡片刻;(3)Masson氏染色液中5分钟或更长时间;(4)0、2％冰醋酸水溶液浸泡片刻;(5)5％磷钨酸水溶液2～3分钟,再入0、2％冰醋酸水溶液浸洗(6)投入淡绿、冰醋酸水溶液浸染5分钟或更长时间;(7)再入0、2％冰醋酸水溶液浸洗片刻;(8)脱水、透明与封固。
【结果】胞浆与神经胶质纤维染红色,胶原纤维染绿色。
【染色方法】(1)石蜡切片、脱蜡至水;(2)0、25％高锰酸钾液3分钟;(3)蒸馏水洗2次;(4)1％草酸漂白即可;(5)蒸馏水洗2次;(6)2、5％铁明矾水溶液媒染5～10分钟,蒸馏水洗多次;(7)二氨氢氧化银浸染1分钟,蒸馏水洗3次;(8)10％甲醛液还原2分钟,蒸馏水洗3次;(9)0、2％氯化金液调色1～2分钟,蒸馏水洗3次;(10)5％硫代硫酸钠固定5分钟;(11)蒸馏水洗,需要时复染;(12)水洗、脱水、透明与封固。
【结果】网状维呈黑色,其她组织呈复染得颜色。
显示弹性、胶原纤维得双重组合染色法【染色方法】(1)中性甲醛液固定组织,石蜡切片,常规脱蜡至水;(2)切片入70％乙醇中洗2分钟;(3)将切片浸入盛有维多利亚蓝液中染0、5～2小时;(4)直接入95％乙醇中分色数秒钟;(5)浸入蒸馏水洗2分钟;(6)用丽春红S液滴染切片5分钟;(7)直接用无水乙醇冲洗多余染色液2次;(8)将切片在空气中或冷风干燥;(9)二甲苯透明,中性树胶封固。
【结果】弹性纤维呈蓝绿色,胶原纤维呈红色,背景呈淡黄色。
(上课用)特殊染色和组织化学分析
所谓特殊染色的相对性，就是一种方 法可以显示多种目的物，一种目的物 可以用多种方法显示，其中有些方法 可能呈阳性，而有些方法则呈阴性， 这就需要我们拿捏多种方法，因为有 时只有依靠多种方法才能确定所要确 认的目标。
2.特殊染色的分类
特殊染色方法按照所染目的物进行
分类，有结缔组织、肌肉组织、神经组织、 脂类物质、糖类、色素、病理的内源性沉 着物、病原微生物、内分泌物质、骨、血 液及造血组织、核酸、酶类等。
特殊染色及组织化学
赣南医学院病理学教研室
第一节 特殊染色及组织化学的基本知识
一、染色方法
1863年由waldeyer率先倡导用苏木素染 液染细胞核，后来Mallory、Mayer等也阐述过 苏木素的应用。近年来特殊染色和组织化学方 法也屡有创新。Shikata(1973)，Tanka等 (1981年)分别介绍了用地依红和维多利亚蓝混 合液显示乙型肝炎表面抗原的方法；1987年 Crocker J等推出了核仁组成区嗜银蛋白染色 的技术方法以及1991年进行的乳腺肿瘤核仁组 成区的研究方法等。
四、染色的分类
(一)普通染色
最广泛应用于常规制片的苏木素和伊
红染色，又称为常规染色。
(二)特殊染色
1．定义 专门用于显示某些特定目的物的染色 方法称为“特殊染色”，它又可以理解为 “选择性染色”。 特殊染色对目的物的选择性是相对的。有 些方法具有相对的特异性，如油红O等脂质 染色，显阳性者可以肯定为脂质；有些则显 示的是一类物质，如PAS呈阳性反应者有糖 原、粘蛋白、网织纤维、软骨、阿米巴原虫、 霉菌等许多物质和组织结构，并不能确定是 哪一种具体成分。
五、组织化学的基本概念
组织化学是在形态学基础上研究细胞 或组织中物质的化学组成、定位、定量及 代谢状态的学科，是组织学与生物学及生 物化学等的边缘科学，其目的是联系形态， 化学成分和功能来了解组织或细胞的代谢 变化。 目前有许多组织化学方法已划入特殊 染色，划分特殊染色和组织化学无绝对界 限。
病理技术专业知识
（一）单纯固定液甲醛：1．浓度：40%，气体2．渗透力强，固定均匀，组织收缩小，3．不能使白蛋白和核蛋白沉淀4．保存脂类，必须用冷冻切片。
是糖的保护剂5．可固定高尔基体，线粒体重铬酸钾1.浓度：1%-3%水溶液，有毒，橘红色结晶2.穿透速度快，几乎不收缩，经乙醇脱水后明显收缩，3.未酸化的重铬酸钾不能使蛋白质沉淀，但可使蛋白质变为脂溶剂。
酸化后可使蛋白质沉淀，此时染色体可被保存，但线粒体破坏。
4.固定高尔基体和线粒体有良好效果。
5.酸性染料着色好，碱性染料着色差6.固定的组织需经流水冲洗12-24h，或用亚硫酸盐洗涤。
苦味酸1.黄色结晶体，是一种强酸，易燃易爆，配成饱和溶液储藏2.穿透慢，组织收缩明显，无明显硬化。
3.能沉淀一切蛋白质4．对脂肪和类脂无固定作用。
5. 可软化皮肤和火棉胶，不宜用火棉胶包埋6. 固定时间不宜超过24h，7. 固定的组织应尽快放入70%乙醇，滴加饱和碳酸锂或浓氨水，有助于除去苦味酸固定产生的黄色。
升汞1. 浓度为5%-7%的水溶液，针状结晶2．穿透力低，只宜固定薄片组织，单独应用组织收缩明显3, 对蛋白质有固定作用，4. 对类脂和糖类无固定作用5. 临用时加冰醋酸醋酸1. 刺激性气味的无色液体，低于15℃为冰醋酸5%的醋酸PH为2-8，可抑制细菌和酶的活性，可防止自溶。
2. 穿透力强3 不能沉淀白蛋白，球蛋白，但能沉淀核蛋白4 不能固定脂肪和内酯，不能保存糖5 .固定线粒体和高尔基复合体不能用高浓度的醋酸，可较好的保存染色体6, 缺点是组织膨胀明显，尤其对于胶原纤维和纤维蛋白铬酸1.为三氧化铬的水溶液，浓度0.5%-1%，强氧化剂，不能与乙醇，甲醛等混合2 穿透力弱，一般组织需固定12-24h，固定的组织有收缩，3 能沉淀蛋白质，核蛋白固定良好。
4 对脂肪无固定作用5 固定线粒体和高尔基复合体6. 宜避光保存，以防蛋白质溶解。
7. 必须彻底流水冲洗（≥24h）。
锇酸（四氧化锇）1.淡黄色结晶，剧毒，浓度1%-2%，强氧化剂，不能与乙醇，甲醛等混合2. 渗透力极弱，易使组织变硬，延长固定时间，组织的脆性增加，对染色不利。
生物显微技术-第二章-其他常用制片方法和特殊染色方法
❖ 注意事项
❖ 玻片的清洗：新玻片常有游离碱质，因此应用清洗液 或10%盐酸浸泡24h，然后再彻底清洗。用过的玻片 可放入适量肥皂水或合成洗涤剂的清水中煮沸20min， 再用热水将肥皂和血膜洗去，用自来水反复冲洗,必 要时再置95%乙醇中浸泡1h，然后擦干或烤干备用。
❖ 缺点： ❖ 1、不容易做连续切片。 ❖ 2、切取的组织不能过大，组织过大不容易冻
结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。 ❖ 3、不容易制作较薄的切片。 ❖ 4、组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而
影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并 且组织结构也不如石蜡切片清晰。
（四）主要应用
❖ 1、用于有些水解酶的定位的组织化学方法以 及免疫组织化学方法等。
主要部件： ①恒冷箱 ②样 品冷却系统 ③切片机 ④一 次性不锈钢刀片
LEICA CM1900型恒冷箱切片 机具有一个完全封闭式的恒 冷箱，工作时可24小时制冷， 使箱内温度常年保持在20℃的工作状态，并具有自 动除霜的功能。此外，它还 具有一个独立的样品冷却系 统，使生物样品被迅速冷冻， 达到一定硬度后，即可切片。 样品的前进与后退，由恒冷 箱外的电动按钮控制。
（一）冷冻切片的种类
半导体冰冻切片机
低温恒冷箱冰冻切片法
二氧化碳冰冻切片法
甲醇循环制冷冰冻切片法等
这些方法，随着时代的变迁，科技的发展， 许多年前被认为是非常重要的技术，现在也 逐步被淘汰了。当然有些技术，如低温恒冷 箱冰冻切片法，正在受到青睐。
❖ （二）冷冻切片的制作方法
低温恒冷箱冷冻切片制作法 冷冻箱内左边的冷冻台，温度可达-60℃左 右，冷冻箱的中间为一台切片机，工作间 的温度在0-30℃间可任意调节，并在箱面 上的荧屏显示出来。
肌肉组织观察实验
• 肌肉组织是由特殊的肌细胞（muscle cell） 构成。肌细胞细而长，呈纤维状，故亦称肌 纤维（muscle fiber）。
• 根据肌纤维的形态和功能，可将肌肉组织分 为三类：
• 平滑肌（smooth muscle） • 横纹肌（skeletal muscle） • 心肌（cardiac muscle）。
• 3.心肌
• 心肌的单位是单核与分支的纤维，在生理上的特 点是具有节律性的收缩，而且这种收缩运动，不 受意识控制，所以，心肌是不随意肌。
• 心肌纤维的胞核呈圆形或椭圆形，位于纤维中央， 一般为1-2个。
• 肌原纤维较骨骼肌少，故肌质较多，因而纵纹较 骨骼肌明显，而横纹较弱。
• 心肌纤维彼此衔接处，具有强折光性的阶梯状横 线，称为闰盘（intercalated disk）它比明暗带 宽得多。
• 取心肌的切片标本，在显微镜下详细观察，并比
较心肌与骨骼肌和平滑肌在形态结构方面的异同：骨骼肌纤维呈长圆柱形，有许多 核，位于肌纤维的周边，呈卵圆形。将视野光 强度调暗些，可见每条纤维上有明暗相同的横 纹，这就是明带（Light band）和暗带（dark band）。
• 油镜：明带中有一条极细的黑线把明带均分为
3
二，这就是Z盘（Z-band），在暗带中也有一
4
肌肉组织观察
1
肌肉组织观察
• 1．平滑肌
• 小肠横切标本
• 低倍镜：找到肌层（以苏木素----伊红染色，肌层为深红色）。肌层由内 环行和外纵行的平滑肌纤维组成。
• 高倍镜：内层肌纤维呈长梭形，彼此镶嵌排列成环行。胞核兰紫色，呈
椭圆或棒状。外层的纵肌，因平滑肌纤维是镶嵌排列的，所以在横切面
上切到的肌纤维并不都在一个平面上，故有的有核，有的无核，且大小
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肌肉冰冻切片经常使用组织学及酶组织化学染色技术之阿布丰王创作
（—）苏木精和伊红染色（Hematoxylin and Eosin, HE）
1．苏木精溶液染色10分钟
2．流水冲刷10分钟
2．伊红溶液染色3分钟
4．流水冲刷1分钟
5．梯度酒精脱水,透明树胶封固
骨骼肌HE染色（肌膜核蓝色,肌纤维粉红色,结缔组织淡红色）
（二）改良Gomori三色染色方法（Modified Gomori Trichrome, MGT）
1．Harris苏木精10分钟
2．水冲刷 10分钟
3．Gomori氏溶液30分钟～60分钟
4．0．2%醋酸浸洗1分钟
5．酒精脱水,二甲苯透明,树胶封固.
骨骼肌MGT染色（核紫红,肌纤维暗绿色,胶原亮绿
色 ,线粒体红色）
（三）PAS反应法
(Periodic Acid Schiffs reaction, PAS) 1．固定于Carnoiy氏固定液10分钟
2．流水冲刷2分钟
3．0．5%过碘酸5分钟
4．蒸溜水洗1～2分钟
5．Schiff氏溶液15～30分钟
6．流水洗5～10分钟
7．Harris苏木精溶液2分钟
8．流水洗5分钟
9．脱水、透明、封固（合成树胶）
骨骼肌PAS染色结果：糖原红色,肌内肌原纤维用清
晰可见ⅡA纤维染色反应强,ⅡB、ⅡC、Ⅰ型纤维呈
中间型.
（四）苏丹黑B染色
1.苏丹黑溶液20分钟（加盖防气化）
2．流水洗
1．过滤的苏木精染1分钟
4．流水洗2分钟
5．甘油明胶封固
结果：脂类物质染成黑色,.
（五）四氮唑还原酶(NADH—tetrarolium redutase, NADH—TR )
1.孵育于下列基质内30分钟,37℃
0.05M（或0.2M）Tric缓冲液（PH7.4） 30ml 硝基四氮唑（BNT）30mg
NADH 24mg
2.蒸馏水洗.
3. 甘油明胶封固.
骨骼肌NADH－TR染色(Ⅰ型肌纤维紫兰色,Ⅱ型肌纤维淡灰色).
（六）琥铂酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase,SDH）
染色步伐
1．孵育于下列基质30分钟,37℃（琥泊酸钠100 mg 硝基四氮唑兰 10 mg 吩嗪二甲脂硫酸盐0.3 mg 0.1M Tris缓冲液30ml 调PH7.2 ）
2．顺序在60%、90%、60%丙酮顺序脱水及蒸馏水清洗
3．甘油明胶封固.
骨骼肌SDH染色（Ⅰ型纤维色深,ⅡA、ⅡC中间
型,ⅡB染色浅）
（七）细胞色素氧化酶染色（COX）
1．下述基质内孵育1～4小时 37℃
DAB（3, -3,-二氨基联苯二氨盐酸盐）30mg
0．1M醋酸缓冲
液 14. 0ml
1%氯化
锰
1.5ml
0．1%新鲜过氧化
氢 0.15m l
2．蒸馏水冲刷
3． 1%硫酸铜冲刷5分钟
4．蒸馏水冲刷
5．甘油封固
肌纤维呈褐红色,代表线粒体反应,细胞色素氧化酶缺陷时则无色.
（八）腺苷三磷酸酶(Adenosine Triphosphatase, ATPase)
1.制备下述溶液：
A）碱性溶液： 0.1M 巴比妥钠 1份体积
0.18M CaCl2 1份体
积
蒸馏水 3份体积
调PH 9.7-11.0
B）主要孵育液及上清液：
0.1M 巴比妥钠 2份体积
0.18M CaCl2 1份体积
蒸馏水 7份体积上述溶液分成二份即B（-）与B（+）,B（-）为上清液,B（+）液为孵育液,即将B液20ml+ATP-Na:50mg调PH9.7.
C）酸性反应液：
0.2M-巴比妥醋酸缓冲液
0.2M-巴比妥醋酸盐溶液 5份体积
0.1M HCL 10份体积
蒸馏水 8份体积
调PH 4.2-4.6
2．碱性PH染色片置于A液15分钟
3．10分钟后将酸性PH染色片置C液内5分钟
4．取出
5．全部切片置于B（+）溶液内45分钟6．制备下述溶液
1% CaCl2 2g/200ml
2%CoCl2 1g/50ml
0.01M- 巴比妥钠溶液 1000ml 7． 1% Cacl2溶液内洗三次10分钟. 8． 2%Cocl2 溶液内3分钟
9．流水洗2分钟
10．0.01M-巴比妥钠溶液内洗8次11．1%黄色硫化铵30秒
12．流水洗15分钟 0
13．脱水、50%—100%酒精
14．二甲苯透明两次
15．封固
（九）AMP染色(单磷酸腺苷脱氢酶) adenosine monophosphate deaminase 1）反应液
蒸馏水 14ml
AMP 6mg
NBT 15mg
3MKCl 1ml(搅拌同时慢慢加入)
0.1N NaOH 调整PH6.1
DTT 8mg
2)室温1小时反应
3）150mKCl-1.5mM citrate(PH6.0) 2次洗净
4）自然干燥
5）甘油胶封片固定
（十）Acid Phosphataso染色（酸性磷酸酶）
1）反应液①萘酚AS-BI （naphtol AS-BI） 1ml
巴比妥醋酸钠缓冲液(veronal acetate) 5ml
蒸馏水 14ml
②4%NaNo2(sodium nitrite)
0.8ml
副品红碱液(pararosaniline) 0.8ml 室温放置2分
②加入①中混合PH4.7-5.0用1N NaOH
调整过滤
2）37℃孵化60分
3）水洗
4）2%甲基绿(methyl green)（滤过）数秒
酒精脱水,二甲苯透明.
5）加拿年夜胶封片固定。