小麦特异性启动子
小麦WRKY转录因子VIGS基因沉默载体构建及验证
小麦WRK转录因子VIGS基因沉默载体构建及验证：WRKY transcription factor family can help improve plant stress tolerance ，which widely exist in variousplants. After TaWRKYgene was silenced by VIGS method，it was found that the proportion of succeed Bgt inoculation increased ，and the percentage of abnormal appressoria declined ，such as papilla. The results indicated that TaWRKY gene played an important role in wheat- Bgt interaction.小麦白粉病是由布氏白粉菌( Blumeria graminis f. sp. Tritici )侵染所引起的真菌感染性病害，如遇高温多湿天气病害流行，会使小麦严重受害，导致减产13%- 34%[1]。
因此，科学家一方面通过抗病育种，不断培育新的抗病小麦品种来抵御病害，另一方面通过深入的抗病分子机理研究，克隆抗病相关基因、弄清抗病信号通路以及基因工程等技术手段，以达到抗病分子育种的目的。
转录因子可以与真核基因启动子区中的顺式作用元件互作，激活或抑制多个下游功能基因转录，从而使植株获得综合改良效果。
研究表明，WRK转录因子家族几乎存在于所有植物中，它们共同含有一段高度保守氨基酸序列WRKYGQK[2] WRK广泛参与植物种子萌发与休眠、开花、代谢、激素信号转导，还参与抵御生物和非生物胁迫等反应过程。
拟南芥AtWRK Y3基因直接调控了植物抗毒素Camalexin 的合成[3] ，并且调控大量抗病相关基因的表达[4]。
小麦转录因子基因TaNAC67参与调控穗长和每穗小穗数
作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2019, 45(11): 1615 1627/ ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9E-mail: zwxb301@DOI: 10.3724/SP.J.1006.2019.91009小麦转录因子基因TaNAC67参与调控穗长和每穗小穗数张宏娟1,2李玉莹2,3苗丽丽2王景一2李超男2杨德龙1,*毛新国1,2,*景蕊莲21甘肃农业大学生命科学技术学院, 甘肃兰州 730070; 2中国农业科学院作物科学研究所/ 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程/ 农业部农作物种质资源创新与利用重点开放实验室, 北京 100081; 3河南农业大学农学院, 河南郑州 450002摘要: NAC转录因子是植物特有的一类转录因子, 在植物生长发育和逆境胁迫应答反应中发挥着重要作用。
前期研究表明, TaNAC67参与对多种逆境胁迫的应答, 过量表达能增强拟南芥的抗逆性。
为进一步揭示其在调控小麦主要农艺性状发育方面的作用, 本研究以36份普通小麦组成的高多态性群体为材料, 测序分析了TaNAC67-6A、TaNAC67-6B、TaNAC67-6D序列多态性, 发现TaNAC67-6A启动子区–1516 nt有1个A/G转换SNP, 在–873~ –748 nt处有1个126 bp的InDel; TaNAC67-6B启动子区–2014和–1916 nt处各有1个C/T转换SNP; TaNAC67-6D启动子区–1795 nt有1个T/G颠换SNP, 编码区357 nt处有1个C/T转换SNP。
根据多态性分别开发了功能分子标记, 扫描由282份普通小麦构成的自然群体, 并将基因型和表型性状检测结果进行关联分析, TaNAC67-6A、TaNAC67-6B的标记与表型性状无显著关联, 而TaNAC67-6D的2个标记SNP-D-1和SNP-D-2分别与小麦穗长和每穗小穗数显著相关。
PCR技术
环化 酶切体系中加入无菌水至终体积为 200ul，加 入200ul 氯仿 ：异戊醇(24:1）用涡旋仪混匀， 12000r/min离心5min; 取上清加入2倍体积 95%乙醇， 缓慢混匀后12000r/min离心5min,弃去液体，在管底 和管壁可见透明颗粒状沉淀，室温干燥DNA，溶解在 20ulTE溶液中。严格限制连接体系中DNA的终浓度小 于2ug/ml，连接环化体系为 500uL，连接酶300U/ug 用量为2ug连接过夜后，反应体系经酒精沉淀，溶解 在20ulTE溶液中，作为PCR反应模板。
目
录
PCR技术的概念及基本原理
PCR技术的反应体系
PCR技术的类型及应用
概念
PCR 技术 （聚合酶链式反应 ) 是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的 分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊 DNA复制， PCR的 最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
基本原理
PCR技术的基本原理类似于 DNA的天然复制过程，其特异性依赖 于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三 个基本反应步骤构成，利用DNA在体外摄氏 95 度高温时变性会变 成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对 的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右） ，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
《肠道病毒71型的RT-PCR诊断及基因特征》 本文采用RT-PCR鉴定采集于手足口病疱液的10株 病毒，其结果与血清实验一致，鉴定出其中3株为 EV-71型，另外7株为Cox.A16。EV71常规的诊断方法 为病毒分离培养,中和抗体检测和免疫组织化学法。 EV71主要引起手足口病和中枢神经系统感染,而神经 毒力的基因特征的确定依赖分子遗传学的分析,这些 方法费时、费力,无法满足疾病流行期间同时处理大 量标本的需要。RT-PCR可以在疑似该疫情爆发时做 出及时正确诊断。
植物诱导型启动子的研究进展
效表达 ，其诱导 型是 由其上存 在 的正 负调控元 件相互作 用
而 决 定 的 。 综 述 了诱 导 型 启 动 子 的种 类 、 启 动 子 序 列 内部 调 控 元 件 的 类 型 以及 适 用 于诱 导 型 启 动 子 的研 究 方 法 ， 并 对 其 在 植 物 基 因 工程 中 的 应 用前 景进 行 了展 望 。 关 键 词 ：启 动 子 ；诱 导 型 ；调 控 元 件
赫
中 图分 类 号 ： 一 Ｑ３
文献标志码 ： Ａ
● 农业生产
文 章 编 号 ：６ ４ ３４ （０ ０ — ０ ５ ０ １７ — ５ ７２ １ ）３ ０ ０ — ５ １
植 物 诱 导 型 启 动 子 的研 究 进展 米
王志新 ，赵 琳 ，李文滨”
１０ ３ ） ５ ００ （ 东北农业大学大豆生物学教 育部 重点实验 室，哈 尔滨
导 ； （ ） 有 增 强 序 列 、沉 默 序 列 或 类 似 功 能 ； ２具
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摘要启动子是基因表达调控重要的元件，启动子的活性间接反映了它所控制的基因表达。
组织特异性启动子作为启动子的一种，可以启动外源基因在受体植物的特定组织器官中高效表达，减少不必要的浪费。
WRKY基因家族是在植物中起特异作用的一类转录调控因子，它被证明了参与植物的抗病反应，还影响植物的衰老、抗胁迫以及生长和发育。
本实验克隆了一个玉米WRKY基因的启动子，采用GUS报告基因对WRKY 基因的启动子功能进行了分析，通过启动子的删减实验，水稻的遗传转化及组织的GUS染色，取得如下结果：1、根据网上预测的WRKY基因设计引物，从玉米(玉米品种B73)中扩增了该基因的启动子部分，命名为P2880，在启动子顺式作用元件预测网站上分析该启动子序列，预测到存在TATA盒、CAAT盒和GATA盒等多个作用元件。
2、克隆出WRKY基因上游的启动子并且克隆了4个5’端缺失启动子，5个启动子的长度依次为2880bp、1812bp、1254bp、680bp和355bp。
将5个启动子与含有GUS报告基因的质粒pCAMBIA1301连接并构建了pCAM2880GUS和4个5’端缺失启动子载体，将缺失载体分别命名为pCAM1812GUS、pCAM1254GUS、pCAM680GUS和pCAM355GUS。
3、用农杆菌介导法将所有植物表达载体转化水稻，获得了37棵转基因植株。
由实验结果可知，pCAM2880GUS载体对应的转基因植株愈伤组织染色结果为蓝色，而pCAM1812GUS、pCAM1254GUS、pCAM680GUS、pCAM355GUS载体对应的转基因植株的愈伤组织均未染上蓝色，由此可知P2880启动子的核心区域位于转录起始位点前2880bp至1812bp之间。
综上所述，本研究克隆了一个玉米WRKY基因启动子，并发现该启动子是一个愈伤特异性启动子，而目前WRKY基因未有愈伤组织表达特异性的报道，该启动子的克隆对玉米相关基因功能研究具有重要的意义。
2024北京西城高一(下)期末生物(教师版)
2024北京西城高一（下）期末生物2024.7本试卷共10页，100分。
考试时长90分钟。
考生务必将答案答在答题卡上，在试卷上作元效。
考试结束后，将本试卷和答题卡一并交回。
第一部分本部分共15题，每题2分，共30分。
在每题列出的四个选项中，选出最符合题目要求的项。
1. 孟德尔运用假说-演绎法发现分离定律，其对分离现象的原因提出的假说不包括（）A. 生物的性状由遗传因子决定B. 形成配子时成对的遗传因子分离C. 受精时，雌雄配子的结合是随机的D. F₁与隐性纯合子杂交，后代性状分离比为1：12. 美洲原住民有两种类型的耳垢：干燥和粘稠。
统计不同表型亲本组合所生后代的耳垢类型，结果如表。
下列说法错误．．的是（）A. 由组合 3 可知耳垢粘稠对干燥为显性B. 组合1 的亲本中可能有纯合子C. 组合2子代中耳垢粘稠个体为杂合子D. 据此结果不能判断是否为伴性遗传3. 鹌鹑的性别决定方式为ZW型，白羽和栗羽由一对等位基因控制。
一群栗羽鹌鹑雌雄相互交配，每一代都会出现白羽鹌鹑，且均为雌性。
下列说法错误．．的是（）A. 栗羽和白羽为一对相对性状B. 控制白羽和栗羽的基因位于性染色体上C. 将栗羽雄鹌鹑与白羽雌鹌鹑杂交，子代中白羽雄鹌鹑约占 1/8D. 将栗羽雌鹌鹑和白羽雄鹌鹑杂交，可通过羽色判断子代幼鸟性别4. 对于基因的理解，正确的是（）A. 基因是构成DNA 的基本结构单位B. 基因通常是有遗传效应的DNA 片段C. 基因都编码蛋白质D. 基因、蛋白质、性状为一一对应关系5. 下图为华北落叶松 ()224n =小孢子母细胞减数分裂过程图。
相关叙述错误．．的是（ ）A. ②为减数分裂 Ⅰ中期B. ③时期同源染色体分离，分别移向细胞两极C. ④时期每个核中有6对同源染色体D. ⑥时期每个核中DNA 数为④时期的一半6. 沃森和克里克揭示了 DNA 的双螺旋结构。
关于 DNA 双螺旋的叙述正确的是（ ） A. 脱氧核糖和碱基交替连接构成基本骨架 B. GC 含量越高的DNA 分子热稳定性越低 C. 每条单链上的嘌呤碱基数等于嘧啶碱基数 D. 双螺旋结构为DNA 复制提供了精确的模板7. 将蚕豆根尖在含³H-胸腺嘧啶的培养基培养一个细胞周期后，转至无放射性的培养基继续培养一个细胞周期。
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小麦特异性启动子第四章小麦胚乳特异性启动子克隆及活性研究引言小麦HMW-GS 是一类种子贮藏蛋白，它的表达具有很高的胚乳专一性。
因此，克隆了HMW-GS 基因的启动子，分析其序列特征，找出其与胚乳特异性有关的元件，为HMW-GS 的种子特异性表达提供理论依据，也为利用转基因技术改良小麦品质所需的高效种子特异性启动子奠定基础。
本章拟解决以下问题：扩增并克隆HMW-GS 启动子。
构建HMW-GS 启动子与GUS 基因融合的瞬时表达载体。
利用基因枪技术将其导入小麦叶片及种子中，通过瞬时表达、GUS 染色检测以验证克隆的启动子具有胚乳特异性。
为下一步利用基因工程技术改良小麦品质奠定基础，也是以小麦种子作为生物反应器生产外源蛋白的前提。
1 材料与方法植物材料小麦：Xiaoyan 6菌株与质粒受体菌株：JM109（陕西省农业分子生物学重点实验室保存）克隆载体：pMD18-T（大连宝生物工程有限公司），质粒图谱及多克隆位点见图2 基因组DNA 的抽提以小麦种子（Xiaoyan 6）在室温下暗培养7 天后的黄化苗为材料进行基因组DNA提取。
DNA 抽提液为DNA extraction、Nuclei lysis buffer 和5% sarkosyl 按1:1:0.4 比例混匀，再加入亚硫酸氢钠（3.8 g/L）,65℃预热，即为抽提液。
基因组DNA 抽提步骤及试剂配制如下：1．0.1g 左右的材料液氮磨碎放入1.5mL 的管子中，加入700μL 的抽体液（65℃预热）混匀，放入65℃水浴中，裂解40～60 分钟，期间温和混匀几次。
2．取出裂解好的DNA ，加入700μL 氯仿：异戊醇（24:1），猛烈混匀，离心（1000 r/min,10 分钟）。
3．取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入0.8-1 倍预冷异丙醇，缓慢混匀后，再猛烈混匀，使DNA 成团，-20℃放半小时以上。
4．将析出的DNA 离心，14000 r/min,10 分钟。
5．去掉上清，将沉淀用1mL 70% 乙醇清洗一次，离心干燥，溶于100μL TE 或水中，用时稀释10 倍，取2μL 作PCR（25μL 体系）。
1. DNA extraction : 500mL31.885g sorbitol6.05g tris PH8.22. Nuclei lysis buffer: 500mL100mL 1mol/L Tris PH7.5100mL 0.25 mol/L EDTA200mL 5 mol/L NaCl10g CTAB100mL ddH203. 5% sarkosyl 500mL25g N-lauroylsarcosine (N-月桂酰肌氨基钠盐)313 Genomic PCR引物P1/P2是根据HMW-GS基因的N-端部分编码区及其上游启动子部分的同源序列设计的,并在P2 引物的5’端引入BamHⅠ酶切位点。
能扩增HMW-GS 启动子1kb 左右的片段，引物由上海博亚合成。
P1：5'> GGAAGCTTAGTGA TGGCGTGAG <3'；P2：5'>TCGGATCCAGCGGCGGTGAGAG<3'50μL PCR 反应体系中含模板DNA100ng，P1/P2 10 pmol, TaqDNA 聚合酶2U（邓志勇博士惠赠），0.2mmol/L dNTPs, 5μL 的10×PCR 反应液(500mmol/L KCI,100mmol/L Tris-HCI,PH 8.3 ,15mmol/L MgCI 2)。
PCR 反应采用三段法，反应参数为：95℃预变性4min，以95℃变性45Sec，58℃退火45Sec, 72℃延伸1min 循环26 次，最后72℃延伸7min。
4.1.5 PCR 产物的克隆与序列测定PCR 产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，在紫外灯下切取目的片段，回收后连接到Takara 公司的克隆载体pMD18-T Vector 上，转化至感受态宿主菌JM109 中，在涂有Amp/X-gal/IPTG 的LB 平板上进行蓝/白斑筛选，再通过菌落PCR 和酶切初鉴定后，重组质粒命名为pMDH，由大连宝生物工程有限公司进行测序，并对测序结果进行比较分析。
具体操作过程如下：1. 连接反应体系采用10μL (16℃连接过夜)2×连接Buffer（含T4－DNA 连接酶）5 μLVector 1 μL目的片段4 μL2. 转化[131]⑴200μL 感受态细胞，冰上解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。
⑵加入10μL 连接液轻轻混匀，冰浴放置30min。
⑶42 ℃热激90 秒，冰浴5min。
⑷加入800μL LB 培养基，于37℃180 r/min 震荡培养1h。
⑸吸取50μL 细菌培养液涂布在预先涂有4μL IPTG(100mmol/L)和40μL X-gal(20mg/mL)的平板上，然后37 ℃过夜培养。
3. PCR 筛选用M13 Forward 和特异引物P2 对白斑进行菌落PCR 反应，根据扩增条带的有无和条带的大小来筛选插入目的片段及其插入方向。
4．质粒DNA 的提取提取经扩大培养经PCR 初步筛选的阳性菌落。
⑴菌液移入1.5mL 离心管，12 000r/min 离心30sec，倒去上清液；小麦胚乳特异性启动子的克隆及高分子量谷蛋白14 亚基基因的原核表达⑵加入100μL 预冷的溶液I [50mmol/L 葡萄糖，10mmol/L EDTA（pH8.0）,25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)]，用涡旋震荡器充分悬浮沉淀；⑶加入150μL 溶液II [0.2 mol/L NaOH,1% SDS （现配）]，快速颠倒温和混匀，室温放置3min；⑷加入150μL 预冷的溶液Ⅲ（3 mol/L K+，5 mol/L Ac-）温和混匀，冰浴3min；⑸12 000r/min 离心3min，转移400μL 上清液至另一1.5mL 离心管中；加入800μL 无水乙醇（2×上清液体积）到上清液中，混匀，室温放置3min, 12 000r/min 离心3min 使质粒DNA 沉淀；⑹弃尽上清，用200μL 的TE 溶解沉淀，之后加入200μL 冰预冷的LiCl 溶液（5 mol/L），冰浴5min 后12 000r/min 离心3min；⑺转移上清到另一离心管中，加入0.8 mL 无水乙醇，混匀后室温静置3 min，12000 r/min 离心3min，去掉上清后用1 mL 70%的乙醇洗涤沉淀，弃尽液体，用含有RNA 酶的TE 溶解质粒DNA 沉淀。
5．酶切鉴定提取阳性菌落质粒DNA，分别用EcoR I 和PstⅠ进行双酶切。
采用20μL 反应体系，其中质粒10μL，限制性内切酶各0.5μL，另加RNase（1 mg/mL）0.5μL，混匀，10 000r/min 离心20sec，37℃反应1.5h。
鉴定后的重组质粒由大连宝生物工程有限公司进行测序。
4小麦种子特异性瞬时表达载体构建第一步：克隆目的片段；BamHI+EcoRI 切pBI121 双元载体分离GUS+NOS第二步：在HMW-GS 启动子后插入GUS+NOSEcoRI5 启动子活性测定GUS 基因的瞬时表达2、转p1Ebxp一uidANoS小麦植株的获得小麦转化受体材料为Bobwhite(CIMMYT国际玉米和小麦改良中心)，取受粉后12一15天的小麦幼胚(直径约为1.Olnln)，诱导培养基上25℃暗培养1天，随即转移至高渗培养基上25oC暗处理4一6小时，将包裹有p1EbxP一uidANoS和pubiBar (p1Ebxp一UidANos:pubiBar(质量比)=1:1)的金粉颗粒或者包裹有puidAN。
S和pUbiBar(pUidANos:pUbiBar(质量比)=1:一)的金粉颗粒(对照)分别轰击小麦幼胚，分别继续在高渗培养基上25℃暗培养18一20小时。
然后转移至诱导培养基上恢复培养14天一16天，取生长状态良好的胚性愈伤转移至筛选培养上培养30天左右(25℃16hr/shr光照/黑暗)，其间更换一次培养基。
随后将分化正常的抗性苗转移至生根培养基上，约两周后将根系发育正常的幼苗转移至温室培养，即得到转入plEbxP一uidANoS和pubiBar的小麦植株(转plEbxP一uid胡05小麦植株)或转入pUidANos和pUbiBar的小麦植株(转puidANoS小麦植株，阴性对照)的T。
代植株。
各培养基组分如下所述:诱导培养基:MS基本培养基加2，4一D(Sigma.，美国)2.smg，蔗糖(北京益利精细化学品有限公司)309/L，琼脂9克/L，pH5.8。
高渗培养基:MS基本培养基，麦芽糖(北京益利精细化学品有限公司)150克/L，琼脂9克/L，pH5.8。
筛选培养基:含有smg/Lphosphinothricin(ppt，Duehefa，Netherland)的309/L蔗糖(北京益利精细化学品有限公司)，7克/L琼脂，pH5.8的MS基本培养基。
生根培养基:含有3mg/LpPt29/Lphytagel(Sigma，美国)，60克/L蔗糖(北京益利精细化学品有限公司)，pH5.8的MS基本培养基。
6 Gus 瞬时表达的检测将转化后的材料在28℃光照条件下培养16h 后，然后继续在26℃避光培养48h，按Jefferson 的方法对GUS 活性进行组织化学检测。
将愈伤组织浸泡于配制好的X一Gluc的溶液中37℃保温过夜，第二天将愈伤组织取出，依次用50%、70%、100%的酒精脱色。
最后用灭菌蒸馏水冲洗后观察并照像。
GUS 活性检测液的配制：100mmol/L 磷酸氢钠缓冲液pH7.0，500μmol/L K3Fe(CK)6，500μmol/L K4Fe(CK)6，0.5mg/mL X-G1uc，1.0mmol/L EDTA。