银屑病患者皮损间充质干细胞同源异型盒B族基因表达情况的研究

中国药物与临床２０１５年１１月第１５卷第１１期Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｒｅｍｅｄｉｅｓ＆Ｃｌｉｎｉｃｓ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２０１５，Ｖｏ１．１５，Ｎｏ．１１　表１不同组别ＭＶＤ和ＨＳＰ表达的比较（　蜘）　

图２诱导３Ｏ周时小鼠肿瘤组织中的微血管密度　免疫组织化学染色×１０ｏ　３讨　论　本研究通过ＢＢＮ加Ｎａ—ＡｓＡ两步法给药，成功复制出　Ｃ５７ＢＬ／６小鼠膀胱癌模型…。诱导至第５周，可见小鼠膀胱黏　膜明显增生，此阶段ＨＳＰ７０有一定的表达，但ＭＶＤ增加不　明显，提示ＢＢＮ诱导早期就有ＨＳＰ７０基因开始活动（此时细　胞处于化学应激状态）。１４周时，膀胱黏膜有结节样增生，伴　分化不良，偶见原位癌形成，毛细血管密度明显增多，ＨＳＰ７０　的表达显著增高。２２周时，膀胱黏膜出现原位癌和浸润癌变　化，毛细血管密度显著增加，ＨＳＰ７０的表达进一步提高。诱导　至３０周时，毛细血管密度、ＨＳＰＴ０的表达与２２周相比无明　显差别。　ＨＳＰ７０的表达有赖于ＨＳＰ７０基因的转录活性［２］。ＨＳＰ７０　基因上游热休克元件（ＨＳＥ），位于ＨＳＰ７０基因ＤＮＡ　５＇－转录　起始点上游４４～４６位处。热休克因子（ＨＳＦ）是能与ＨＳＥ特异　

・１５６７・　结合的蛋白质，为ＨＳＰ７０基因的反式调控因子，控制ＨＳＰ７０　基因的转录。细胞暴露于化学致癌物等应激源后，ＨＳＦ被激　活形成三聚体，与ＨＳＥ有高度的亲和力，转入细胞核。人和　小鼠存在２种ＨＳＦ，ＨＳＦ１和ＨＳＦ２，ＨＳＦ１可以被热、氧、化学　和生理应激等激活。ＨＳＰ７０对ＨＳＦ存在负反馈调节，细胞内　ＨＳＰ７０的水平可以影响细胞再受热时ＨＳＰ７０的表达。说明　ＨＳＰ７０本身对ＨＳＰ７０的表达有反馈调节功能［　。致癌物不仅　诱导细胞中的ＨＳＰＴ０　ｍＲＮＡ合成增加，且降低ＨＳＰ７０　ｍＲＮＡ　的降解速度。结果细胞内的ＨＳＰＴ０　ｍＲＮＡ浓度迅速增加。诱　导早期由于ＨＳＰ７０基因激活使ＨＳＰ７０有一定程度的表达，　随着该蛋白在细胞中的积累而形成。负反馈机制使诱导后期　肿瘤细胞的ＨＳＰ７０表达量不再增多　本研究提示，ＨＳＰ７０与肿瘤的ＭＶＤ呈正相关。有报道表　明，人类精原细胞瘤在缺氧时，ＨＳＰ７０和血管内皮生长因子　（ＶＥＧＦ）的表达同时上调＿４］，ＶＥＧＦ可以诱导缺血的组织过度　表达ＨＳＰ７０，说明ＨＳＰ７０与血管的形成存在某些联系，但它　们之间的相互作用机制有待进一步深入研究。本研究结果为　揭示膀胱癌发病机制奠定了一定的实验基础。　参考文献　［１］Ｔａｋａｑｉ　Ｈ，Ｓｈｉｂｕｔａｎｉ　Ｍ，Ｕｎｅｙａｍａ　Ｃ，ｅｔ　ａ１．Ｌｉｍｉｔｅｄ　ｔｕｍｏｒ－ｉｎｉｔｉａｔ—　ｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｙｌ　ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ　ｂｙ　ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｓｏｄｉ—　ａｍ　Ｌ－ａｓｃｏｒｂａｔｅ　ｉｎ　ａ　ｒａｔ　ｔｗｏ—ｓｔａｇｅ　ｕｒｉｎａｒｙ　ｂｌａｄｄｅｒ　ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｍｏｄｅｌ［Ｊ］．Ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔｔ，２００５，２１９（２）：１４７—１５３．　［２］Ｌｉ　Ｑ，Ｆｅｌｄｍａｎ　ＲＡ，Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ　ＶＭ，ｅｔ　ａ１．Ｈｄｌ　ｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ５３　ｔｕｍｏｒ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ［Ｊ］．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，　２００８，ｌＯ（１０）：１１３８—１１４５．　［３］Ｊｏｏ　Ｍ，Ｃｈｉ　ＪＧ，Ｌｅｅ　Ｈ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ　ＨＳＰ７０　ａｎｄ　ＨＳＰ２７　ｉｎ　ｈｅｐ．　ａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｊ　Ｋｏｒｅａ　Ｍｅｄ　Ｓｃｉ，２００５，２０（５）：８２９．　８３４．　［４］Ｆｕｊｉｉ　Ｔ，Ｏｔｓｕｋｉ　Ｔ，Ｍｏｒｉｙａ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｈｙｐｏｘｉａ　ｏｎ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｍｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｏｎｃｏｌ，２００２，２０：９５５．９６２．　（收稿日期：２０１５．０５．０８）　

银屑病患者皮损间充质干细胞同源异型盒Ｂ族基因　表达情况的研究　

侯瑞霞贾彦如张开明　银屑病是一种以Ｔ细胞为主介导的、多种免疫细胞、炎　症因子共同参与的慢性炎症性皮肤病［　。虽然其发病机制目　

ＤＯＩ：１０．１１６５５／ｚｇｙｗｙｌｃ２０１５．１１．０１１　基金项目：山西省自然科学基金（２０１２０１　１０４５．２）　作者单位：０３０００９太原市中心医院皮肤科（侯瑞霞、张开明）；山　西省晋中市妇幼保健院皮肤科（贾彦如）　

前尚未完全明确，但其主要发病特点已得到公认。间充质干　细胞（ＭＳＣｓ）是由中胚层分化而来的一类具有高度增殖、自我　更新及多向分化潜能的成体干细胞。研究表明，ＭＳＣｓ可对机　体的免疫反应产生负向调节作用［２－６］．此外ＭＳＣｓ尚可通过诱　导血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）等的表达促进血管生成　７Ｊ：而炎　症细胞的异常活化、浸润及真皮血管增生扩张正是银屑病皮　・１５６８・　中国药物与临床２０１５年ｌ１月第ｌ５卷第ｌ１期Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｒｅｍｅｄｉｅｓ＆Ｃｌｉｎｉｃｓ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２０１５，Ｖｏ１．１５，Ｎｍ１１　损处的主要病理特征。因此，我们重点关注银屑病患者真皮　ＭＳＣｓ是否参与了本病的发生及转归过程。在前期基因芯片　研究中我们发现，转录因子同源异型盒（ＨＯＸ）Ｂ基因家族的　多个成员在患者皮损ＭＳＣｓ可能存在异常表达，为进一步明　确这些基因在银屑病ＭＳＣｓ的表达情况，本研究采用实时荧　光定量聚合酶链反应（ｒｅａ１．ｔｉｍｅ　ＰＣＲ）法对患者和健康对照　ＭＳＣｓ部分ＨＯＸＢ家族成员的ｍＲＮＡ表达进行了研究。　１对象与方法　１．１研究对象　１２例寻常型银屑病患者，其中男性７例。女性５例，年龄　１５—５７岁，平均（３７＋１６）岁，均为我院皮肤科门诊经临床及病　理检查确诊，并排除其他慢性炎症性疾病以及自身免疫性疾　病。就诊前１个月未使用过糖皮质激素、生物制剂及免疫抑　制剂等。对照组１２例，其中男性６例，女性６例，年龄２１～４５　岁，平均（３６±８）岁，来自门诊整形手术多余皮肤。所有样本取　材前均征得本人同意，并签署知情同意书。本研究已通过太　原市中心医院伦理委员会批准同意。　１．２方法　１．２．１皮肤ＭＳＣｓ的分离培养　参照实验室前期建立的方法　，无菌条件下将皮肤组织　分割成约１　ｍｍ］的小块。０．２５％Ｄｉｓｐａｓｅ酶消化分离真表皮，　收集真皮部分加入含有１０％胎牛血清（ＦＢＳ）的达氏修正依氏　培养基（ＤＭＥＭ）￣１２培养基终止消化，进一步将组织块切　碎，反复吹打组织使细胞分离后用筛网过滤，将滤过液离心　弃上清，沉淀中加入含３％～５％ＦＢＳ、Ｂ２７添加物１０￣ｌ／ｍｌ及　青霉素１００　Ｕ／ｍｌ、链霉素１００　ｐ￣ｇ／ｍｌ的ＤＭＥＭ￣１２培养基重　悬细胞，以１．０ｘｌ０ｓ个／ｃｍ２密度接种于Ｔ２５培养瓶内，置３７　℃，体积分数为５％ＣＯ　饱和湿度培养箱中孵育。７２　ｈ后弃去　悬浮细胞，将贴壁细胞继续培养，每３～４　ｄ半量换液１次，细　胞生长至８０％左右融合时采用限制稀释法进行传代。　１．２．２培养细胞的鉴定　１．２．２．１表型鉴定：流式细胞术测定收获细胞的ＣＤ２９、　ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ３４、ＣＤ４５及人类白细胞抗原　（ＨＬＡ）．ＤＲ表达。　１．２．２．２定向诱导分化（参照前期建立的方法进行　）：成脂　诱导：将细胞以３￣１０４／ｍｌ密度接种于２４孔板，细胞达９０％融　合时加入成脂诱导培养液Ａ（１０　ｔＬｇ／ｍ１人胰岛素、１　Ｉ．Ｌｍｏｌ／Ｌ　地塞米松、０．２　ｍｍｏ１］Ｌ吲哚美辛、０．５　ｍｍｏ１］Ｌ　３－异丁基一１一甲基　黄嘌呤（ＩＢＭＸ）、１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基）培养３　ｄ，吸弃成　脂诱导培养液Ａ，换用成脂诱导培养液Ｂ（１０　ｐ．ｇ／ｍ１人胰岛　素、１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基）培养２４　ｈ，如上完成３～５个连　续循环。诱导结束后用油红Ｏ染色。　成骨诱导：将细胞以３ｘｌＯ４／ｍｌ密度接种于２４孔板，细胞　达７０％融合后，加入成骨诱导培养液（０．１　ｐ￣ｍｏｌ／Ｌ地塞米松、　５０　Ｉｘｍｏｌ／Ｌ　Ｌ－抗坏血酸、１０　ｍｍｏ１］Ｌ　Ｂ一甘油磷酸钠、ＩＯ％ＦＢＳ的　ＤＭＥＭ培养基）诱导细胞，每３　ｄ换液。诱导２１　ｄ后用茜素红　Ｓ染色。　１．２．３　Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　前期我们曾采用表达谱基因芯片对银屑病患者的皮肤　ＭＳＣｓ基因表达模式进行初步分析［７３，发现转录因子ＨＯＸＢ　家族中有７个成员在皮损ＭＳＣｓ表达上调，为验证芯片结果　的准确性，以进一步明确ＨＯＸＢ基因在银屑病真皮ＭＳＣｓ的　表达情况，本研究选取其中差异倍数＞５倍的６个进行Ｒｅａｌ—　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ验证，引物序列及扩增产物信息见表１。　Ｔｒｉｚｏｌ法提取总ＲＮＡ，反转录试剂盒反转录为ｃＤＮＡ．２０　ｌ扩增体系内含ｃＤＮＡ　２｝ｘｌ、２ｘ　ＳＹＢＲ　Ｐｒｅｍｉｘ　ＥＸ　Ｔａｑ　１Ｉ缓冲　液１０　ｔｘｌ、Ｒｏｘ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ荧光染料０．４｝ｘｌ、上下游引物各０．８　

、无ＲＮＡ酶水补足总体积，扩增条件为９５℃，１０　ｍｉｎ；４０　个ＰＣＲ循环（９５　ｏＣ，１０　Ｓ；６０℃，６０　Ｓ）。扩增结束后按０．２％／ｓ　从６０　ｑｃ缓慢加热到９９℃以建立ＰＣＲ产物的熔解曲线。　以所有样品ｃＤＮＡ混合后以１：１０梯度稀释进行ＰＣＲ并　绘制标准曲线．分别读取各样品的目的基因和管家基因甘油　醛三磷酸脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）的浓度值，并以目的基因浓度值除　以相对应管家基因的浓度值获得该样品该基因的相对含　量。　１．３统计学处理　采用ＳＰＳＳ　１３．０软件进行统计学分析，数据采用　十ｊ方　式表示，２组间比较采用ｔ检验，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意　义。　２结　果　２．１皮肤间充质干细胞的培养及鉴定：倒置显微镜下，培养　细胞在接种２４　ｈ后大量贴壁并伸展，随着培养时间延长，贴　壁细胞数量增多。７～１０　ｄ明显增大并且分裂增殖，部分区域　形成小细胞集落。贴壁细胞呈梭形成纤维细胞状形态，胞体　膨大，有长短不一、大小不均的胞质突起，且互相连接，１４　ｄ　左右细胞铺满培养板达融合状态。流式细胞仪检测显示，　９０％以上ＤＭＳＣｓ表达ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ１０５，而ＣＤ３４、ＣＤ４５　及ＨＩ』Ａ．ＤＲ表达阴性。经成骨和成脂诱导，２组细胞均可被　诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。　２．２部分ＨＯＸＢ基因表达水平：以ＧＡＰＤＨ为内参，采用标　准曲线法相对定量检测ＨＯＸＢ２、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ６、　ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８的表达，结果见表２，与芯片结果一致，所检　测基因在患者组表达均明显高于对照组（２．２３￣２４．２７倍），经ｔ　检验，差异均有统计学意义。　３讨　论　同源异型盒基因是一类进化上高度保守的基因，广泛表　达于酵母、果蝇以及哺乳动物的真核细胞中，其主要作用是　作为转录因子调控生物体细胞分化和胚胎生长发育。目前已　经鉴定出的人ＨＯＸ基因家族共有３９个成员，根据其染色体　分布位置，分为ＨＯＸＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ四个基因群集，分别位于人类　第７号、１７号、１２号与２号染色体上［　。作为细胞生长增殖的　主要调控基因，ＨＯＸ基因的异常表达往往与肿瘤的发生发展　相关：如在恶性胶质瘤患者存在ＨＯＸＡ１０基因低甲基化而高　表达＿ｌ０］：ＨＯＸＡ５可通过抑制血管生成相关基因的表达而发