蛹虫草虫草素提取工艺的研究

蛹虫草虫草素提取工艺的研究作者：殷东林，陈琼，孙伟来源：《湖北农业科学》 2015年第18期殷东林，陈琼，孙伟（信阳农林学院生物技术系，河南信阳４６４０００）摘要：以蛹虫草［Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓ（Ｌｉｎｎ．）Ｌｉｎｋ］子实体为材料，首先通过单因素分析法探索虫草素的最佳提取溶剂，结果表明，７０％乙醇是虫草素的最佳提取溶剂，并通过正交试验考察了微波助提法中微波功率、微波时间、提取次数和料液比４个因素对虫草素提取功率的影响，最终建立了提取虫草素的最佳工艺条件，即微波功率３５０Ｗ，微波处理时间４ｍｉｎ，提取２次，料液比１∶５０（ｇ∶ｍＬ），提取率可达６．８７％。

关键词：蛹虫草［Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓ（Ｌｉｎｎ．）Ｌｉｎｋ］；虫草素；正交试验；微波助提法中图分类号：Ｓ５６７．３＋３；Ｒ２８４．２文献标识码：Ａ文章编号：０４３９－８１１４（２０１５）１８－4560-03ＤＯＩ：１０．１４０８８／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ０４３９－８１１４．２０１５．１８．０42ＳｔｕｄｙｏｎＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＣｏｒｄｙｃｅｐｉｎｆｒｏｍＣｏｒｄｙｃｅｐｓ mｉｌｉｔａｒｉｓＹＩＮＤｏｎｇ－ｌｉｎ，ＣＨＥＮＱｉｏｎｇ，ＳＵＮＷｅｉ（ＸｉｎｙａｎｇＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙ，Ｘｉｎｙａｎｇ４６４０００，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＵｓｉｎｇｆｒｕｉｔｉｎｇｂｏｄｉｅｓｏｆＣ．ｍｉｌｉｔａｒｉｓａｓｍａｔｅｒｉａｌ，ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＣｏｒｄｙｃｅｐｓｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅｂｅｓｔｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓｏｌｖｅｎｔｗａｓｅｘｐｌｏｒｅｄｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒａｎａｌｙｓｉｓ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ７０％ｅｔｈａｎｏｌｗａｓｔｈｅｂｅｓｔｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓｏｌｖｅｎｔｏｆｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ．Ａｎｄｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｔｅｓｔ，ｔｈｅｍｉｃｒｏｗａｖｅａｓｓｉｓｔｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆｍｉｃｒｏｗａｖｅｐｏｗｅｒ，ｍｉｃｒｏｗａｖｅｔｉｍｅ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｓａｎｄｍａｔｅｒｉａｌｌｉｑｕｉｄｔｈａｎｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｆｏｕｒｆａｃｔｏｒｓｆｏｒｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎｐｏｗｅｒｗａｓｅｘａｍｉｎｅｄ，ｆｉｎａｌｌｙｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｐｒｏｃｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅ：ｍｉｃｒｏｗａｖｅｐｏｗｅｒ３５０Ｗ，４ｍｉｎｍｉｃｒｏｗａｖｅｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇｔｉｍｅ，ｅｘｔｒａｃｔ２ｔｉｍｅｓ，ｍａｔｅｒｉａｌｌｉｑｕｉｄｒａｔｉｏ１：５０，ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅｃｏｕｌｄｒｅａｃｈｍｏｒｅｔｈａｎ６．８７％．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Cｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓ；ｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ；ｍｉｃｒｏｗａｖｅａｓｓｉｓｔｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ收稿日期：２０１５－０１－２７基金项目：河南省科技攻关项目（１３２１０２１１００４７）作者简介：殷东林（１９８３－），男，河南潢川人，讲师，硕士，主要从事生物技术研究，（电话）１５１０３７６４６２５（电子信箱）ｙｄｌ６６９＠１２６．ｃｏｍ。

蛹虫草［Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓ（Ｌｉｎｎ．）Ｌｉｎｋ］最早源于中国，俗称北虫草，由于其药用价值与冬虫夏草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｓｉｎｅｎｓｉｓ）相似，故药典中亦记载为“北冬虫夏草”［１］。

蛹虫草为子囊菌亚门，麦角菌目麦角菌科虫草属的模式种［２］，是国内外公认的食药用真菌，民间用于肺炎、肾虚、腰疼等疾病的治疗。

其中所含的虫草多糖、虫草酸和虫草菌素（也称虫草素）均高于冬虫夏草，其独特药理作用已日益引起药学界的高度重视。

虫草素是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素，具有抗肿瘤、抑菌、抗病毒、免疫调节、抗炎［３］等非常广谱的生物学活性。

早在１９５０年就有学者观察到被蛹虫草寄生的昆虫组织不易腐烂，进而从中分离出一种抗菌性物质，定名为虫草素。

目前，以虫草素为主要成分的新药已试用于临床，有着良好的临床应用前景，但大量提取分离其纯品非常不易，化学合成也存在一定的弊端，因此国际市场上虫草素的价格非常昂贵。

根据虫草素溶于水、热乙醇和甲醇的性质，虫草素的提取一般采用水、５０％乙醇、乙醇和甲醇等溶剂。

提取虫草素的方法有浸提法、回流法、渗漉法、超声波法、索氏提取法和超临界萃取等，不同的提取原料适用的方法不同。

但为了进一步提高提取率和缩短提取时间，可用超声波辅助浸提［４］和微波辅助浸提，这２种方法操作简单且不易引入杂质。

而微波透过提取溶剂到达物料内部使之快速升温，进而使其细胞内部压力增大，当压力超过细胞壁所能承受的能力时，细胞壁破裂，胞内有效成分流出，提取溶剂易于进入细胞内部，微波法要好于超声波法［５］，有效缩短了提取时间。

虫草素的紫外、红外光谱［６］、超导核磁共振法［７］可以用于虫草素的初步鉴定，而目前虫草素的分析测定多采用高效液相色谱（ＨＰＬＣ）［８］分析法，也有采用紫外分光光度法。

ＨＰＬＣ虽然灵敏度高、重复性好、对流量和温度变化不敏感，但是成本高，一次性投资大。

还有一种薄层色谱扫描法（ＴＬＣＳ）具有展开时间短、显色方便、价格较便宜的特点，但此法测定虫草素含量的准确度和精密度均略低于ＨＰＬＣ，因此有人综合ＨＰＬＣ与ＴＬＣＳ的优点，将两者结合起来对虫草素含量进行定性定量测定。

本试验采用的是紫外分光光度法，结合单因素分析法和多因素正交分析法，对虫草素提取工艺进行优化，旨在为虫草素的提取提供一套简便、快捷、高效的方法。

１材料与方法１．１材料１．１．１试剂无水乙醇、盐酸、蒸馏水１．１．２仪器８０目筛、电子天平（上海越平科学仪器有限公司）、数显恒温水浴锅（上海梅香仪器有限公司）、微波炉（佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司）、ＴＵ－１８１０紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、循环水式多用真空泵、抽滤瓶、ｐＨ测定仪、ＲＥ５２－８６Ａ旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。

１．１．３材料蛹虫草子实体干燥后粉碎，过８０目筛；虫草素标准品（上海金穗生物科技有限公司）。

１．２方法１．２．１虫草素的提取用无水乙醇和蒸馏水按一定比例配制成２０％、４０％、５０％、７０％的乙醇；取干重２ｇ的蛹虫草粉，分别加入到已经调好的ｐＨ为５．０的１００ｍＬ蒸馏水、２０％的乙醇、４０％的乙醇、５０％的乙醇、７０％的乙醇、无水乙醇，７０℃水浴２０ｍｉｎ；然后用４２０Ｗ微波辐射１ｍｉｎ，间隔１ｍｉｎ后再辐射１ｍｉｎ，如此间隔辐射直至总辐射时间达到４ｍｉｎ，然后转入７０℃水浴提取３０ｍｉｎ，用抽滤瓶抽滤提取液，４℃保存提取液用于检测。

以上试验均做３次重复，取平均值。

得到的提取液定容至５０ｍＬ即得到虫草素原始样品溶液，从每组样品液中准确吸取１ｍＬ至５００ｍＬ容量瓶中并定容（即将原始样品溶液稀释５００倍），用于测定其吸光度。

１．２．２标准曲线的绘制标准溶液的配制：准确称取虫草素标准品０．００１０ｇ，用５０％的乙醇溶液定容于１０ｍＬ的容量瓶，准确量取上述储备液一定体积，用５０％乙醇配制虫草素浓度均为２、４、６、８、１０μｇ／ｍＬ的标准溶液。

紫外吸收光谱标准曲线的绘制：将浓度分别为２、４、６、８、１０μｇ／ｍＬ的虫草素溶液以蒸馏水作为参比，扫描２００～３５０ｎｍ紫外图谱，并测量２５９ｎｍ处的吸光度，然后以虫草素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，每组做３次重复，取平均值。

１．２．３样品含量的测定准确量取已经过稀释的虫草素样品提取液于比色皿中，以蒸馏水为对照，在２５９ｎｍ的波长处测定吸光度，将测得的吸光度带入标准曲线方程，从而计算出样品中虫草素的含量。

虫草素提取率＝测得虫草素的含量／蛹虫草粉末的质量×１００％。

１．２．４正交试验设计确定了虫草素的最佳提取溶剂之后，用正交试验法Ｌ９（３４）对微波助提法中的微波功率、微波时间、提取次数、料液比（ｇ∶ｍＬ，下同）４个因素，分别取３个水平考察对虫草素提取率的影响，以确定最佳提取条件。

Ｌ９（３４）正交试验中因素与水平见表１。

２结果与分析２．１标准曲线测定结果以虫草素质量浓度对吸光度进行线性回归，得回归方程：Ｙ＝０．０５８５Ｘ＋０．０１９６，Ｒ２＝０．９９８８，表明虫草素在质量浓度为２～１０μｇ／ｍＬ与吸光度呈良好的线性关系，标准曲线见图１。

２．２最佳溶剂的确定６组溶剂的提取率见图２。

由图２可以看出，在本试验所用的６种溶剂中，７０％乙醇的提取率最高，为４．１５％，确定为虫草素的最佳提取溶剂。

２．３正交试验结果正交试验结果见表２。

由表２可知，影响虫草素提取率的主次因素为微波功率﹥微波时间﹥提取次数﹥料液比，最优组合为Ａ１Ｂ２Ｃ２Ｄ２，即微波功率３５０Ｗ、微波处理时间４ｍｉｎ、提取２次、料液比１∶５０，提取率可达６．８７％。

３小结本研究以蛹虫草子实体为材料，研究了虫草素的提取工艺，通过单因素试验确定虫草素的最优提取溶剂为７０％乙醇，该溶剂的提取率可达４．１５％。

通过正交试验考察了微波助提法中微波功率、微波时间、提取次数、料液比４个因素对虫草素提取率的影响，建立提取虫草素的最佳工艺条件为微波功率３５０Ｗ、微波处理时间４ｍｉｎ、提取２次，料液比１∶５０，提取率可达６．８７％。

由于蛹虫草中含有的成分复杂，热提取过程中单糖、水溶性蛋白质以及鞣质等一系列杂质也会被一并提出，为虫草素的纯化带来困难，试验所得的粗品中含有一定量蛋白质；另一方面，在试验过程中存在一些系统误差和偶然误差，因此会对试验结果产生一定程度的影响。

虫草素的提取方法有很多，为了进一步提高提取率和缩短提取时间，本研究确定用微波助提法加以优化。

微波能透过提取溶剂到达物料内部，使之快速升温，进而使其细胞内部压力增大。

当压力超过细胞壁所能承受的能力时，细胞壁破裂，胞内有效成分易于流出，提取溶剂易于进入。

但所用微波功率过大或处理时间过长可能会使有效成分分解，造成损失，故可通过正交试验确定最佳提取条件。

微波辅助萃取技术具有快速、萃取率高、成本低、质量好等优点，是天然产物萃取中一种非常有发展潜力的新型技术。

参考文献：［１］江西新医学院．冬虫夏草中药大辞典（上册）［Ｍ］．上海：上海人民出版社，１９７６．［２］王英娟，李多伟，王义潮，等．蛹虫草虫草素、虫草多糖综合提取工艺研究［Ｊ］．西北植物学报，２００５（１５）：１８６３－１８６７．［３］ＡＮＸＲ，ＫＯＮＧＹ，ＷＡＮＧＭＣ，ｅｔａｌ．Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎｔａｉｓｈａｎｅｎｓｉｓｏｎｌｉｖｉｎｇｌａｒｖａｓ［Ｊ］．ＥｄｉｂｌｅＦｕｎｇｉｏｆＣｈｉｎａ，２００７，１６６（１）：４０－４１．［４］ＢＵＬ，ＺＨＵＺＹ，ＬＩＡＮＧＺＱ，ｅｔａｌ．ＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｇａｌｅｌｉｃｉｔｏｒｉｎｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎｏｆＣｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓ［Ｊ］．Ｍｙｃｏｓｙｓｔｅｍａ，２００２，２１（２）：２５２－２５６．［５］ＢＥＮＳＢ，ＨＵＡＮＧＺＱ，ＷＡＮＧＹ，ｅｔａｌ．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉａｏｎｏｆｓｅｌｅｎｉｕｍｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｏｆ Cｏｒｄｙｃｅｐｓｍｉｌｉｔａｒｉｓａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｅｌｅｎｉｕｍｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｏｎｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｔｗｏｍａｊｏｒａｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ［Ｊ］．ＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅ，２００９，３０（１７）：２６６－２６９．［６］陈顺志．一种超临界萃取虫草脱氧核苷的生产方法［Ｐ］．中国专利：ＣＮ１３３９４４０．２００２－０３－１３．［７］ＣＨＥＮＳＺ，ＨＵＨ，ＣＨＵＪＺ．ＡｓｔｕｄｙｏｆｃｏｒｄｙｃｅｐｉｎｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅｄｂｙＮＭＲ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＪｉｎＺｈｏｕＭｅｄｉａｌＣｏｌｌｅｇｅ，１９９５，１６（４）：１－３．［８］温鲁．提高蛹虫草培养物中虫草素含量的研究［Ｊ］．江西农业科学，２００５（６）：１１８－１２０．。