细菌脂肪酶的结构和功能研究进展
酶的工程改造与应用研究进展
酶的工程改造与应用研究进展酶作为生物体内的催化剂，在生命活动中起着至关重要的作用。
随着科学技术的不断发展，酶的工程改造成为了现代生物技术领域的一个重要研究方向，并且在多个领域取得了显著的应用成果。
酶的工程改造旨在通过各种技术手段对天然酶的结构和功能进行修饰和优化，以满足不同的应用需求。
其中，蛋白质工程技术是酶工程改造的核心手段之一。
通过定点突变、基因重组等方法，可以有针对性地改变酶的氨基酸序列，从而影响其催化活性、稳定性、底物特异性等特性。
在酶的工程改造中，理性设计和非理性设计是两种常见的策略。
理性设计基于对酶的结构和催化机制的深入了解，通过计算机模拟和分析，预测可能的关键位点，然后进行有目的的改造。
例如，对于一个催化特定反应的酶，如果已知其活性中心的关键氨基酸残基，就可以对这些残基进行替换或修饰，以提高酶的催化效率。
非理性设计则是通过随机突变、基因重组等方法构建大量的酶突变体库，然后通过高通量筛选技术从中筛选出具有优良性能的突变体。
这种方法虽然具有一定的盲目性，但有时能够发现意想不到的改造效果。
酶的稳定性是其在工业应用中的一个关键因素。
通过工程改造，可以增强酶的热稳定性、酸碱稳定性和抗蛋白酶降解的能力。
例如，在一些工业生产过程中，需要在高温条件下进行反应，如果酶的热稳定性不足，就会导致酶的失活和反应效率的降低。
通过对酶的结构进行分析，引入一些稳定的化学键、增加疏水相互作用或者改善蛋白质的折叠方式，都可以有效地提高酶的热稳定性。
底物特异性的改造也是酶工程的一个重要方向。
通过改变酶的活性中心的结构和形状，可以使酶对不同的底物具有更高的选择性和亲和力。
这在生物制药、精细化工等领域具有重要的应用价值。
例如，通过改造酶的底物特异性，可以实现对特定药物分子的高效合成，提高药物的纯度和产率。
酶的催化活性是衡量其性能的一个重要指标。
工程改造可以通过优化酶的活性中心、改善底物结合口袋的形状和大小、增强酶与底物之间的相互作用等方式来提高酶的催化活性。
开题报告 脂肪酶的固定化研究
毕业论文开题报告一．选题背景和意义一．选题背景（1）脂肪酶的应用脂肪酶是一类特殊的酰基水解酶，它能在油水界面上催化酯水解和醇解、酯合成、酯交换、内酯合成、多肽合成、高聚物合成及立体异构体拆分等有机合成反应，是目前被重点研究的酯催化剂。
脂肪酶也是一种重要的工业酶类，应用于油脂水解、食品风味和香味的改进、医疗医药、皮革绢纺脱脂等优质化工和有机合成工业中。
脂肪酶催化的反应具有条件温和、耗能低、原料要求低、成品质量高等优点，尤其是1，3一专一性脂肪酶，可用于特殊脂肪酸、单甘酯的合成及立体选择性化学合成和分解，具有巨大的应用潜力。
随着人们生活水平的提高，在食品、牛奶、香水、化妆品和医药中添加天然成分的产品越来越受消费者青睐。
由天然底物生物合成的化合物被认定为天然产物，而同样的原料用化学法生产的产物则不受欢迎。
因此，天然成分在今后将会具有很大的需求，这使生物催化剂极具吸引力，所以说，脂肪酶在油脂、食品、医药、化妆品等领域具有光明的应用前景。
（2）应用中出现的问题在利用脂肪酶催化反应进行工业化生成遇到了一些问题，归纳起来主要有以下几个方面：1)酶的分离困难，反应结束后难以从反应液中回收尚未变性的脂肪酶加以重复利用，难以实现过程的连续化。
2)酶在非水溶液中不溶解，反应过程中容易结块，大大降低了酶的利用率。
3)脂肪酶催化反应的底物油脂不溶于水，因而必须加入合适的溶剂或乳化剂使酶分子与底物分子紧密接触。
这样易使产品被残余酶活污染，不易储存，必须进行后处理。
4)对单级反应器，脂肪酶的使用寿命受反应器空时的制约，使脂肪酶的部分潜在酶活受到损失。
5)脂肪酶价格昂贵，使用一次就废弃，对酶的利用很不经济，成本太高。
二．选题意义正是由于游离脂肪酶在催化反应中存在缺点，因此难以实现工业化应用。
为此，许多研究者展开了对脂肪酶进行固定化的研究，寻找解决脂肪酶的工业化应用问题。
同时，固定化技术一直也是学术界和工业界的接触点和共同热点。
脂肪酶酶解奶油制备天然香原料
脂肪酶酶解奶油制备天然香原料香精香料被广泛用于食品添加剂、化妆品、饲料等方面, 其需求量也逐年呈大幅度增加趋势。
根据BBC Research公司发布的全球香精香料市场报告预测，2011年将达78亿美元。
世界各国所用的香精香料也有差距,美国的食用香料种类约为2000余种，欧盟的食用香料大约有3000余种，中国批准使用的食用香料大约有1500多种。
随着人们生活质量的提高，消费者要求天然香料的愿望日益增加，并希望获得品质和性能更好的香料产品。
奶味香精是食品工业中应用最广泛的香精之一，酶解乳脂是食品工业中重要的一种原料，目前应用广泛且具有很大的应用潜力，如作为添加剂应用于焙烤食品(面包、蛋糕、曲奇等)、谷物食品(薄饼)、糖果(巧克力产品、太妃糖)、乳制品(咖啡伴侣、糖霜、干酪、黄油)以及其他一些产品(调味品和点心)、乳制品（发酵酸奶、调味奶）等。
1 天然香料根据美国联邦法典规定，天然香料指“来源于天然物质的芳香油类、浸提香精油、香料或净油、蛋白水解物、馏出液以及食品通过烘焙、加热或酶作用而产生的含有香料的物质，其在食品中的主要功能是调香而非营养作用。
这些天然物质指香辛料、果汁、蔬菜或菜汁、食用酵母、草药、树木的根、茎、叶、芽或类似的植物材料、肉类、海产类、禽蓄、蛋类、奶制品或发酵产品”。
生物转化法生产香料正好可以满足这些要求，这些制备香精香料的生物方法大致可分为以下三类: 一、生物催化法合成；二、借助微生物细胞发酵；三、通过植物细胞或者组织提取。
生物催化法是指采用生物催化剂，即酶作用于天然物质，通过合成或分解反应而获得天然香料的方法。
生物催化法有许多优点。
首先，该法生产的香料是全天然的；其次，采用的催化剂酶可在温和的反应条件常温、常压和正常值范围下进行，且催化效率相当高，具有很强的立体专一性和区域、对应体选择性；第三，香料生成过程中的副产物少，易于分离纯化，而且，即使有副产物，也是天然无害的；第四，生物催化法能生产品种多样的香料，几乎所有的细胞成分都能通过分解和合成反应产生香料物质。
脂肪酶特性与应用
饲料研究FEED RESEARCH NO .6,20115脂肪酶特性与应用陈倩婷广州博仕奥集团饲料资源不足一直是我国养殖业面临的一个大问题，在耕地和水资源严重紧缺的情况下，粮食产量很难提高。
我国动物生产中饲料转化率低，猪、鸡和奶牛等的饲料转化率均比国际先进水平低0.3 %~0.6 %，使饲料资源不足的问题更加严峻。
饲料用酶制剂的开发和应用极大的缓解了饲料资源的不足，酶制剂在饲料工业中的有效应用使得饲料工业和养殖业安全、高效、环保和可持续发展成为可能。
目前研究较多的饲用酶制剂有蛋白酶、甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶及植酸酶等。
脂肪酶也是一种重要的酶制剂，它能够水解脂肪（三脂酰甘油或三酰甘油）为一酰甘油、二酰甘油和游离脂肪酸，最终产物是甘油和脂肪酸。
产物脂肪酸为动物体生长和繁殖提供能量，部分中链脂肪酸能抑制肠道有害微生物，改善肠道菌落环境，从而促进消化，起到类似抗生素的作用，脂肪酶在常温常压下反应，反应条件温和，转化率高，具有优良的立体选择性，不易产生副产物，避免因化学催化法而带来的有害物质，不会造成环境污染，因此，在食品、皮革、医药、饲料和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应用。
1 脂肪酶的特性1.1 脂肪酶的来源脂肪酶按其来源主要分为3类：1）动物源性脂肪酶，如：猪和牛等胰脂肪酶提取物；2）植物源脂肪酶，如：蓖麻籽和油菜等；3）微生物源性脂肪酶。
由于微生物种类多、繁殖快且易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用pH、作用温度范围及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，所以，微生物脂肪酶是主要的研究对象。
产微生物脂肪酶菌种的研究主要集中在真菌包括，根霉、黑曲霉、镰孢霉、红曲霉、黄曲霉、毛霉、犁头霉、须霉、白地霉、核盘菌、青霉和木霉；其次是细菌，如：假单胞菌、枯草芽抱杆菌、大肠杆菌工程菌、无色杆菌、小球菌、发光杆菌、黏质赛氏杆菌、无色杆菌、非极端细菌和洋葱伯克霍尔德菌等；另外还有解酯假丝酵母和放线菌。
脂肪酶生产生物柴油进展论文
脂肪酶生产生物柴油研究进展【摘要】生物酶催化酯交换反应由于其较高的转化率以及为了回收副产物和纯化生物柴油所需采用的下游处理工艺相对简单，受到了较大程度的关注。
酯交换反应的生物催化使用商品纯化酶占据了成本的主要部分。
然而，具有更好成本-收益比的基于胞外酶和胞内酶固定化的技术促进了催化剂的重复使用性。
其他影响因素，包括醇和甘油的存在以及水的活度都能对脂肪酶的活性以及反应过程中的稳定性产生深远的影响。
【关键词】生物柴油；脂肪酶；酯交换反应；影响因素0.引言当前世界的能源消耗主要是来自地壳中的化石燃料，包括气态和液态的碳氢化合物（天然气和石油）以及固态燃料（煤），并且在可以预见的未来将维持这样的情况。
然而，能源安全和环境问题已经强烈要求全球范围发展可持续、可替代的运输燃料。
作为一种可生物降解的无毒燃料，生物柴油可以替代化石燃料，已经吸引了广泛的关注。
1.生物柴油的原料当前世界上生物柴油的生产大部分来源于可食用植物油，导致了与食物生产的冲突。
缺乏足够的油料也限制了生物柴油产业化的扩大。
因此，诸如麻疯树油，餐饮废油以及微藻油灯不可食用油表现为下一代生物柴油的可持续、可替代原料。
2.酯交换反应植物油主要由甘油三酸酯组成，还包括游离脂肪酸、磷脂、固醇、水和其他杂质。
酯交换反应是从甘油三酸酯生产生物柴油的第一步反应。
酯交换反应属于醇解反应的一种，是酯中的醇被另一种醇取代的过程，类似于水解，不同的是用醇替代了水。
虽然化学催化酯交换反应可以在短时间内得到可接受的转化率，这种反应还是有一些弊端的，比如说能耗高、甘油的回收有难度、酸催化剂或碱催化剂必须从产品中分离，废水需要处理并且游离脂肪酸和水对反应有干扰。
因此，使用脂肪酶作为生物催化剂的酶法甲醇分解反应已经成为更具有吸引力的生物柴油生产方法，因为这种方法可以克服以上这些缺陷。
3.脂肪酶作催化剂脂肪酶（甘油三酸酯水解酶，ec3.1.1.3）是一种普遍分散在高级动植物体内的酶，对脂类的生物转化起着很关键的作用。
碱性脂肪酶高产菌株的筛选及产酶条件的优化
碱性脂肪酶高产菌株的筛选及产酶条件的优化摘要利用筛选和验证相结合的方法筛选出了产碱性脂肪酶活性较高的菌株bl1011。
经过形态观察、生理生化试验及分子生物学鉴定，结果表明该菌株为假单胞菌（pseudomonas sp.）。
运用单因素试验和均匀试验优化了bl1011菌株摇瓶产酶培养基和最佳发酵条件。
在培养基为麦芽糖2.5%，蛋白胨3.0%，大豆油0.5%，k2hpo4 0.2%，培养条件为起始ph值7.5，温度33 ℃，转速180 r/min，装液量20 ml，发酵周期为60 h的条件下，酶活力达到最高，为223 u/ml。
关键词脂肪酶；筛选；发酵优化；均匀试验中图分类号 q55 文献标识码 a 文章编号 1007-5739（2012）22-0274-03脂肪酶（lipase，e.c.3.1.1.3，又称三酰基甘油水解酶）是一种特殊的酯键水解酶，能在油水界面催化油脂水解，生成甘油和脂肪酸，具有化学选择性和底物选择性[1]。
脂肪酶被广泛应用于食品、轻纺、皮革、香料、化妆品、洗涤剂、有机合成、医药等领域[2]。
尽管自然界中产脂肪酶的微生物很多，但用于商业化生产的细菌很少，主要有伯克霍尔德氏菌（burkholderia）、无色杆菌属（achromobacter）、假单胞菌属（pseudomonas）、色杆菌属（chromobacterium）、产碱杆菌属（alkaligenes）、节杆菌属（arthrobacter）[3]。
假单胞菌产碱性脂肪酶国内外虽有研究，但酶活力均不高[4]。
该研究通过罗丹明b平板法快速筛选出一株产碱性脂肪酶能力较强的菌株，并对其产酶条件进行优化研究。
1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 菌株。
细菌：bl1001-1020；酵母：bl2001-2015；霉菌：bl3001-3025。
试验菌株均由郑州轻工业学校食品与生物工程学院酶分子工程研究室保藏。
1.1.2 培养基。
①种子培养基。
固定化酶
1.2 脂肪酶的研究与应用1.2.1 脂肪酶的研究概况脂肪酶可以根据其来源分类，分为微生物脂肪酶、动物脂肪酶和植物脂肪酶。
脂肪酶可以很容易地从微生物真菌（如南极洲假丝酵母）或细菌（如荧光假单胞菌）中通过发酵过程高产量地生产出来，其过程缺乏基本的净化步骤。
一些脂肪酶表现出对底物的位置专一性，而另一些则不然。
对不同来源的游离脂肪酶类型的比较研究表明，荧光P.脂肪酶具有最高的酶活性。
通常，来自真菌来源的脂肪酶比来自细菌来源的脂肪酶表现出更好的甘油三酯酯交换活性。
作为一种多功能生物催化剂，脂肪酶具有其他酶蛋白无法比拟的优点[15]：1、在有机溶剂中具有良好的稳定性；2、催化过程不需要辅助因子，一般不发生副反应；3、可以催化水解，酯化，酯交换等众多反应[16]；4、具有独特的化学选择性、区域选择性及立体选择性；5、底物谱广，可催化非天然底物进行反应。
与动植物脂肪酶相比，微生物脂肪酶生产周期短，分离纯化相对简单，并可利用基因工程和蛋白质工程等技术实现酶的改造并构建生产工程菌[17]，适合工业化生产与应用。
1994年，丹麦Novozymes公司首次应用基因工程菌生产来源于Thermomyces lanuginosus的脂肪酶Lipolase，此后许多来源于微生物的脂肪酶也实现了商业化生产[18]。
脂肪酶的应用领域日益扩大，被广泛运用于生物柴油、食品加工、面粉改良、造纸造酒、有机合成等化工领域[19]。
1.2.2 脂肪酶的结构及催化机制脂肪酶是一类重要的水解酶，催化三酰甘油酯中酯键的裂解，具有广泛的生物技术应用价值。
脂肪酶是在人体内正确分配和利用油脂所必需的酶。
脂蛋白脂肪酶(LPL)在毛细血管中很活跃，它通过水解包装脂蛋白中的甘油三酯，在防止血脂异常方面起着至关重要的作用。
30年前，有人提出了一种不活泼的LPL低聚物的存在。
M., Tushar Ranjan (2020)指出天然油中高浓度的omega - 3脂肪酸(ɷ-3 FAs)对于维持身体健康非常重要。
脂肪酶在面包和馒头中应用研究进展
FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIESDOI：10.13995/ki.11-1802/ts.029270引用格式：王新伟,成高民，李蕊，等.脂肪酶在面包和馒头中应用研究进展[J].食品与发酵工业,2022,48(11):332-337.WANG Xinwei,CHENG Gaomin,LI Rui,et al.Recent application of lipase in bread and steamed bread:A review[J].Food and Fermentation Industries,2022,48(11)：332-337.脂肪酶在面包和馒头中应用研究进展王新伟，成高民，李蕊，赵仁勇*(河南工业大学粮油食品学院，河南郑州,450001)摘要脂肪酶具有环保、安全、高效等优点，运用新型脂肪酶来改善面包和馒头品质成为国内外研究的热点之一。
脂肪酶在面包和馒头体系中的作用底物是脂类，脂类是面粉中的次要成分，但其种类和含量影响着产品的特性和质量。
脂肪酶的添加使体系中产生极性脂，适量极性脂会增加面包中气室的稳定性，增大面包体积。
该文简述了面粉中内源性脂的种类及其功能效应、脂肪酶的催化机制及其在发酵面制品中作用底物、脂肪酶对面包和馒头等发酵制品品质的影响等，指出了脂肪酶对馒头和面包品质改良机制的研究，将是未来脂肪酶在面包和馒头中应用的研究方向。
关键词馒头；面包；脂肪酶；脂质；极性脂；非极性脂馒头是深受中国人民喜爱的传统主食之一。
由于环境温度、制作条件以及原粮小麦品质的不稳定性等因素的影响,馒头的品质很难得到保证。
在馒头工业化生产中，经常出现表皮龟裂、有气泡;颜色发暗、发黄;内部结构不均匀或有大孔洞等问题。
因此，为了改善和提高馒头品质，在原料面粉或馒头制备过程中需添加各种添加剂，如乳化剂⑷、碱⑷、酶制剂⑷和增白剂⑷等。
随着科技的发展和人们安全意识的提高,馒头中添加剂的使用要求越来越严格,运用新型酶制剂来改善面制品品质成为国内外研究的热点之一。
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第25卷第4期2006年7月 食品与生物技术学报JournalofFoodScienceandBiotechnology
Vol.25 No.4
Jul. 2006
文章编号:167321689(2006)0420121206
收稿日期:2006205208; 修回日期:2006206207.
基金项目:国家“863”计划项目(2003AA214061).
作者简介:闫云君(19692),男,湖北黄冈人,教授,博士研究生导师;3通讯作者.
细菌脂肪酶的结构和功能研究进展闫云君3, 舒正玉3, 杨江科
(华中科技大学生命科学技术学院,湖北武汉430074)
摘 要:细菌脂肪酶是一类广泛应用于工业领域的生物催化剂,具有重要的应用价值。迄今为止,
已有7个细菌脂肪酶的三维结构被阐明,30个细菌脂肪酶的基因序列被测定和分析。作者综述了细菌脂肪酶的分子结构、分泌和折叠过程及其催化机制。关键词:脂肪酶;分子结构;分泌过程;折叠机制;催化机制中图分类号:Q5,Q7文献标识码:A
AdvancesintheStudyoftheMolecularStructureandFunctionoftheBacterialLipase
YANYun2Jun3, SHUZheng2Yu3, YANGJiang2Ke(CollegeofLifeScienceandTechnology,HuazhongScienceandTechnologyUniversity,Wuhan430074,China)
Abstract:Bacteriallipaseisakindofbiocatalystwhichiswidelyusedinmanyindustrialfields.Uptonow,morethanseven32dimensionalstructuresofthebacteriallipasehavebeenelucidatedandthirtybacteriallipaseDNAsequencesweredetermined.Inthisreviewpaper,discussionisfacusedonthe3D2structure,theprocessofthesecretionandfoldingandthecatalyticmechanismofthebacteriallipase.Keywords:lipase;molecularstructure;secretionprocedure;foldingprocess;catalyticmechanism
微生物脂肪酶(lipase,EC3.1.1.3,甘油三酰酯水解酶)是一类能催化长链脂肪酸甘油酯水解为甘油和长链脂肪酸的酶类(或者是此反应的逆反应)[1]。许多微生物脂肪酶还能催化酯化反应、酯交换反应、醇解反应、酸解反应以及氨解反应等[2-3]。微生物脂肪酶具有界面激活(interfacialactivation)的催化特点。结构上,绝大多数微生物脂肪酶有一个盖子结构(lid),覆盖在脂肪酶活性中心的上方[4]。微生物脂肪酶资源丰富,具有在有机溶剂中稳定性好、广泛的底物特异性、高度的位置选择性(re2gioselectivity)和异构体选择性(enantioselectivi2ty)、催化活性高而副反应少等特点[1],因此被广泛应用于食品加工、新型生物材料、生物传感器、生物医学等领域[1-2,5]。一些细菌脂肪酶在极端环境(如高温、低温等)下仍能保持良好的生物催化活性,引起人们的特别关注。作者就细菌脂肪酶的分子结构、分泌和折叠过程及其催化机制等进行综述。1 细菌脂肪酶的分子结构1.1 细菌脂肪酶的氨基酸序列比较Jaeger[4-5]和Arpigny[6]比较了22种不同细菌
脂肪酶的氨基酸序列,并根据这些细菌脂肪酶氨基酸序列同源性的大小、保守序列的模体差异以及脂肪酶生物学性质的不同,将细菌脂肪酶分为假单胞菌脂肪酶(Pseudomonaslipase)、葡萄球菌脂肪酶(Staphylococcuslipase)、芽胞杆菌脂肪酶(Bacil
2
luslipase)等6大类。
除了构成脂肪酶活性中心的催化三联体氨基酸序列高度保守外,不同类群的细菌脂肪酶氨基酸序列之间同源性比较小,仅在少数区域存在一定的保守序列,如第四条链N2末端一般含有能形成阴离子氧洞(oxyanionhole)的氨基酸残基;第五条链上活性位点Ser残基附近的序列(Ser残基后可形成α2螺旋结构的序列);活性位点Asp和His残基附
近的序列等[7]。1.2 细菌脂肪酶的二级结构尽管不同来源的细菌脂肪酶在分子大小、水解底物的特异性、氨基酸序列上差异较大,但是其空间结构却非常相似,都具有相似的折叠方式———α/
β水解酶折叠。α/β水解酶折叠是由8个平行的β折叠片(β1～β8)组成一个中心(第二个β折叠片为反平行排列)。从第三个到第八个β折叠片之间分别有α螺旋相连(αA～αF),排列在β折叠片的两侧。β折叠片左手超螺旋扭曲,导致β1和β8在空间上以近于90°的夹角相互交叉。α/β水解酶折叠结构为各种脂肪酶的活性位点提供了一个稳定的支架:催化三联体中携带有亲核基团的Ser残基,一般位于β5链后面;酸性氨基酸(Asp或Glu)残基一般位于β7链后面;而His残基一般位于最后一个β链的后面(见图1a)[8]。不同细菌脂肪酶二级结构的差别主要表现在β折叠片和α螺旋数量、β折叠片扭曲的角度、α螺旋的空间分布位置等的差异(见图1b,c,d)。
(a)
(b)(c)(d)(a)典型的α/β水解酶折叠[9];(b)Bacillussubtilis脂肪酶二级
结构[9];(c)Pseudomonascepacia脂肪酶二级结构[10];(d)
ChromobacteriumviscosumATCC6918脂肪酶二级结构[11]图1 不同细菌脂肪酶的α/β水解酶二级结构比较Fig.1 Thedifferenceofthesecondarystructuretopolo2gyofthebacteriallipases1.3 细菌脂肪酶的三级结构
自1990年第一个微生物脂肪酶———Rhizo2mucormiehei脂肪酶的三维结构被测定以来,已有超过16个微生物脂肪酶的三维结构被阐明(检索http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez;http://www.led.uni2stuttgart.de;http://www.au2kbc.org,05/07/2006),其中7个是细菌脂肪酶。所有已测定三维结构的细菌脂肪酶均是由位于酶中央的β折叠和包围在β折叠外面的α螺旋构成的近似球形的蛋白质分子,相对分子质量为19000～60000。活性中心由Ser、Asp(或Glu)和His3个残基组成催化三联体,Ser残基一般位于β5链C末端高度保守的五肽GXSXG中(X代表任意氨基酸残基,Ba2
221食 品 与 生 物 技 术 学 报 第25卷 cillus保守五肽的第一个Gly残基被Ala残基代替),形成β转角2α螺旋模体。构成脂肪酶活性中心的氨基酸残基并不直接暴露到溶剂当中,而是通过一个狭窄的缝隙同酶分子表面相连。在酶分子表面有一段α螺旋形成“盖子结构”覆盖在活性中心的上方。在活性中心附近,脂肪酶有一个Ca2+结合位点。Ca2+分别与脂肪酶主链上的4个羰基氧原子和2个水分子相互作用,形成一个稳定的八面体,有助于脂肪酶的激活和酶结构的稳定,但Ca2+并不参与脂肪酶的催化作用(见图2)。与Ca2+相互作用的4个羰基氧原子中有一个是以顺式肽键(cis2peptidebond)的形式存在,顺式肽键通过周围的氢键网络(hydrogenbondingnetwork)维持其结构稳定。Pseudomonascepacia脂肪酶在激活状态下,还通过主链上的酰胺基氮原子(Leu17和Glu88)形成一个阴离子氧洞(oxyanionhole),以稳定脂肪酶催化过程中形成的四面体中间复合物(tetrahedralintermediate)[1,7,10-11]。图中箭头代表β链,卷曲结构代表α螺旋,小圆球代表潜在的Ca2+结合位点,右上角的α螺旋形成盖子结构覆盖在活性中心上面。图2 Pseudomonasaeruginosa脂肪酶X2衍射三维结构图Fig.2 The3D2structureofthelipasefromPseudomonasaeruginosausingtheX2raycoordinatesdeter2mined2 细菌脂肪酶的分泌所有已知的细菌脂肪酶都是胞外酶,因此细胞内合成的脂肪酶在其分泌过程中,必须通过细胞膜进行转运,依次通过质膜(cytoplasmicmembrane,革兰氏阳性细菌)、周质间隙和外膜(periplasmandoutermembrane)(革兰氏阴性细菌)。不同细菌通常采用不同的分泌机制(见图3);同一种细菌(如Bacillussubtilis)也可以采用不同的分泌系统分泌具有高度同源的脂肪酶(LipA和LipB)[12]。
im(innermembrane,内膜),om(outermembrane,外膜),p(periplasm,周质间隙
图3 不同细菌脂肪酶分泌途径示意图[13]Fig.3 Theschematicdiagramofthesecretionpathwaysusedbylipasesofthedifferentbacteria2.1 ABC转运系统(ABCexporter)ABC(ATP2bindingcassette)转运系统又称为
Ⅰ型分泌途径,是由3种细胞包膜蛋白(envelope
protein)构成:内膜ATP酶(ATPase)、膜融合蛋白
(membrane2fusion2protein,MFP)和外膜蛋白(out2
ermembraneprotein,OMP)。内膜ATP酶具有底物特异性;MFP蛋白通过一个面向周质间隙的大亲水基团锚定在内膜上,而C2末端的结构域与外膜结合。该转运复合物能促进内膜与外膜之间形成一个粘着位点,继而形成一个横越周质间隙的管孔。脂肪酶通过管孔直接分泌到细胞外的基质中,而无需在周质间隙形成具有酶学活性的中间体(图3)。采用这种途径分泌的脂肪酶如Pseudomonasfluo2rescens脂肪酶和Serratiamarcescens脂肪酶,N2末端均缺乏相应的信号肽,而C2末端却均包含相应的靶信号(targetingsignal)(Serratia.marcescens脂肪酶C2末端的靶信号为Val2Ala2Leu)。该靶信号及靶信号与C2末端的相对距离直接影响到脂肪酶的分泌[5,12]。采用基因工程技术在Pseudomonas.