岛津制备纯化系统
阿司匹林(Aspirin)的合成纯化与分析_
• (3) 由于水杨酸乙酰化不完全，可能含有水杨 酸杂质，可以在各步纯化及重结晶时除去；为了 检验产品中是否还有水杨酸，利用水杨酸属酚类 物质可与三氯化铁发生颜色反应的特点，用几粒 结晶加入盛有3 mL水的试管中，加入1～2滴1% FeCl3溶液，观察有无颜色反应（紫色）。
加？为什么？ • 2. 本反应可能发生那些副反应？产生哪些副产物？ • 3. 阿司匹林精制选择溶媒依据什么原理？为何滤液要自然
冷却？ • 4． 在乙酰水杨酸重结晶时，滴加水的标准是什么？为什
么这样做？ • 5． 计算乙酰水杨酸含量的表达式。 • 6． 用返滴定法测定乙酰水杨酸含量时，1mol乙酰水杨
• 阿司匹林的鉴定与IR分析
• (1) 用熔点仪测定产物的熔点，与文献值 比较。
• (2) KBr压片法测定产物的红外光谱图， 指出各主要吸收特征峰的归属，并与乙酰水杨 酸的标准图谱比较。
•
(3) 与FeCl3显色实验：取几粒结晶（产
物）,加入盛有5 mL水的试管中，加入1～2滴
1% FeCl3，观察有无颜色反应。
阿斯匹林的红外光谱表征
FTIR-8400S红外光谱仪（日本，岛津公司）
样品的测定（KBr压片法） 固体样品测定流程示意：
制备KBr空白压片 （高纯KBr可不做）
空气（高纯KBr时）
背景扫描 Background Scan
谱图处理
样品扫描 Sample Scan
制备固体样品和 KBr压片
KBr压片的制备（以制备Aspirin样品为例）
阿司匹林（Aspirin）的合 成纯化与分析
乙酰水杨酸俗称阿司匹林，为重要的医 药。具有退热、镇痛、抗风湿等作用。
反相液相色谱对多肽的分离、纯化与制备-由全球最大的制备乙腈生产商宿松龙华友情提供
反相液相色谱对多肽的分离、纯化与制备白 泉3 葛小娟 耿信笃(西北大学现代分离科学研究所,现代分离科学陕西省重点实验室,西安710069)摘 要 用反相高效液相色谱(RP LC )对两种化学合成多肽———32肽和21肽进行了分离、纯化和制备。
在用分析型RP LC 色谱柱对多肽样品的制备过程中,对其进样量和洗脱梯度进行了选择。
每次进样量为5mg ,在最优化色谱条件下,用RP LC 一步就可对21肽进行分离纯化,其纯度达到98.6%。
而32肽由于样品组分更加复杂,RP LC 一步纯化后其纯度仅有80%。
通过对色谱分离条件的再次优化,对32肽进行二次分离纯化,纯度达到96.4%。
在其最优化条件下,通过多次样品收集和冷冻干燥,分别制备了高纯度的21肽和32肽各100mg 。
关键词 反相高效液相色谱,多肽,纯化,制备色谱，制备级溶剂，制备乙腈，ＨＰＬＣ乙腈1 引 言随着现代生物技术的发展,出现了各种多肽类药物,多肽在临床医学中有巨大的应用价值。
自从发明固相法化学合成多肽以来,有关各种活性多肽的化学合成有了很大发展1,但产物成分比较复杂,一般是以目标多肽为主的几种结构相似的多肽混合物,因此,对这一混合物的分离纯化一直是一个重要的研究课题,对其分离纯化的最优化研究就显得格外重要。
此外,提供高纯度的多肽样品,对于其物化性质、生物活性及其医药功能的研究具有重要的作用。
从现代分离科学理论得出,色谱和电泳是目前所知的分离效果最佳的两种方法。
电泳仅能用于分离而不能用于多肽的制备2～4。
反相高效液相色谱(RP LC )具有分离效果好、分辨率高、回收率高的特点,在多肽的分离纯化和制备中备受青睐,因此,RP LC 是目前分离纯化和制备多肽的主要手段4～9。
本文拟用RP LC 对化学合成的32肽和21肽进行分离、纯化和制备。
2 实验部分2.1 仪器SC L 210AVP 液相色谱仪(日本岛津公司),包括系统控制器、LC 210AT VP 色谱泵、进样阀、SPD 2M10AVP 二极管阵列检测器,C LASS 2VP5.33色谱工作站。
岛津仪器维护基础知识
手动进样器
手动进样器操作注意事项
针头密封垫
1. 进样请使用液相色谱专用平头进样针
2. 进样时，进样针应插入针导管到底
3. 清洗请使用专用进样口清洗器
弹簧 不锈钢套 4. 样品溶液pH小于10, 常用密封垫的Vespel材质
转子
（适用pH<10）, 否则换Tefzel或PEEK材质的密封
定子
垫（pH 0-14）
日常使用注意点 1. 过滤流动相和样品 2. 恰当的样品前处理方法 3. 使用保护柱 4. 注意冲洗系统
柱效低
原因 色谱柱被污染 筛板堵塞 柱内死体积增加
解决方法 1. 正向冲洗色谱柱 2. 反向冲洗色谱柱 3. 超声清洗色谱柱筛板 4. 柱内死体积增加，需更换新柱
日常使用注意点 1. 定期冲洗色谱柱 2. 防止机械震动和柱压急剧变化 3. 关注色谱柱柱效变化
措施：用针筒注入 异丙醇，清洗样品 池；如污染严重， 拆开样品池，将透 镜等放入异丙醇中 清洗。
更换氘灯 判断氘灯能量：
设定220 nm波长，检查参比池能量， 如能量低于 800mV，需考虑更换氘灯。
部件号：228-34016-02
SPD-10A/SPD-10Avp
SPD-20A/AV用
部件号：228-34016 SPD-M10Avp/SPD-M20A用
混合器不同体积的连接方法
混合器故障处理
常见故障：堵塞 混合器堵塞往往是由于 混合器过滤组件堵塞引起的。
处理方法： 按图中结构卸下过滤组件，
5%稀硝酸或其他溶剂超声波浴 清洗或更换新的组件
标准或半微量混合器用 部件号：228-18872-93
LC-20AT 各部件定期检查和维护清单
以虫白蜡为原料制备及纯化二十八烷醇
油， 蜂蜡及虫蜡等天然产物 中【 据报道， ２ １ ． 虫蜡富含二十八烷醇， 含量在３％ ４％ 之间， ０ ５ 是制备二十八烷醇
的优质天然原料．
二十八烷醇的常用制备方法有 ： ①蜡皂化分解， 除皂提取脂肪醇； ②蜡醇相皂化分解， 有机溶剂提取脂肪醇 ；
⑨蜡醇解， 通过真空蒸馏脱除脂肪酸低级醇酯， 得脂肪醇； 蜡经酸或碱分解， ④ 再经超临界流体浸出脂肪醇． 这 些方法只能得到混合醇产品， 这些混合醇可直接用于营养补品中， 但要制 出的产品符合功能性食 品、 医药和化妆
的分离．
虫蜡脂肪醇主要含二十六烷醇 （ ５ ４％） ３ ％一 ０ 和二十八烷醇 （ ０ ４％ ） 二十六烷醇和二十八烷醇物化 ４ ％一 ５ ， 性质十分接近， 不适合采用溶剂结晶法提纯， 多采用真空蒸馏分离纯化． 本文采用商品虫蜡为原料， 采用醇相皂 化法提取二十八烷醇粗品， 同时应用最新的多级分子蒸馏进行精制提纯， 提高了产品纯度和品质．
收稿 日期 ：２ ０ －１１ ０ ７１－０
作者简介：朱进（ ７－ 男， １ Ｏ） ９ ， 四川大学硕士生
维普资讯
第 ｌ期
朱进等 ：以虫白蜡为原料制备及纯化二十八烷醇
ｌ５ ４
２ 实验方法与步骤
２１ 醇 相皂 化法制 备二 十八 烷醇 ．
称取５ｇ ０ 虫蜡， 置于１０ Ｌ ．Ｉ ００ ＿ 烧瓶中，／Ｎ ０ｍ ５ ｍ ＝Ｖ Ｊ ． ０ ｌ ％乙醇，同时加入虫蜡质量百分￣ １ｏ的Ｋ Ｈ 搅拌， ／ ２ Ｌ ９ １０ － Ａ Ｏ ， ，
文章编号：０３ ８ ３ ０８ １ １ －５ １ － ４（ ０ ） － ４ ０ ０２ ２ ００ ４
以 虫 白蜡 为 原料 制 备 及纯 化 二十 八 烷 醇
(完整版)岛津液相色谱维护
8 检测器
9
废液瓶
10
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3.高压梯度系统
1 储液瓶 2 脱气机 3 泵单元
4 混合器
5 自动进样器 6 色谱柱
7 检测器
8 废液瓶
11
11
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垫圈 不锈钢接头
PEEK接头
32
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死体积
• 死体积可能会引起分离度变差和重现性变差等问题.
公螺母 死体积
管线
好的连接
差的连接
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液相系统维护流程图
线路过滤器
单向阀
柱塞密封圈
吸滤头
色谱柱
检测器
手动进样器
28
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一、输液部分
29
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如果有压力但是压力比正常时低： 漏液 单向阀堵塞
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岛津液相色谱仪的日常维护与注意事项
岛津液相色谱仪的日常维护与注意事项一、日常维护：1. 定期清洗单向阀：将单向阀卸下,一般先用纯净水超声10分钟,然后用异丙醇超声10分钟；也可直接用异丙醇超声10分钟;2．定期清洗吸滤头：将吸滤头卸下,一般先用纯净水超声10分钟,然后用异丙醇超声10分钟；也可直接用异丙醇超声10分钟;3．定期冲洗检测池：把色谱柱卸下,在流速1.0ml/min的状态下先用纯净水冲洗30分钟,然后再用30%磷酸色谱级冲洗30分钟左右,再用超纯水冲洗至流出液为中性,最后用甲醇冲洗,待用;二、注意事项：1. 开始进样前30分钟开氘灯即可,节约灯的能量和使用时间;2. 流动相的使用和注意事项：①所用流动相必须预先滤过和脱气,流动相一般贮存于玻璃不锈钢容器内;贮存容器一定要盖严,防止溶剂挥发引起组成变化;磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉,应尽量新鲜配制使用,不要长期贮存;容器应定期清洗,特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子,以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物;②配制流动相用水需为娃哈哈牌纯净水或经超声过滤后的纯化水,流动相配制好后先用直径为5cm,孔径为0.45ｕm的滤膜,通过沙芯过滤器的过滤,然后在超声仪上超声;③不得将装流动相的容器直接放置与超声仪内,需放与筛网上进行超声;3. 六通阀的使用和维护注意事项：①样品溶液进样前必须用滤膜过滤,以减少微粒对进样阀的磨损;②转动阀芯时不能太慢,更不能停留在中间位置,否则流动相受阻,使泵内压力剧增,甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时,过高的压力将使柱头损坏;③为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中,每次分析结束后应冲洗进样阀;通常可用水冲洗,或先用能溶解样品的溶剂冲洗,再用水冲洗;4. 色谱柱柱压升高的主要因素：① LC-10AT/20AT/10ATPlus泵的单向阀堵塞;②色谱柱的入口筛板堵塞;③吸滤头堵塞;④ PEEK管接口处堵塞;5. 色谱柱柱压不稳的因素：①泵内有空气;②泵密封垫损坏;③溶剂中的气泡;④系统检漏,找出漏点;6. 样品峰保留时间漂移的主要因素：①室内温度变化过大; ②流动相成分发生变化;③色谱柱未平衡好;④泵中有气泡;⑤该流动相是否适宜此样品的检测;7. 基线漂移的主要因素：①柱温波动;②流动相不均匀;③流通池被污染或有气体;④检测器出口阻塞;⑤流动相配比不当或流速变化;⑥流动相污染、变质;⑦使用循环溶剂;8. 检测器灵敏度不够的主要因素：①样品进样量不足;②波长设置不正确;③检测器池窗污染;④检测池中有气泡;⑤电压不稳;⑥流动相流速不合适;9. 色谱柱的使用和维护注意事项：①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动;柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料,因此在调节流速时应该缓慢进行,在阀进样时阀的转动不能过缓;②应逐渐改变溶剂的组成,特别是反相色谱中,不应直接从有机溶剂改变为全部是水,反之亦然;③一般说来色谱柱不能反冲,只有生产者指明该柱可以反冲时,才可以反冲除去留在柱头的杂质;否则反冲会迅速降低柱效;④选择使用适宜的流动相尤其是pH,以避免固定相被破坏;⑤避免将复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内,需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱;⑥经常用强溶剂冲洗色谱柱,清除保留在柱内的杂质;⑦保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇,柱接头要拧紧,防止溶剂挥发干燥;绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间;⑧色谱柱使用过程中,如果压力升高,一种可能是滤片被堵塞,这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内,使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形,则可能柱头出现塌陷,死体积增大;⑨以硅胶为基质的填料,只能在pH2~9范围内使用;每次分析检测完成后,最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗,例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡;10. 样品必须用直径为2.5cm,孔径为0.45ｕm的滤膜针式过滤;如有明确要求需用离心过滤的,经离心过滤后取上清液即可;。
蜜蜂所20万元以上大型科研仪器列表
紫外/可见分光光度计
岛津UV-2500
蜂资源与遗传育种研究室
6
凝胶成像分析系统
GELDOCXR
蜂资源与遗传育种研究室
7
全自动核酸纯化仪
QIAcube
蜂资源与遗传育种研究室
8
荧光定量PCR仪
DNA-ENGINE
蜂资源与遗传育种研究室
9
细胞技术工作站
NO3+OLYMPUS IX71
蜂资源与遗传育种研究室
检测中心
56
气相色谱仪
GC7890A
检测中心
57
GPC净化浓缩系统
AccuPrep MPY
检测中心
58
全自动固相萃取仪
PrepLinc YPE
检测中心
59
气相色谱仪
HP6890
检测中心
60
超临界萃取仪
Ype-ed YFE-Prime
检测中心
61
高压液相色谱仪
600E
检测中心
62
液相色谱仪
LC1200
检测中心
49
荧光分光光度计
RF-5301PC
检测中心
50
氮气发生器
Genius 1022
检测中心
51
薄层色谱扫描仪
TLC SCANNER3
检测中心
52
全自动定量浓缩仪
AccuVap EVY
检测中心
53
多功能前处理
PAL Combi-xt
检测中心
54
显微镜
DM5500B
检测中心
55
荧光定量PCR仪
7300
AKTA Explorer
蜜蜂饲养及蜂业机械研究室
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32
二极管阵列检测器在制备液相色谱中的应用
摘要：本文阐述了岛津SPD-M20A二极管阵列检测器在LC-6AD制备液相色谱中的应用。
使用Shim-pack PRC-ODS 20 mmID.×250 mmL. 15 μm色谱柱和水-甲醇为流动相，采用梯度
洗脱的方式，水平（Level）收集方式，对混合药物成分进行分离和收集，并进行纯度检测。
关键词：制备液相色谱 二极管阵列检测器 化学药 分离纯化
二极管阵列检测器，又称光电二极管列
阵检测器或光电二极管矩阵检测器，表示为
PDA（photo-diode array）、PDAD（photo-diode
array detector）或（Diode array detector，DAD）
是20世纪80年代出现的一种光学多通道检
测器。
岛津SPD-M20A具有512个光电二极
管，检测波长范围190-800 nm，其特点是一
次进样可以获得设定波长范围内每个波长
下的紫外吸收信息，并且数据处理更快，不
仅可以克服普通紫外可见吸收检测器的缺
点，而且还能获得色谱分离组分的三维光谱
色谱图，为分析工作者提供十分丰富的定性
定量信息。
使用二极管阵列检测器作为制备液相
色谱仪的检测器可以大为提高检测的效率，
克服了样品中不同化合物由于特征吸收波
长不同而产生响应差异对收集结果的影响。
通过PDA数据可以建立一次进样纯化中适
合多个不同吸收特性的样品制备分离方法。
并且通过LabSolutions工作站实时得到已分
离目标峰的峰纯度和光谱图，为纯化结果的
纯度检测的定性分析提供强有力的手段。
1.仪器配置
类型：岛津制备型高效液相色谱仪
配置：LC-6AD×2（输液泵）
SIL-10AP（自动进样器）
SPD-M20A（二极管阵列检测器，配
制备型流通池）
FRC-10A（馏分收集器）
CBM-20A（系统控制器）
LabSolutions Ver. 5.42（色谱工作站）
2.分析条件
2.1液相条件
色 谱 柱： Shim-pack PRC-ODS 20 mm i.d×250 mm L, 15 µm 流 动 相： A相-水 B相-甲醇 洗脱方式： 梯度洗脱，梯度程序见表1
流 速： 10 mL/min
收集波长： 220 nm
进 样 量： 500 µL
2.2收集参数
半 峰 宽： 2 sec
斜 率： 0 μV/sec
水 平： 50000 μV
收集体积： 16.0 mL
响 应： 0.16 sec
33
表1 梯度时间程序
Time Module Command Value
1
0.01 Pump Pump B Conc. 90
2
10.00 Pump Pump B Conc. 100
3 12.00 Pump Pump B Conc. 100
4
12.10 Pump Pump B Conc. 90
5
15.00 ControllerStop
3.结果与讨论
根据化学药样品HN中两种主要成分的紫外吸收特性，确定满足两种成分具有显著吸收
现象的220 nm作为二极管阵列检测器的收集触发波长。
图1 化学药样品HN中两种主要成分的紫外吸收等高线图
两种化学药品混合物HN的制备色谱图如下所示。
图2
两种化学药品HN的制备色谱图
使用LabSolutions色谱工作站配合SPD-M20A二极管阵列检测器对收集到的两个峰进
行峰纯度检测，如图3所示，结果显示均未有不纯物检出。
peak1（Rt 6.30 min） peak2（Rt 9.37 min）
图3 收集的目标峰峰纯度检测图
0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.0min
200
225
250
275
300
nm
0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.010.011.0min
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
mAU(x1,000)2.53.03.54.04.55.05.5MPa
220nm4nm (1.00)
5.56.06.57.0min0.000.250.500.7502505007501000mAUPeakZero LinePurity Curve9.09.510.010.5min
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
0
250
500
750
1000
1250
1500
mAU
PeakZero LinePurity Curve
34
peak1（Rt 6.30 min） peak2（Rt 9.37 min）
图4 收集的目标峰光谱图（波长范围：190-400 nm）
LC-6AD是岛津一款可以用于分析和半制备色谱使用的输液泵，其输液流速在0.01-20.0
mL之间，可以满足常规液相分析和半制备的需要。本套制备液相色谱系统配合岛津二极
管阵列检测器SPD-M20A，对目标峰进行按照水平方式收集，收集的同时可以应用
LabSolutions工作站中PDA数据的峰纯度检测功能对分离结果进行检测，方便又高效，通
过光谱图的比对和光谱库检索，可以为样品制备分离工作结果的定性确认提供一种快速又
高效的方法。
200250300350nm025050075010001250mAU 6.327/ 1.00242383200250300350nm
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
mAU
9.381/ 1.00
2
1
2
2
7
5
2
6
6
1
9
4
2
6
9
2
3
5