己烯雌酚人工抗原的合成及其抗体制备
抗原和抗体的制备)
。
二、组织材料的处理 组织材料的处理是获得良好免疫组织化学结果的前提，必需保证要检测的细胞或组织取材新鲜， 固定及时，形态保存完好，抗原物质的抗原性不丢失、不扩散和被破坏（下节 详述）。
三、免疫染色 可在细胞涂片或组织切片上进行免疫染色。一般程序是：①标记抗体与标本中抗原反应结合；② 用 PBS 洗去未结合的成分；③直接观察结果（免疫荧光直接法）；或显色后再用显微镜观察（免疫酶 直接法）。在此基础上发展出间接法，多层法，双标记法等各种方法，将在本书各有关章 节 内详 述。
发展的重要标志。近年来，分子杂交与免疫细胞化学的结合日益紧密，尤其是在杂交后信号的检测技术中 ，引入了免疫细胞化学的免疫放大和显色技术，已经形成了杂交免疫细胞化学或称原位杂交免疫细胞化学 （In situ hybridizationimmunocytochemistry），成为免疫细胞化学中又一新的分支。分子杂交与免疫细 胞化学的结合，形成了在细胞、亚细胞和分子水平同时检测基因及其表达产物的完整体系，把基因探针（ 基因工程）和单克隆抗体技术结合起来，成为当代生物科学和医学在分子水平研究和诊断的新兴技术。尤 其是近年来与 PCR 技术结合的原位 PCR 技术和原位免疫 PCR 技术敏感性很高。本书第十八至二十三章 对有关分子生物学基础理论、核酸分子探针制备、原位分子杂交技术、聚合酶链式反应（PCR）、核酸分 子杂交电镜技术、杂交与免疫细胞化学双标记技术、分子杂交的 FISH 技术和 PRINS 技术及其在染色体 制片的应用和分子杂交基因诊断的应用等方面，由有关专家分别作出了专章 叙述。
第二节 免疫细胞化学的有关技术概述 根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为免疫荧光细胞化学技术，免疫酶细胞化学技术，免 疫铁蛋白技术，免疫金-银细胞化学技术，亲和免疫细胞化学技术，免疫电子显微镜技术等。近些年来 ，核酸分子原位杂交技术采用生物素、地高辛等非放射性物质标记探针，和免疫细胞化学技术密切结 合，发展为杂交免疫细胞化学技术。不同的免疫细胞化学技术，各具有独特的试剂和方法，但其基本 技术方法是相似的，都包括抗休的制备，组织材料的处理、免疫染色、对照试验、显微镜观察等步骤 。还有双重和多重标记技术也有重要的用途。
己烯雌酚(DES)乙烯雌酚检测
己烯雌酚（DES）/乙烯雌酚检测
己烯雌酚（Diethylstilbestrol, DES），又称为乙烯雌酚、丙酸已烯雌酚，是人工合成的非甾体雌激素物质，主要用于雌激素低下症及激素平衡失调引起的功能性出血、闭经，还可用于死胎引产前，以提高子宫肌层对催产素的敏感性。
迪信泰检测平台采用高效液相色谱(HPLC)法，可高效、精准的检测己烯雌酚的含量变化。
对于常见雌性激素或以上雌性激素的同类物质，可配合标准物质进行检测，对于稀有的雌性激素，如提供标准样品，迪信泰检测平台可提供定制检测。
此外，我们还提供其他激素检测服务、动物激素检测服务，以满足您的不同需求。
样品制备
1）取100 mL样品；
2）盐酸调解pH值为2-3；
3）样品通过10 mL甲醇和10 mL去离子水活化的SPE柱进行萃取；
4）真空泵抽去SPE柱残留的水分；
5）10 mL二氯甲烷-甲醇(V/V=80/20)洗脱；
6）氮气吹干洗脱液；
7）甲醇溶解定容至1 mL；
8）用HPLC分析。
HPLC测定己烯雌酚样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）
2. 相关质谱参数（中英文）
3. 质谱图片
4. 原始数据
5. 己烯雌酚含量信息。
抗体药物工艺流程
抗体药物工艺流程抗体药物是一种利用人工合成或改造的抗体来治疗疾病的药物。
其制备过程主要包括抗体的选择、表达和纯化、特定药物结构的构建以及体内外活性评价等步骤。
以下将详细介绍抗体药物的工艺流程。
1.抗体选择抗体的选择是抗体药物制备的第一步，通常通过抗原呈现、高通量筛选和抗体亲和力评估等方法进行。
在这个步骤中，需要明确目标疾病的靶点，并找出可以与其结合的抗体。
2.抗体表达和纯化抗体的表达和纯化是制备抗体药物的重要步骤。
一般来说，可以使用多种系统对抗体进行表达，包括真核细胞（如CHO细胞）和革兰氏阳性或阴性细菌（如大肠杆菌）。
在抗体表达过程中，需要选择适当的表达载体、优化培养条件，并使用亲和色谱、离心和滤过等方法对抗体进行纯化。
3.亚类选择和改造为了增强抗体药物的效力和稳定性，通常需要对抗体的常规IgG结构进行改造。
其中一种主要的改造方式是选择合适的亚类，如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，以增强抗体的效力和稳定性。
4.抗体结构的构建抗体结构的构建包括引入特定的功能模块，如毒素链、放射性同位素或药物等，以实现抗体药物的特定治疗效果。
在这个步骤中，需要对抗体的结构进行合理的设计和工程改造。
5.体内外活性评价在抗体药物的制备过程中，需要对其在体内外的活性进行评价。
在体内评价中，可以通过小鼠模型或其他动物模型来研究抗体药物的生物学活性、药代动力学和药效学等指标。
在体外评价中，可以通过抗体结合实验、细胞毒性实验和酶联免疫吸附实验等方法来评估抗体的亲和力、特异性和潜在毒性等。
6.临床试验和生产经过前期的活性评价后，抗体药物进入临床试验阶段。
临床试验主要包括三个阶段，分别是I期、II期和III期临床试验。
在临床试验过程中，需要对药物的安全性、有效性和剂量响应进行评价。
当药物通过临床试验后，可以申请生产上市。
总结起来，抗体药物的制备过程主要包括抗体的选择、表达和纯化、亚类选择和改造、抗体结构的构建以及体内外活性评价等步骤。
抗体制备流程
抗体制备流程1. 引言抗体制备是生物医学研究领域中常用的实验技术之一。
通过制备特定的抗体，我们可以用于检测特定的蛋白质、细胞或其他分子，从而在研究中获得更加准确和可靠的结果。
本文将详细介绍抗体制备的流程，包括免疫原制备、动物免疫、抗体纯化等几个主要步骤。
2. 免疫原制备2.1 选择免疫原免疫原是指能够引起机体免疫系统产生抗体反应的物质。
在选择免疫原时，需要考虑以下几个因素：•目标蛋白质：免疫原应该是目标蛋白质或其片段，可以是纯化的蛋白质、合成的多肽或重组蛋白等。
•抗原性：免疫原应该具有足够的抗原性，能够激发免疫系统产生抗体反应。
•稳定性：免疫原应该具有足够的稳定性，可以在制备和储存过程中保持其完整性和活性。
2.2 免疫原制备制备免疫原的方法多种多样，常见的包括以下几种：1.纯化蛋白质：从细胞或组织中纯化目标蛋白质，获取单一纯度的免疫原。
2.合成多肽：根据目标蛋白质的氨基酸序列合成相应的多肽片段，作为免疫原使用。
3.重组蛋白：利用基因工程技术在表达系统中表达目标蛋白质的重组形式，作为免疫原。
3. 动物免疫3.1 动物选择选择合适的动物作为免疫宿主是成功制备抗体的重要因素。
常用的免疫动物包括小鼠、大鼠、兔子、鸡等。
选择免疫动物时需要考虑以下几点：•易于操作：动物应该易于操作和养护，能够适应实验室环境。
•免疫系统：动物的免疫系统应该对免疫原有良好的反应。
•抗原性：动物对免疫原应有较好的抗原性，能够产生高效的抗体反应。
3.2 免疫程序动物免疫的程序通常包括以下几个步骤：1.初次免疫：将制备好的免疫原与适当的佐剂混合，注射到动物体内。
注射的途径通常选择腹腔或皮下注射。
2.强化免疫：在初次免疫后，根据需要可以进行一定次数的强化免疫，以提高免疫效果。
3.血清采集：在免疫程度达到一定水平后，从动物体内采集血清，其中含有目标抗体。
4.抗体效价测定：通过合适的方法，测定血清中目标抗体的效价。
4. 抗体纯化4.1 抗体提取通过离心等方法，将血清中的抗体分离出来。
抗体制备流程
抗体制备流程一、背景介绍抗体是免疫系统产生的一种蛋白质，具有高度的特异性和亲和力，广泛应用于生命科学领域。
抗体制备是指从动物血清或单克隆细胞中提取纯化抗体的过程。
本文将介绍抗体制备的详细流程。
二、材料准备1. 动物：常用小鼠、大鼠、兔子等；2. 抗原：根据实验需要选择适当的抗原；3. 组织破碎液：可以使用高渗盐溶液、甘油等；4. 纯化柱：可以使用蛋白A/G，蛋白L等；5. 色谱柱：可以使用离子交换柱、大小分离柱等。
三、抗原制备1. 合成或提取目标分子作为抗原；2. 重组表达目标分子作为抗原；3. 从组织或细胞中提取目标分子作为抗原。
四、动物免疫1. 免疫前处理：（1）对动物进行基础检查，确保健康状态良好；（2）按照实验需要确定免疫计划，如免疫次数、免疫间隔等；（3）根据实验需要选择适当的免疫方式，如皮下注射、腹腔注射等。
2. 免疫过程：（1）将抗原与佐剂混合后注射到动物体内；（2）在免疫后的一定时间内采集血清；（3）根据实验需要重复进行免疫。
五、抗体检测1. 间接ELISA法：将抗原固定于微孔板上，加入动物血清进行反应，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测。
2. Western blotting法：将蛋白质分离并转移至膜上，然后加入动物血清进行反应，最后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测。
3. 免疫组化法：将组织切片或细胞涂片固定并处理后，加入动物血清进行反应，最后加入辣根过氧化物酶标记的二抗进行检测。
六、抗体纯化1. 亲和层析法：利用特异性结合亲和剂纯化目标抗体，如蛋白A/G、蛋白L等；2. 离子交换层析法：利用抗体表面带电性质与离子交换树脂上的离子进行吸附和洗脱；3. 大小分离层析法：利用抗体的分子量差异与分子筛或凝胶过滤树脂进行分离。
七、抗体保存1. 冷冻保存：将纯化后的抗体溶液加入甘油后冷冻保存在-20℃或-80℃；2. 溶液保存：将纯化后的抗体溶液加入保护剂后在4℃下保存。
八、总结以上就是抗体制备的详细流程，其中包括了材料准备、抗原制备、动物免疫、抗体检测、抗体纯化和抗体保存等步骤。
抗体制备标准操作规程(3篇)
第1篇一、目的为了规范抗体制备过程，确保抗体质量，特制定本操作规程。
二、适用范围适用于各类抗体制备，包括免疫原制备、免疫接种、抗体采集、抗体纯化等环节。
三、职责1. 抗体制备负责人：负责制定抗体制备方案，监督实施，确保抗体制备质量。
2. 研究员：负责免疫原制备、免疫接种、抗体采集等具体操作。
3. 技术员：负责抗体纯化、质量检测等具体操作。
四、标准操作程序1. 免疫原制备（1）选择合适的免疫原，如蛋白质、多肽、DNA等。
（2）将免疫原进行化学或生物合成，制备成适宜的免疫原形式。
（3）对免疫原进行纯化，去除杂质。
2. 免疫接种（1）选择合适的动物模型，如小鼠、大鼠、兔等。
（2）根据动物种类和免疫原特性，确定免疫接种方案，如免疫途径、免疫间隔、免疫次数等。
（3）按接种方案对动物进行免疫接种，注意观察动物反应，如体重、食欲、活动等。
3. 抗体采集（1）在免疫结束后，根据抗体产生时间，选择合适的抗体采集时间。
（2）采集抗体，如血清、腹水等，注意无菌操作。
（3）将采集到的抗体进行分离、过滤，去除杂质。
4. 抗体纯化（1）选择合适的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等。
（2）根据抗体特性和纯化方法，制备纯化柱或选择合适的纯化试剂。
（3）将抗体溶液过柱，收集洗脱液，进行抗体浓度测定。
5. 抗体质量检测（1）检测抗体效价，如ELISA、Western blot等。
（2）检测抗体特异性，如竞争ELISA、免疫印迹等。
（3）检测抗体稳定性，如冻融稳定性、pH稳定性等。
五、注意事项1. 操作过程中应严格遵循无菌操作原则，防止污染。
2. 抗体制备过程中，应密切关注动物反应，如体重、食欲、活动等，确保动物健康。
3. 抗体制备过程中，应做好记录，包括免疫原、免疫方案、抗体采集时间、纯化方法等。
4. 抗体制备完成后，应对抗体进行质量检测，确保抗体质量。
六、附则本规程自发布之日起实施，如有未尽事宜，由抗体制备负责人负责解释。
抗体制备流程
抗体制备流程抗体制备是一种用来生成特定抗体的实验方法，用于检测、治疗和研究各种疾病。
以下是一种通用的抗体制备流程，包括抗原选择、免疫动物的选择与处理、抗体的制备和纯化等步骤。
首先，我们需要选择合适的抗原。
抗原是导致免疫反应的物质，通常是一种蛋白质。
抗体的选择性依赖于抗原的选择性，因此我们需要选择具有高选择性且易于纯化的抗原。
接下来，我们需要选择合适的免疫动物。
常见的免疫动物包括小鼠、兔子和大鼠等。
选择免疫动物时，需要考虑抗原在动物体内的免疫原性、免疫系统的相似性以及免疫动物的体积等因素。
在选择好免疫动物后，我们需要对其进行处理。
通常情况下，我们会注射抗原到免疫动物体内，同时加入适当的免疫增强剂，以提高抗原的免疫原性。
接种后，我们需要在一定时间间隔内反复注射多次，以激发免疫反应。
在反复注射抗原后，我们需要等待一段时间，使得免疫系统产生足够多的抗体。
这个时间因免疫动物的类型和免疫原性而有所不同。
待免疫系统产生足够多的抗体后，我们需要将免疫动物进行牺牲，并从其体内获得免疫血清。
免疫血清是含有大量抗体的血液，在实验中可以用来检测和纯化抗体。
获得免疫血清后，我们需要对其进行抗体的制备和纯化。
首先，我们可以通过离心等方法去除血液中的红细胞等非细胞成分。
接下来，我们可以采用亲和层析和凝胶过滤等方法，将目标抗体从血液中纯化出来。
在纯化抗体后，我们可以对其进行鉴定和评估，以确保其质量和活性。
常用的鉴定方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）和Western blotting等。
最后，我们可以将纯化的抗体用于实验中。
抗体可以用于检测特定抗原的存在，也可以用于治疗疾病，比如单克隆抗体疗法。
总结起来，抗体制备流程包括抗原选择、免疫动物的选择与处理、抗体的制备和纯化等多个步骤。
这一流程需要耗费一定的时间和资源，但是通过这一流程我们可以获得高质量和高选择性的抗体，从而用于检测、治疗和研究各种疾病。
技术页面-小分子抗原制备
【百欧泰生物】小分子抗原制备：科研必备之选小分子抗原制备及偶联是将相对分子质量较小的抗原物质通过特定化学方法进行合成与连接的技术。
其优势在于能精准定制具有特定免疫原性的抗原，提高检测灵敏度和特异性。
在免疫诊断、疫苗研发、药物筛选等领域广泛应用，如用于早期疾病标志物检测试剂盒的开发。
但操作中需注意选择合适的偶联剂，严格控制反应条件，包括温度、pH 值和反应时间等，以确保偶联物的稳定性与活性，避免出现抗原失活或过度修饰等问题，从而保障实验及应用的准确性和可靠性。
小分子抗原制备：从原料到成品1.半抗原改造（氨基苯甲酸）对氨基苯甲酸（PABA）：作为半抗原，纯度需在 98%以上。
1.1 半抗原的活化准确称取20 mg对氨基苯甲酸（PABA），置于2 mL的离心管中，加入1 mL DMSO，充分振荡使其完全溶解，配制成20 mg/mL的PABA溶液。
分别称取10 mg EDC·HCl和6 mg NHS，加入到上述 PABA 溶液中，轻轻涡旋混匀。
将反应体系置于室温下，在磁力搅拌器上以300 - 500 rpm 的转速搅拌反应30分钟，使PABA上的羧基被活化，形成活泼酯中间体，便于与载体蛋白上的氨基发生反应。
1.2 与载体蛋白偶联在活化反应进行的同时，称取100 mg BSA 溶解在10 mL PBS 中，配制成10 mg/mL的BSA 溶液。
将活化后的PABA溶液缓慢滴加到BSA溶液中，滴加速度控制在1-2滴/秒，边滴加边搅拌，滴加完毕后，继续在室温下搅拌反应4小时，使PABA与BSA通过酰胺键共价结合，形成人工抗原。
1.3 偶联产物的纯化将反应后的溶液转移至透析袋中，用4℃的PBS作为透析液，在磁力搅拌下进行透析，透析时间为48小时，期间每隔6-8小时更换一次透析液，每次透析液的体积为反应液体积的10-20 倍，以彻底去除未反应的PABA、EDC·HCl、NHS等杂质。
北京百欧泰生物科技有限公司1.4 人工抗原的鉴定与定量可采用紫外分光光度计和SDS-PAGE进行鉴定和定量。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
己烯雌酚人工抗原的合成及其抗体制备陈德坤1,郑增忍2,曲志娜2,雷莉辉1,张佩君3 (11西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨凌712100;
21农业部动物检疫所,山东青岛266032;31陕西省教育学院生物系,陕西西安710003
)
摘要:以己烯雌酚(DES)、琥珀酸酐和牛血清白蛋白(BSA)等为主要原料,采用混合酸酐反应,首先合成己烯雌酚半琥
珀酸酯(DES2HS),经质谱分析鉴定后,再将DES2HS结合到BSA上,并用SDS2PAGE对DES2HS2BSA进行测定。以
DES2HS2BSA免疫家兔6次,用琼脂双扩散试验测定抗体。试验结果表明,高分辨质谱测得合成的DES2HS分子量为368;BSA2HS2DES的SDS2PAGE图谱经相关软件分析表明,单个BSA上结合有32个DES2HS;琼脂扩散试验结果证实,免疫兔血清中含有抗DES的抗体。本试验为下一步研制DES残留免疫检测试剂盒及抗DES单抗奠定了基础。关键词:己烯雌酚;琥珀酸酐;牛血清白蛋白;混合酸酐反应;抗DES抗体中图分类号:S852143 文献标识码:A 文章编号:100524545(2004)0420364203
己烯雌酚(DES)是一种人工合成的雌激素,在医学临床上普遍用于妇科病的治疗,而且还被用作动物饲料添加剂,以促进动物生长,提高产量[1,2]。国内外大量研究表明[3],己烯雌酚可以破坏机体遗传物质,导致基因突变而引发机体肿瘤。因此,国内外所颁布的食品安全法均规定,动物性产品及食品中不得检出己烯雌酚。目前,国外已经建立了成熟的己烯雌酚残留免疫检测方法,并有相关的诊断试剂盒。目前,国内检测己烯雌酚主要采用高效液相色谱(HPLC)法或气相色谱2质谱(GC2MS)法。为开发研制具有我国自主知识产权的药物残留(包括己烯雌酚)免疫检测试剂盒,达到能够对批量样品进行快速、准确检测的目的,特进行了本研究。1 材料与方法111 主要试剂和仪器 己烯雌酚,纯度99%,美国Sigma公司产品;琥珀酸酐,上海化学试剂公司;氯甲酸异丁酯,CP,上海飞详化工厂;三正丁胺,CP,北京化工厂进口分装;牛血清白蛋白(BSA),华美生物工程公司;其他试剂均为AR级。
ZAB2HS仪器、FT2MSAPXX仪器、凝胶成像系统(UVPBioimagingSystem)及其分析软件(labworks410ImageAc2quisitionandAnalysisSoftware)。
112 试验动物 成年健康家兔,体质量215kg左右,购自青岛医学院试验动物中心。113 己烯雌酚半琥珀酸酯(DES-HS)的合成 DES2HS的合成路线如下:
HOCC2H6CC2H6OH+ OCOCH2COCH2HOCC2H6CC2H6OCOCH2CH
2COOH
收稿日期:2003212222
作者简介:陈德坤(19642),男,副教授,博士。
将70mgDES溶于5mL吡啶中,搅拌至完全溶解,再加入琥珀酸酐25mg,置于通风橱中,在室温下搅拌48h。反应完成后,将反应液移入30mL冰蒸馏水与5mL浓盐酸组成的混合液中静置过夜,抽滤析出的沉淀,并以蒸馏水洗至pH515左右,真空干燥,得粗产品。将所得粗产品加入丙酮溶解后,拌入等量的硅胶,室温下晾干,用200～300目硅胶柱层析分离,用TLC监测,收集Rf=0109(展开剂,石油醚∶丙酮=3∶1)的点合并,常温下干燥,即得DES2HS纯品。对该物质进行高分辨质谱测定。114 DES-HS-BSA的合成 将DES2HS2BSA50mg溶于二氧六环中,置4℃下10min,然后加入20ΛL三正丁胺,混匀,再加入15ΛL氯甲酸异丁酯,4℃条件下搅拌30min,此为甲液。另取150mgBSA溶于20mL的70%二氧六环水溶液中,此为乙液。将甲液与乙液合并,4℃下搅拌过夜,将反应液流水透析2h,然后换成平衡盐溶液继续透析48h。浓缩透析液,冷冻干燥。用5%的积层胶和10%的分离胶对DES2HS2BSA进行SDS2PAGE鉴定,通过紫外凝胶成像系统分析软件分析得出DES2HS2BSA的分子量,以此为依据推算单个BSA上结合DES2HS的数目。115 DES-HS-OVA(卵清蛋白)的合成 参照方法114进行。116 动物免疫试验 用无菌生理盐水溶解DES2HS2BSA
后,与等量的弗氏完全佐剂混合,在混合振荡器上充分振荡,
使其完全乳化,DES2HS2BSA的最终含量为1gL。在家兔脊椎两侧交叉选取6～8个点,做皮下注射免疫,免疫剂量为2
mL只。20～25d,进行第2次免疫,免疫途径及免疫剂量同第1次,佐剂为弗氏不完全佐剂。以后,每隔15d加强免疫1
次,免疫剂量均为上次的2倍,免疫途径为皮下注射,免疫时不使用弗氏佐剂。免疫共进行6次,最后1次免疫后10d,经心脏无菌采血,分离免疫血清。117 抗DES抗体的测定 按照常规的琼脂双扩散试验进行。在1%琼脂糖凝胶上打出梅花孔,挑去孔中琼脂块,用015%融化琼脂封底。向中央孔加入分离的免疫兔血清,周围孔分别加DES2HS2BSA、OVA、DES2HS2OVA,在37℃感作24～48h后,将琼脂糖凝胶用生理盐水漂洗24h,用011%考马斯亮蓝染液染色,经脱色后,对琼扩试验结果照相。
463中国兽医学报 2004年7月 第24卷 第4期 ChinJVetSci July2004 Vol.24 No.42 结果2.1 DES-HS的高分辨质谱测定结果 FABMS测定结果为,M
+368(63)(M+Na)+
391(17),351(M2OH)(16),307
(M2OH2CO2)(6)(图1)。HRMS分析,C22H24O5+NH4计算值
为38611962,实测值为38611959,误差017ppm,在10ppm
范围内。结果表明,新合成的DES2HS的分子量为386。
图1 DES2HS的质谱测定结果2.2 DES-HS-BSA的SDS-PAGE结果 为进一步证实BSA
分子上确实挂载了DES半抗原,并计算出每个BSA分子上所结合的半抗原数目,对DES2HS2BSA进行了SDS2PAGE
(图2)。电泳图谱显示出BSA的泳动速度大于DES2HS2
BSA,说明DES2HS2BSA的分子量大于BSA,证明DES2HS已经结合在BSA上。通过紫外凝胶成像系统分析软件分析得出,DES2HS2BSA的相对分子质量为77950,BSA的相对分子质量为66200,每个BSA分子上结合的半抗原数目为(77950-66200)÷368≈32。
图2 DES2HS2BSA的SDS2PAGE结果 11Marker;21BSA标准品;31DES2HS2BSA
2.3 抗DES-HS抗体的测定结果 以DES2HS2BSA免疫家兔,家兔不仅产生针对DES2HS的抗体,还产生针对BSA表面功能抗原决定簇的抗体,这是琼扩试验中免疫血清孔和DES2HS2BSA孔之间形成的沉淀线比较粗的原因(图3)。由于BSA和OVA无共同的抗原性[4],因此OVA孔和中央孔
之间无沉淀线形成。DES2HS2OVA孔和中央孔之间形成1条细而清晰的沉淀线,并且该沉淀线与免疫血清孔和DES2HS2BSA孔之间形成的沉淀线完全融合,说明免疫血清中确实含有抗DES2HS的抗体。
图3 抗DES抗体的琼扩试验结果 中央孔1免疫血清;1,3孔.
DES2HS2BSA;4,5孔.DES2HS2OVA;2,6孔.OVA
3 讨论 小分子药物残留是影响动物性食品安全的关键因素之一。对这类小分子残留的常规检测方法主要有液相色谱法、气相色谱法等。这类方法灵敏度高、准确,但比较耗时,且需要的仪器昂贵,难以进行大批量样品的检测。为满足实践中批量样品残留检测的需要,近年来相继研制出了多种用于小分子药物残留检测的免疫试剂盒,如盐酸克伦特罗、氯霉素等免疫检测试剂盒。国内尚未见己烯雌酚残留免疫检测试剂盒研制的报道。本研究制备出的抗己烯雌酚抗体,为下一步研制己烯雌酚残留免疫检测试剂盒奠定了基础。半抗原本身无免疫原性,只有当其与载体结合后,才能够获得免疫原性。对于没有氨基或羧基基团的半抗原,必须进行适当的化学修饰,在其上加载1个含有氨基或羧基的基团,才可以将其连接到载体上。己烯雌酚便属于此类半抗原。对己烯雌酚进行化学修饰应当尽可能不影响己烯雌酚的结构和构型,否则免疫动物制备出的抗体可能与己烯雌酚本身的亲和力较差,或与其他物质发生交叉反应的几率较高。考虑到己烯雌酚本身属于小分子,所以在加载功能性羧基基团时,我们使用的是丁二酸酐,只与己烯雌酚一侧的酚羟基反应,形成己烯雌酚半琥珀酸。这样,不仅最大限度地减少了对己烯雌酚本身结构和构型的影响,而且形成的己烯雌酚半琥珀酸有一个较长的“臂”,与载体结合后有利于淋巴细胞的免疫识别。据报道[5],当1个载体结合25～35个半抗原分子时,免疫动物相
对容易产生抗体。本试验以含有32个DES的BSA2HS2DES
免疫家兔,用琼脂双扩散试验进行的特异性抗体检测也证实了这一点。Rombauts等[6]报道,DES也能够与Χ2乙基溴化丁酸盐
反应,产物为DES2Χ2乙基溴化丁酸。他们通过Χ2乙基溴化丁酸盐与己烯雌酚一侧的酚羟基发生化学反应,在己烯雌酚上加上一个“臂”长为4个碳原子的带有羧基的基团,从而使经过化学修饰的己烯雌酚能够与载体结合。但是他们制备的经过化学修饰的己烯雌酚极不稳定,且难以提纯。本试验制备的DES2HS稳定性较强,也能够提纯,这不仅有利于对DES2HS进行分析鉴定,同时对于下一步将DES2HS顺利地结合到BSA上十分重要。本研究制备抗己烯雌酚抗体,不仅为建立己烯雌酚残留的免疫学检测方法打下了良好基础,也为进一步研制抗己烯
563中国兽医学报 2004年7月 第24卷 第4期 ChinJVetSci July2004 Vol.24 No.4