溶血全套实验操作规程
溶血实验
溶血实验1.浓度2.溶液配制D-PBS：Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline3.方法⑴新鲜血液2ml至用抗凝剂肝素预处理的采血管中。
⑵加入4ml D-PBS，10000g离心5min。
⑶弃上清，补加D-PBS至10ml，混匀后10000g离心5min。
⑷重复⑶4次，至上清澄清透明。
⑸加入20ml D-PBS重悬红细胞。
⑹将0.2ml红细胞悬液与0.8ml材料工作液混合。
以加0.8ml水作为阳性对照组，0.8ml D-PBS为阴性对照组。
⑺各组设4个平行，4h后，10016g离心5min，各取样品100ul至96孔板测定577nm吸光度，以655nm吸光度为参考。
溶血率% =[(OD样品-OD阴性)/(OD阳性–OD阴性)]×100%取健康非吸烟男性志愿者静脉血3 ml。
取2 ml血液，加入4 ml PBS，涡旋混匀。
4 ℃，10020 g离心10 min。
小心移除上清，补加PBS至10 ml，混匀后离心，PBS重复处理5次至上清澄清透明。
最后将红细胞用PBS定容至20 ml重悬混匀。
用PBS配制三种HAP纳米粒子的梯度工作液：100 µg/ml，50 µg/ml，25 µg/ml，12.5 µg/ml，6.25 µg/ml。
用0.2 ml上述红细胞重悬液与0.8 ml纳米粒子工作液混合，得到纳米粒子的终浓度为80 µg/ml，40 µg/ml，20 µg/ml，10 µg/ml，5 µg/ml。
0.2 ml红细胞悬液与0.8 ml PBS混匀为阴性对照，0.2 ml红细胞悬液与0.8 ml无菌三次水混匀为阳性对照，各组设3个平行。
涡旋混匀后，于37 ℃孵育3 h，10020 g离心10 min，各样取100 µl上清，于570 nm 处测吸光度值。
新生儿溶血
新生儿溶血试验操作程序标本：1、采集婴儿（出生1~3天）、母亲EDTA抗凝血3－5ml；2、离心3000转/分钟，5分钟，取血浆备用；一、定血型：取婴儿、母亲的红细胞定ABO、Rh血型；二、样品准备：1、取红细胞适量，用生理盐水洗涤三次，去上清液；2、取洗涤后的压积红细胞适量，用生理盐水配制1％红细胞悬液，用来做直接coombs实验；三、ABO系HDN：放散液提取法：1、取红细胞适量，用生理盐水洗涤三次，去上清液；2、取洗涤后的压积红细胞适量，按1/2或等量生理盐水；置56℃水浴，10min，间断摇动；离心，取上清液（即放散液）备用；1、直接Coombs实验：取多特异性卡一张；于第一孔加入1％红细胞悬液40ul；将多特异性卡放入离心机，离心5min；判读结果；2、判读完结果再做：1）游离实验：于上述多特异性卡的第二、三、四孔分别标记A、B、O；各加入1％的A、B、O型标准红细胞悬液40ul；各加入新生儿血浆40ul；2）放散实验：于上述多特异性卡第五、六、孔分别标记A、B；各加入1％的A、B型标准红细胞悬液40ul；各加入红细胞放散液40ul；取第二张多特异性卡于第一孔标记O；加入O细胞悬液40ul和红细胞放散液40ul；3、将多特异性卡放入孵育器37℃孵育10min；4、将多特异性卡放入离心机离心5min；5、判读结果；- 100%的红细胞沉在微管的底部+/- 100%的红细胞沉在微管的下端1/3之内1+ 80%的红细胞沉在微管的下端2/3之内2+ 80%的红细胞沉在微管的上端2/3之内3+ 80%的红细胞沉在微管的上端1/3之内4+ 凝集的细胞全部处于微管的顶部d.p. 双群Hemo. 溶血四、ABO系以外HDN：1、当用“O”型筛选细胞或配组细胞检测或鉴定母亲或患儿血清中有ABO系统以外的抗体，如为阳性。
或当直接Coombs实验阳性强度大于或等于“＋＋”时，可进行以下操作；2、用乙醚放散法制备放散液，方法如下：1）取1体积三洗红细胞加1体积生理盐水（或AB血浆）、2体积分析纯乙醚，颠倒摇匀10分钟，然后以1300转/分钟，离心5分钟；2）离心后即分成三层，最上层是乙醚，中层是红细胞基质，下层是具有抗体的放散液；3）该放散液置37℃水浴中30分钟，除尽乙醚，离心上清即为放散液。
新生儿溶血病HDN血型血清学检查标准操作规程
新生儿溶血病HDN血型血清学检查标准操作规程1、目的为规范输血科HDN血型血清实验诊断的技术操作，确保检测结果准确，明确HDN诊断及其原因，依据《输血实验室管理程序》4.1.9条款的要求制定本规程。
2、适用范围本文件适用于本院输血科对HDN进行血型血清学实验诊断及其实验操作技术的规范化管理。
3、职责：输血科技术人员负责本实验的技术操作。
4、试验方法及原理4.1试验方法：微柱凝胶卡式法4.2原理：本微量定型系统凝胶测试法基于生物化学凝胶过滤技术和离心技术及免疫化学抗原抗体特异反应。
当抗原抗体反应，抗人球试验时，血细胞发生凝集。
离心时凝集块不能通过凝胶间隙而留在凝胶上层，呈阳性反应，未凝集细胞离心时可通过凝胶间隙而沉积在凝胶管底部，呈阴性反应。
5、样本采集和处理取患儿不抗凝血1-2ml及EDTA-K2抗凝血3～4ml,24小时内送检。
将不抗凝血离心分离出血清备用。
6、试剂：5.1 0.9%的生理盐水；5.2戴安娜合血卡；5.3血清抗A（市售）、抗B（市售）、抗A+B（健康O型人血清）、抗D标准血清；5.4 5%A、B及0型试剂红细胞盐水悬液；5.5长春博迅公司的血型定型试剂卡；7、仪器：1)XTL-4.7细胞洗涤离心机；2)DiaMed-ID Incubator 37 SⅠ温育器；3)DiaMed-ID Centrifuge 12 SⅡ7.5操作程序：7.5.1婴儿及母亲ABO血型鉴定是检查第一步，以便考虑以后进一步检查程序。
7.5.2如母子ABO不合（母O子A、B，母A子B、AB，母B子A、AB）则按下列步骤进行患儿血液三项试验：⑴直接抗人球蛋白试验（DAT）（微柱凝胶卡式法）1)取患儿不抗凝血离心后，用0.9%的生理盐水配成0.8%的红细胞悬液。
2)在戴安娜LISS/Coombs卡上标明患儿的姓名或编号，撕开卡上的铝箔，加入配好的患儿红细胞悬液50μl。
3)将卡放入戴安娜离心机离心10分钟后判读结果。
新生儿溶血病血型血清学检验操作规程
新生儿溶血病血型血清学检验操作规程 SXYJ-GZ-02191目的辅助临床诊断母婴血型不合导致的新生儿溶血病。
2适用范围母婴血型不合新生儿黄疸者或产妇产前检出免疫性血型抗体且伴有母婴血型不合者。
3职责检测者负责依据此程序进行HDN产前血型血清学检验操作。
4材料与设备抗-A、抗-B血清、反定型试剂红细胞、血型物质或二硫苏糖醇（DTT）；实验室常规应用的耗材备品准备充分、仪器设备运行状态正常。
5操作方法5.1检查父亲、母亲及新生儿标本血型5.1.1ABO血型鉴定（方法参见SXYJ-GZ-0202）；5.1.2RhD抗原鉴定（方法参见SXYJ-GZ-0205）。
5.2新生儿标本的三项试验5.2.1直接抗人球蛋白试验：（方法参见SXYJ-GZ-0210）。
ABO新生儿溶血病时，直接Coomb’T的结果只起参考作用；ABO以外的新生儿溶血病标本的直抗结果，对临床诊断起决定作用。
5.2.2游离IgG抗体测定：（方法参见SXYJ-GZ-0211）。
测定新生儿血清中是否存在游离的IgG抗体。
用A型、B型红细胞检测可发现，A型新生儿血清中可有少量抗A和较多抗B；B型新生儿血清中可有少量抗B和较多的抗A，抗体筛选红细胞用来筛选ABO以外的IgG抗体，结果阳性时需要用谱细胞鉴定其特异性。
5.2.3放散试验：（方法参见SXYJ-GZ-0209）。
采用热放散方法，放散液中抗体鉴定用间接Coomb’T法（方法参见SXYJ-GZ-0211）。
患儿红细胞上放散出抗A、抗B或放散出ABO以外抗体，都是阳性指征。
5.3母亲标本的检查方法参见SXYJ-GZ-02186结果判定6.1根据凝集强度(方法参见SXYJ-GZ-0202:5.2.1.6)对结果进行判读6.2ABO HDN6.3其它血型系统HDN7报告发放根据检测结果形成报告，报告发放至检验申请送检人。
8注意事项8.1如果新生儿标本检测游离抗体阳性，直抗应该阳性，放散试验也应该是阳性，故在直抗阳性、游离抗体阳性时，放散试验可省去不做。
溶血性实验2014
溶血性实验分光光度法测定1、原理根据红细胞破裂释放出来的血红素在可见光波长段具有最大吸收的原理,采用分光光度法测定受试物的溶血程度。
2、实验方法取新鲜血液8mL,肝素抗凝,加入10mL0.9%生理盐水稀释。
向1mL纳米粒溶液(pH6.5)中加入100μL稀释血液,于37℃摇床中温浴一定时间后,750g离心5min以去除完整的红细胞及红细胞碎片。
将离心得到的上清液加入到2mL 乙醇/盐酸混合溶液(39:1;99%乙醇(v/v):37%盐酸(w/v))中沉淀除血红蛋白外溶液中的所有组份,再以750g离心5min,取上清于紫外分光光度计398nm处测吸光度值。
其中阳性对照(positive control, pc)为蒸馏水,阴性对照(negative control , nc )为0.9%生理盐水,均用同样方法处理得纳米粒溶液的溶血率(Hemolysis rate, HR%)组别阴性对照组阳性对照组试验组新鲜血液mL 8 8 8蒸馏水0 1 00.9%生理盐水 1 0 0材料0 0 13结果观察:①最大吸收波长的确定:取阳性管的上清液在紫外可见分光光度计上扫描,测得最大吸收波长。
②溶血率的测定:将各管的溶液置入干燥离心管中离心,取上清在分光光度计上,在最大吸收波长处,以阴性管为空白读取各管A值。
4结果判断:用下式计算各试验管的溶血率%:溶血率(%)=(A试-A阴)/(A阳-A阴)×100%式中:Ａ试为试验管吸光度;Ａ阴为阴性对照管吸光度;Ａ阳为阳性对照管吸光度。
一般溶血率<5%,否则不宜用于临床。
溶血实验-
溶血实验
1，准备2% 红细胞
保定兔子，自心脏抽取血液5 ml，加入0.2 ml抗凝剂EDTA，用PBS洗涤、离心，除去表面的白细胞，至上清液不显红色，弃上清液后取1 ml再加入50 ml的PBS即得。
2，准备材料
将不同种类的材料用PBS溶液调整浓度为800，400，200，100，50和25 ug/ml。
金团簇的浓度为50，25，12.5，6.25，3.15 ug/ml。
3，实验过程
4，每次使用红细胞前，用PBS洗，直至上清液中无明显红色（略黄），吸取底物200ul, 稀释至10ml 使用
将0.5ml的材料与0.5ml的2%的红细胞溶液混合，室温条件下静止3h，之后用10050 r/min 离心3min。
取出100ul于96孔板上，用570nm的波长检测。
分别以水和PBS作为阳性对照和阴性对照。
每个样品2个平行。
溶血率（%）=（样品吸收-阴性对照吸收）/（阳性对照吸收-阴性对照吸收）×100%。
溶血率超过5%视为溶血。
酸溶血试验
【指导酸溶血试验的测定。
【该SOP变动程序】本标准操作程序的改动可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、质控主管、科主任。
【检验的适应证】本试验阳性主要见于PNH，某些自身免疫性溶血性贫血发作严重时也可阳性。
【仪器与试剂】1.仪器：水温箱，离心机2.试剂：2.1 同型正常人血清或AB型血清：取正常人同型或AB型血5ml分离血清备用（37℃孵育）。
取新鲜血清0.5ml放60℃水浴3分钟灭活备用。
2.2 50％RBC悬液：取患者血0.5ml，放10ml生理盐水试管中洗涤三次（或洗2.3 0.2N HCL。
【操作程序】1 .用10ml离心管1支，加8.5g/LNaCl溶液5－6ml，再加患者末梢血10余滴，昏匀，离心弃去上清液。
如此重复洗涤红细胞2次，最后配成50％红细胞悬液。
2.取与患者同型或AB型血3-5ml，待其自然凝固，分离正常人血清（最好采用多人混合新鲜血清，以保证有足够的补体）。
3.将上述同一正常人血按操作1制备50％红细胞悬液作正常对照，按表操作。
4.置37℃水浴中1小时，观察结果。
【参考值范围及报告单】1．试验管溶血、对照管不溶血为阳性。
2．试验管和对照管都不溶血为阴性。
【酸溶血试验的注意事项】1.血清酸化后，试管必须塞紧，否则二氧化碳逸出，可使血清酸度下降。
2.抗凝剂会影响pH值，故不宜用抗凝血浆，但可用脱纤维血。
3.为了保证补体充足，最好用混合血清，但正常对照红细胞必须用“O”型血。
4.如患者曾经多次输血，血中异常红细胞相对减少，本试验可为弱阳性或阴性。
‘操作人员部门主管质量负责人姓名吴芬 ****** ******日期 04年07月15日。
溶血试验实验报告
溶血试验实验报告
实验报告：溶血试验
实验目的：
本实验旨在通过溶血试验，检测不同浓度的溶血素对红细胞的溶解作用，从而
了解溶血素的溶血作用强度。
实验材料：
1. 正常人血液
2. 0.9%生理盐水
3. 不同浓度的溶血素溶液
4. 离心管
5. 试管
实验步骤：
1. 取一定量的正常人血液加入离心管中。
2. 分别加入0.9%生理盐水和不同浓度的溶血素溶液，使得最终浓度分别为0.1%，0.5%，1.0%，2.0%。
3. 将离心管轻轻摇匀，置于37摄氏度水浴中孵育30分钟。
4. 孵育结束后，离心管离心2分钟，取上清液置于试管中，并用分光光度计测
定吸光度。
实验结果：
根据实验测定结果，不同浓度的溶血素对红细胞的溶解作用呈现出不同的吸光
度值。
随着溶血素浓度的增加，溶解作用也逐渐增强，吸光度值逐渐增大。
通
过实验数据的分析，可以得出溶血素的溶血作用强度与其浓度呈正相关关系。
实验结论：
本实验通过溶血试验验证了溶血素对红细胞的溶解作用，并得出了溶血作用强度与溶血素浓度呈正相关的结论。
这一结论为进一步研究溶血素的生物学功能和临床应用提供了重要的参考依据。
同时，本实验方法简单易行，可为相关研究提供参考和借鉴。
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溶血全套实验操作规程
一, 抗碱血红蛋白（HbF）测定
1.取抗凝血1-2ml, 用等渗盐水离心沉淀, 洗涤红细胞3-4次, 将洗涤后的红细胞按沉淀体
积加1.5倍蒸馏水和半量四氯碳, 用力震荡混合5-6分钟, 使红细胞完全溶解后离心20分钟, 上层即为100g/lHb液.
2.对照管: 100g/lHb液0.02ml, 再加5ml蒸馏水, 混匀.
3.测定管: 100g/lHb液0.1ml, 加入预温至25℃的0.083M的KOH1.6ml，同时开动秒表，
混匀数秒钟，至1min整，立即加入酸性半饱和硫酸铵溶液3.4ml，倒转混匀，过滤取上清夜。
4.分光光度计540nm，蒸馏水调零，分别测两管光密度。
HbF%=测定管光密度/（对照管光密度X5）X100
5.正常人1.0-3.1%，新生儿55-85%，一岁后接近正常人。
二，异丙醇试验
1ml7%异丙醇溶液，置有塞试管中，37℃水溶液预热数分钟后，加入0.1mlHb(10%)溶液，加塞混匀，计时观察，同时做正常对照。
若放在37℃水溶液中，5min出现浑浊，40min 之内出现沉淀，则为阳性。
三，血浆游离血红蛋白测定
试剂（ml）标准管测定管空白管
1. 10g/L联苯胺0.5 0.5 0.5
2. 被检血浆（血清）——0.02 ——
3. 标准血红蛋白0.02 ————
4．1%HO 0.5 0.5 0.5
5．10%醋酸液 5 5 5
（注：1-4试剂混合后，于室温下静置20min, 再加5试剂）
10min后，用比色剂（0.5cm）测定各管的光密度，波长530nm空白管为比色对照。
结果按下列计算：
血浆游离Hb(mg/L)=测定管光密度/标准管光密度（0.025）X100）
正常值：〈40mg/L
四，高铁血红蛋白还原实验
1，静脉采血1.5-2mL，加入含有38g/L枸橼酸钠抗凝剂的小瓶内，再加葡萄糖20mg.血液与抗凝剂按9：1混合，亦可用ACD抗凝。
2，将此血标本离心沉淀5分钟（1000R/M），或置于4℃冰箱24小时，待红细胞下沉后，吸取部分血浆，使血液与血浆之比约为1：1（相当于红细胞压积30-40%）
3，摇匀后，取此血液1.0毫升，加12.5%g/l亚硝酸钠-葡萄糖溶液和0.0004mol/L美兰液各
0.05ml,颠倒混合15次，使与空气中的氧气充分接触，加塞，37℃水浴（孵箱）保温3
小时（血不足用半量）。
4，取出后摇匀，吸取此血液0.1 ml,加于10ml0.02mmol/L磷酸盐缓冲液中，2分钟后，634nm 处（或红色滤光板）比色，用蒸馏水做空白，测定其光密度为A。
5，量取未加上述试剂，但同样孵育的血液0.1ml,按上述进行比色，测光密度为B，再于此液中加亚硝酸钠-葡萄糖溶液1滴，摇匀，5分钟后测定光密度为S。
结果：高铁血红蛋白还原率%=（1—A-B/S-B）X100%
正常值：〉75%
74-31%为杂合子，〈30%为纯合子
五，微量血红蛋白电泳
1，浸膜：将薄膜毛面朝下先漂浮于PH8.5TEB缓冲液中，待全部浸润后，用小镊子将其按入缓冲液中，至少15-20分钟。
2，点样：取出已浸透的薄膜，以滤纸吸取多余的水分。
取被检者及正常人（比较用）5%的Hb液，点样要求匀，直，细。
3，电泳: 槽内PH8.5硼酸缓冲液,用两层纱布搭桥。
毛面朝下置于桥上，点样端在负极约1cm 左右，150V，40-60分钟。
4，染色：将电泳槽内取出薄膜浸入染色液内，并不时翻动，约10分钟，取出放入漂洗液内直至薄膜底色度变白为止，取出晾干。
5，透明：将已干燥标本置透明液中浸泡15-20分钟，然后贴于玻板上阴干。
（气温过高易失败）
六，HbA2定量
将漂洗的膜取出，剪下HbA2和HbA（包括HbF）带，分别浸于2毫升和10毫升浸出液中约20分钟，其间振摇数次，使色带完全洗脱。
（注意：在气温过高时，洗脱时间不可太长，否则洗脱液兰色减退，并逐步变为紫色）。
用分光光度计，于620nm波长，用浸出液调零，测两者的光密度。
HbA2%=HbA2光密度/（HbA2光密度+5XhbA光密度）X100
正常值：（1.05-3.12）%
七，PH6.5电泳
将醋纤膜浸于PH6.5缓冲液中至少20分钟，取出醋纤膜，用滤纸吸取多余液体，点样于中线，同时用正常Hb液对照。
用100V，电泳45分钟，用丽春红S染色。
结果：HbH移向阳极，HbBart’s在点样线上，其余各种Hb均移向阴极。
八，溶血试验（简易法）酸
洗涤两次的红细胞配成50%浓度
管别AB型血清50%RBC 0.2M（HCL）37℃水浴
—————
患者对照
测定管(ml) 0.5 0.025 ——0.05 1小时对照管（ml）0.5 ——0.025 ————
溶血为阳性
实验室试剂配制
1，0.083MKOH：0.1MKOH稀释12倍（PH必须大于12）
2，酸性半饱和硫酸铵：取硫酸铵（（NH3）2SO4）400g加蒸馏水500ml,置于37℃水浴24小时不断搅拌，使达饱和，再冷至25℃，搅拌一次，使过量的（NH4）2SO4析出，上清液为饱和液，取上清液400ml加1MHCL20ml。
蒸馏水加至800ml，混匀室温保存（PH 必须大于3）
3，17%异丙醇溶液：17ML异丙醇加0.1mol/Ltris缓冲液（7.4）至100ml.PH大于7.2方可。
4，10g/L（1%）联苯胺：10g联苯胺溶于90ml冰醋酸内，然后加蒸馏水至100ml，贮存棕
色瓶，置于冰箱内使用数周。
5，1%H2O2：30%H2O2新鲜配制（稀释30倍）
6，100g/l(10%)醋酸溶液：取10ml冰醋酸，加蒸馏水至100ml。
7，标准Hb溶液：取以生理盐水洗涤过三次的压积红细胞与等体积蒸馏水，0.5倍体积的四氯化碳混合，剧烈震荡5min后，离心20min(2500r/min),吸取上层Hb液，用氰化高铁Hb法准确测定其浓度，稀释成100g/l（10%）Hb浓度，于低温冰箱保存，用时取0.01ml，加生理盐水至10g/l。
即为100mg/l（10mg%）应用标准液。
8，12.5g/l亚硝酸钠-葡萄糖溶液：亚硝酸钠：1.25
葡萄糖：5
加蒸馏水至100ml，用棕色瓶，4℃保存一个月。
9，0.0004mol/l美蓝溶液：美蓝（次甲基蓝，亚甲基蓝）15mg，家蒸馏水100ml，室温1-2个月。
10，0.02mol/l磷酸盐缓冲液（PH7.4）：
NA2HPO4·12H2O 229.5mg (1.1475g)
KH2PO4：52.2mg (0.261mg)
加蒸馏水100ml (500ml)
11，PH8.5TEB缓冲液：Tris: 10.2g (5.1g)
EDTA: 0.6g (0.3g)
硼酸：3.2g (2.6g)
加蒸馏水1000ml9500ml)
12，PH8.5硼酸缓冲液：硼酸：5.56g
硼砂(四硼酸钠)：6.87g
加蒸馏水至1000ml
13，0.09%丽春红：丽春红S或G：1.8g
三氯醋酸：26.8g
磺柳酸：26.8g
加蒸馏水至100ml，用前将上清夜以蒸馏水稀释20倍使用。
14，氨基黑：氨基黑10B：0.5g
甲醇：50ml
冰醋酸：10ml
蒸馏水：40ml
溶解而盛棕色瓶内。
15，漂洗液：甲醇（乙醇）：45ml
冰醋酸：5ml
蒸馏水：50ml
溶解而成
16，透明液：无水乙醇：70ml
冰醋酸：30ml
混合而成
17，PH6.5磷酸盐缓冲液：KH2PO4: 3.11g
NaHPO4: 1.49g(Na2HPO4·2H2O1.87g)
蒸馏水900ml
校正PH后稀释至1000ml
18，0.4mol/lNaOH：1M→稀释
19，0.1mol/lTris缓冲液（PH7.4）：Tris:1.21g
0.1NHCL40ml
加蒸馏水至100ml
20，1.0mol/l盐酸标准液：浓盐酸MW=36.465，比重1.18，含HCL36%-38%。
浓盐酸浓度约为11.7
浓盐酸（AR）43ml加水至500ml。