蛋白质电泳技术介绍

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❖ 6. 测定pH梯度 将放在另一个培养皿内未固定的胶条，用直尺量出待测pH 胶条的长度“L1”。按照由正极至负极的顺序，用镊子和 小刀依次将胶条切成10mm长的小段，分别置于小试管中， 加入1ml H2O，浸泡半小时以上或过夜，用仔细校正后的 带细长pH复合电极的pH计测出每管浸出液的pH值。
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❖ 染色 将凝胶小心取下放入容器中，加入染色液（考马斯亮蓝 ），用摇床摇2－3h ❖ 脱色 待条带清晰后倒出染色液，加入脱色液过夜。将脱色液倒掉 ，可以用Quality One，或者相应的成像系统拍照、分析、 估算蛋白浓度。
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等电聚焦电泳 (Isoelectro focusing IEF or EF)
3 形成电场
2 蛋白质加样
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4 蛋白质移动到它 们各自的等电点， 不同等电点的蛋 白质被分开
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+
pH 3
+
pH 3
+
pH 3
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pH 7.5
pH 7.5 pH 7.5
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pH 10
–
pH 10
–
pH 10
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pH梯度构建
载体两性电解质pH梯度 (Carrier ampholytes pH gradients， CA):在电场中通过两性缓冲离子建立的pH梯度。
碱 性端为负。
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❖ 5. 固定 取2支胶条置于一个小培养皿内，倒入10%三氯乙酸溶液至没 过胶条，进行固定，约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的 白色沉淀带。固定完毕，倒出固定液，用直尺量出胶条长度 “L2”和正极端到蛋白质白色沉淀带中心（即聚焦部位）的 长度“L’”。 固定后的胶条可在康强860紫外/可见分光光 度计上用280nm或238nm波长作凝胶扫描，然后用扫描图作相 应的测量和计算。
电泳技术介绍
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SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-PAGE
(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)
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基本原理
1.SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二 级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二 硫键断裂。
2.蛋白质样品在100℃用SDS和还原剂处理，可解聚 成亚基,加入SDS，改变了蛋白质的构象。
透析或凝胶过滤法分开。 ❖ (4)化学组成应不同于被分离物质，不干扰测定。 ❖ (5)应不与分离物质反应或使之变性。
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操作流程
制胶 装管 装槽，电泳 剥胶 固定 测定pH梯度
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具体步骤
❖ 1. 配胶 ❖ 2. 装管 每个学生装两支管，每组装四支。先用肥皂洗手，然后将圆
盘电泳槽的玻璃管洗净，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂
直放在试管架上，用移液管将配好的胶液移入管内，（每根
玻璃管的容量约为1.5-1.8ml）,液面加至距管口1mm处，用
注射器轻轻加入少许H2O，进行水封，以消除弯月面使胶柱
顶端平坦。胶管垂直聚合约30分钟，聚合完成时可观察到水
封下的折光面。
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❖ 3. 装槽和电泳 ❖ 用滤纸条吸去胶管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端
3.各种SDS-蛋白质复合物均带相同密度的负电荷，
其荷电超过了原蛋白质，消除了不同蛋白质的荷
电差异。
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图解
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混合大分子 电泳
多孔凝胶
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操作流程
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制胶 上样 电泳 染色 脱色
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具体步骤
❖ 制胶 ❖ 1将玻璃板用蒸馏水洗净晾干，把玻璃板在灌胶支架上固定好 ❖ 2 按照配方制备分离胶，TEMED在灌胶前加入混匀，迅速灌胶 ❖ 3 在分离胶上迅速并轻柔的加上水或无水乙醇进行水封（凝
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❖ 4. 剥胶 取下胶管，用H2O 将胶管和两端洗2次，用注射器沿管壁轻 轻插入针头，在转动胶管和内插针头的同时分别向胶管两端 注入H2O少许，胶条即自行滑出，若不滑出可用洗耳球轻轻 挤出。胶条置于小培养皿内，记住正极端为“头”，负极 端为“尾”，若分不清时，可用pH试纸鉴定，酸性端为正，
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优缺点
❖ 优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自 由，重现性好，不仅可测定蛋白或多肽的等电点 而且能将不同等电点的混合生物大分子进行分离 和鉴定 。
❖ 缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解 或发生变性的蛋白。
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双向电泳 （2-D electrophoresis）
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胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面） ❖ 4 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连
续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟
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❖ 上样 按一定顺序在加样孔中加入样品，根据SDS-PAGE电泳玻璃板 间隙厚度不同，选择加入样品量。 ❖ 电泳 打开电源将电压调到80v（一般15min左右），待样品跑过压 缩胶后将电压调到120v至样品电泳到胶底部为止。
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基本原理
等电聚焦电泳 ，是利用有pH梯度的介质分离 等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨 率可到达0.01pH单位，因此特别适合于分离分 子量相近而等电点不同的蛋白质组分。
适用: 1.研究蛋白质微观不均一性
2.测定蛋白质等电点
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1 用电流在凝 胶溶液中建 立一个稳定 的PH梯度
固相pH梯度（immobilized pH gradients， IPG） 将缓冲基团共价键合在介质上成为凝胶介质 的一部分而建立pH梯度（线性和非线性），分辨率 比前者高一个数量级。
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载体两性电解质（CA）应具备的条件
❖ (1)在等电点处必需有足够的缓冲能力 ❖ (2)在等电点必需有足够高的电导 ❖ (3)分子量要小，便于与被分离的高分子物质用
基本原理
第 一 向 进 行 等 电 聚 焦 ， 蛋 白 质 沿 pH 梯 度 分 离 （将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合， 在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯 酰胺骨架中而形成pH梯度），至各自的等电点； 随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离。
向上，将胶管垂直插入圆盘电泳槽内，调节好各管的高度 ，记下管号。每支管约1/3在上槽，2/3在下槽。上槽加入 500ml 0.1M H3PO4，下槽加入500ml 0.1M NaOH，淹没各 管口和电极，用注射器或滴管吸去管口的气泡。上槽接正 极，下槽接负极，开启电泳仪，恒压160V，聚焦2至3小时 ，至电流近于零不再降低时，停止电泳。