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结核菌种鉴定方法
结核菌种鉴定方法结核病是一种由结核分枝杆菌引起的传染病，严重威胁着全球公共卫生。
在结核病的防控中，快速、准确地识别结核菌的种类对于制定有效的治疗方案和控制传播至关重要。
目前，针对结核菌种进行鉴定的方法主要包括传统培养方法、分子生物学方法和质谱分析方法等。
本文将介绍这些结核菌种鉴定方法的原理、优缺点及应用前景。
一、传统培养方法传统培养方法是最早应用于结核菌种鉴定的技术之一。
其原理是通过将临床样本接种于含有营养物质的培养基上并进行适当的培养条件，使结核菌在培养基上生长形成菌落，再通过观察菌落形态、生长速度等特征来进行种鉴定。
传统培养方法的优点在于成本较低，设备简单，且对菌种的鉴定有一定的准确性；但同时也存在培养周期长、操作繁琐、对细菌数量要求较高等缺点。
由于结核菌的生长速度较慢，传统培养方法在临床实践中逐渐被其他更快速、准确的鉴定方法所取代。
二、分子生物学方法分子生物学方法是近年来用于结核菌种鉴定的新兴技术，其包括聚合酶链式反应（PCR）、核酸杂交技术、基因测序等。
分子生物学方法的原理是通过对结核菌的基因组进行特定基因片段的扩增、检测和分析，实现对结核菌种的快速鉴定。
相对于传统培养方法，分子生物学方法有着准确性高、灵敏度好、快速性强等优点，且可以检测到非活性、难培养的结核菌种。
但分子生物学方法也存在着设备昂贵、对操作人员技术要求高等缺点。
三、质谱分析方法质谱分析方法是一种利用质谱仪对结核菌的代谢产物进行检测和分析的技术，其原理是通过对靶分子的质谱特征进行分析鉴定。
质谱分析方法具有鉴定速度快、灵敏度高、可同时检测多种代谢产物等优点，且对于非活性菌种、难培养菌种也有较好的应用前景。
质谱分析方法的设备成本高、需要专业技术人员操作等缺点也限制了其在结核菌种鉴定中的推广应用。
结核菌种鉴定的方法包括传统培养方法、分子生物学方法和质谱分析方法，每种方法都有其独特的优势和局限性。
未来随着科学技术的不断发展，结核菌种鉴定方法也将朝着更快速、更准确、更便捷的方向不断前进，为结核病的防控提供更加有力的支持。
结核分枝杆菌MPT64蛋白的表达、纯化及初步应用
司完成 。
41MPT64 基因的诱导表达 :将 p ET15b2MPT64 大 肠杆菌工程菌接种于含氨苄青霉素 100μg/ ml 的 LB 液体培养基中 ,37 ℃培养至 A600 = 0. 6 左右时 ,诱导 表达 3～4 小时收集菌体 。
中国防痨杂志 2001 年第 23 卷第 2 期
·85 ·
·论著·
结核分枝杆菌 MPT64 蛋白的表达 、纯化及初步应用
吴雪琼1 ,张俊仙1 ,李洪敏1 ,夏湘萱1 ,刘 军1 ,金关甫1
摘要 :目的 获得重组 MPT64 蛋白 ,研究其免疫学特性 ,评价其在结核病血清学诊断中的价值 。 方法 应用基因工程技术表达 、纯化 MPT64 蛋白 ,通过 Western blotting 分析其抗原性 。分别以结核分 枝杆菌 PPD 或纯化的 rMPT64 蛋白为抗原 ,通过 ELISA 方法及结核病一步法检测血清中抗结核抗体 。 结果 重组质粒 p ET15b2MPT64 测序表达除 83 位密码子由 CCA 突变为 CCG 外 ,其余密码子均与报道 的相同 ,但其氨基酸序列无变化 。它在大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞内以包涵体形式存在 ,表达量占菌体 总蛋白的 20～30 % ,分子量约 26kDa ,Western blotting 分析它与抗结核分枝杆菌多克隆抗体具有良好 的免疫反应性 。纯化后的 rMPT64 样品经 SDS2PAGE 和光密度扫描分析表明其纯度约为 80 %左右 ,每 100ml 培养菌可获得 10mg 左右的重组蛋白 。以 33 例正常人血清的 OD 值 + 2S 为正常界限值 ,PDD 的 特异性和敏感性分别为 94 %(31/ 33) 、63. 7 % (21/ 33) 、66. 7 % ;rMPT64 纯化蛋白分别为 94 % (31/ 33) 、 30. 3 (10/ 33) ;一步法分别为 88 % (29/ 33) 、66. 7 % (22/ 23) 。结论 p ET15b2MPT64 大肠杆菌工程菌能 以包涵体形式高效表达重组 MPT64 蛋白 ,该蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性 。rMPT64 纯化 蛋白有可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一 。
荧光PCR探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药情况的研究
结核与肺部疾病杂志2020 年12 月第1卷第3 期J Tuberc Lung Dis，December 2020. Vol. 1，No. 3• 245 ••论著•荧光P C R探针熔解曲线法检测结核分枝杆菌 对利福平和异烟肼耐药情况的研究【摘要】目的评价荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction.PC R)探针熔解曲线法（简称“培解曲线法”)检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药的情况。
方法对832例涂阳肺结核患者的痰标本进行BACTEC M GIT 960(简称“M GIT 960”)液体培养,结果显示污染35例.培养阴性52例，培养阳性745例，对培养阳性的745 份培养物进行菌种鉴定(基因芯片法），其中混合感染7例，非结核分枝杆菌60例，结核分枝杆菌复合群678例;对 鉴定为结核分枝杆菌复合群的678例患者标本采用M GIT 960液体培养药物敏感性试验(简称“M G1T 960药敏试 验”)和熔解曲线法进行利福平和异烟肼耐药基因检测。
熔解曲线法检测对利福平是否耐药的结果无效(无法判断是否耐药)31例，检测对异烟肼是否耐药的结果无效34例，剩余639例利福平和异烟肼同时检测结果有效。
以MGIT 960液体药敏试验为参考标准，分析熔解曲线法检测耐药基因的效果。
结果以M GIT 960液体药敏试验结果为参考标准,639例患者的样本进行利福平和异烟肼熔解曲线法耐药性检测，对利福平耐药性检测的符合率为96.2%(615/639)，敏感度和特异度分别为93.3%(126/135)和97.0%(489/504),阳性预测值和阴性预测值分别为89. 4%(126/141)和98.2%(489/498)，尺<2沙2值为0.89;对异烟肼耐药性检测的符合率为93. 6%(598/639)，敏感度和特异度分别为83. 1%(157/189)和98.0%(441/450),阳性预测值和阴性预测值分别为94.6%(157/166)和93.2%(«1A丨73). 值为0.84。
牛分枝杆菌系统进化及鉴定-欧喜超
性肝肾损伤，随后异烟肼被吡嗪酰胺和乙胺丁醇替代治疗，3周后出院，两个月后病人去世。
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病案分析
2002年，在患者居住的农场，一只屠宰的病牛肺组织上发现结核分枝杆菌， 流行病学调查发现上述患者也在同一时间因结核病离世。基因分型结果显示 两株分枝杆菌具有相同的基因型。
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牛分枝杆菌传统鉴定方法
1、生化鉴定
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➢ 枝杆菌感染患者1例，占全部患者的0.32%（1/313）。
牛分枝杆菌在复合群菌株进化中的位置
M. bovis M. tuberculosis
人型结核分枝杆菌起源于牛型结核分枝杆菌？？？
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全基因组序列图
1998年,首次完成了人结核分枝杆菌H37Rv全基因组序列图，牛结核杆 菌 的全基因组序列于2003年完成，牛分枝杆菌全基因组序列较结核分枝杆菌小得 多。
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牛结核分枝杆菌
➢ 1882年，德国科学家Koch发现结核病的病原菌结核分枝杆菌， 1898年， Smith 通过 ➢ 培养特征的差异将结核分枝杆菌和牛分枝杆菌区分开来。 ➢ 结核分枝杆菌为细长略带弯曲，牛分枝杆菌较粗短。 ➢ 牛分枝杆菌生长缓慢，专性需氧，初次分离培养时， ➢ 需36-37℃培养5-8周可出现菌落（推荐观察10-12 周）。 ➢ 结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的培养温度均为37℃～ ➢ 38℃。培养时最适pH值，结核分枝杆菌为7.4～8.0， ➢ 牛分枝杆菌为5.9～7.4。 ➢ 从标本内分离牛分枝杆菌或作为本菌的传种及保存 ➢ 需使用丙酮酸钠培养基（丙酮酸钠替代丙三醇）。 ➢
MTB和牛分枝杆菌均存在16s rRNA、Rv0577和ISl561 DNA片段，而牛 分枝杆菌缺失Rvl510、Rvl970和Rv3120基因。
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TB-IGRA酶联免疫分析试剂盒说明书
人结核分枝杆菌Y-干扰素（TB-IGRA）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。
检测范围：96T10pg/ml-240pg/ml使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中结核分枝杆菌Y-干扰素（TB-IGRA）含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人结核分枝杆菌Y-干扰素（TB-IGRA）水平。
用纯化的人结核分枝杆菌Y-干扰素（TB-IGRA）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入结核分枝杆菌Y-干扰素（TB-IGRA），再与HRP标记的结核分枝杆菌Y-干扰素（TB-IGRA）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的结核分枝杆菌Y-干扰素（TB-IGRA）呈正相关。
用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人结核分枝杆菌Y-干扰素（TB-IGRA）浓度。
标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
分枝杆菌菌种的基因快速鉴定技术
圉 堡兰ｌ壅圭塑垡堂量桂验学分册 ２Ｃ 主第 ２ 卷第 ２ 鱼 ０２ ３ 期
综 述
微 生 物 与 寄ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ生 虫 ・
分 枝杆 菌 菌 种 的基 因快 速 鉴 定 技 术
靳 晓 红 刘 元 东 述 综 庄 玉 辉 王 加 旺 棱 审
性， 因此 临 床 快速 检 测 、 剐 分枝 杆 菌 时 于疾 病 时 治 疗具 有 十 分重 要 的作 用 ．本 文时 分 拉 杆 菌 的基 因 快 速 捡 洲 方 岳 进行 了综 述 鉴 关键词 ： 舟枝 杆 菌 ； 菌种 ； 目譬 定 基 中 图分 类 号 ： ３ ８ ９ Ｒ ７．１ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ６３ ３ （ Ｃ ２， ０ ９Ｏ １０ ７０ ２＇ ）２０ ８ ２ ０ ３ 凝 胺 中呈 现 ７ 同的 带 型 １ ｓＤＮ 由 有 些 序 列 在连 化 中非 常 － ｒ Ａ ６ 缓慢， 有高 度 的保 守性 ， 有 一 些 部 序 变 ｌ 鞍 大 ． 用 来 还 立． ｆ ， 可
（ ．济 南军区军 事 医学研 究所 ． 南 ２ ０ １ ；．解放 军 ３ ９医院结核 病研 究 室． １ 济 ５０４２ ０ 北京 １ ０ ９ ） ０ ０ １
摘 要： 目前 ， 由非 姑核 分枝 杆 菌 起 时 疼病 不 断 增 多， 临 床 袁 现 与 站 棱 病 十 分 相 似 ， 对许 多抗 结核 药 物 有 一 定 的 耐 受 其 但
研 究 亲 缘 关 系 比较 接 近 的 知 属 关 系 ， 定 部 分 苗 冲 。是 雪琼 等 鉴 设 计 了 而 对 物 扩 增 １ ｓＤＮＡ 中 的 ２ ２ ｐ片 任 ， 过 ． Ｃ ６ｒ ７ｂ 通 ％ Ｐ Ｓ 分析 ２ ２种 丹 枝 杆 苗 ． 结檀 、 型 和 Ｂ Ｇ 图 谱 栏似 ． 萨 斯 其 丰 Ｃ 堪 和 胃升檀 奸 营 电涑 臣谱 相 似 ， 他 菌 之 图 谱 各 ７ 相 同 ： 其 ＝ 谴 方 法 的弱 点是 实 验 易 受 凝 齄 内温度 的 影响
结核病实验室检查的临床意义
结核菌培养临床价值
确诊结核病
1份痰标本直接涂片抗酸杆菌镜检阳性+1份 痰标本结核分枝杆菌培养阳性即可确诊。 痰涂片阴性，肺部影像学检查符合活动性 肺结核影像学表现+1份痰标本结核分枝杆 菌培养阳性
用于耐多药结核疗效判定
治愈： （1）患者完成疗程，且在疗程的后12个月，至少最 后5次痰培养（每次间隔至少30天）连续阴性。 （2）如出现1次痰培养阳性，其后痰培养（间隔至 少30天）最少连续3次阴性。 失败： 治疗的最后12个月，5次痰培养中有两次或两次以 上阳性；或者在最后的3次，培养中有任何一次是 阳性。
Chiappini E, Fossi F, Bonsignori F, et al. Utility of interferon-γ release assay results to monitor anti-tubercular treatment in adults and children. Clin Ther, 2012, 34: 1041-1048.
• 灵敏度
基本不受免疫力低下/受抑制影响，在肺外结核患者中有很 高的检出率
美国FDA数据：灵敏度95.6%(175/183) 国内临床数据：灵敏度95.3%(624/655)
实验结果的解释
• 阴性结果 提示患者体内不存在针对结核杆菌特异的效应T细胞。 假阴性结果： ①感染阶段不同；②少数免疫系统功能不全患者 • 阳性结果 提示患者体内存在针对结核杆菌特异的效应T细胞，患者存在结 核感染。但是否是活动性结核病，需结合临床症状和其它检测 指标综合判断。 假阳性结果： ① 4种环境分枝杆菌感染时：M.kansasii（堪萨斯）、M.szulgai （苏氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登）
荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变研究
荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变研究马艳艳;李辉;赵东阳;李庆阁【摘要】目的对荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌耐利福平突变方法进行临床研究,评价其检测效能及在国境口岸应用价值.方法应用荧光PCR熔解曲线法检测结核病人临床分离标本,与传统药物敏感性试验对比,衡量该方法的灵敏度、特异性.结果对347例结核病人临床分离培养样本,药敏试验检出271例利福平敏感标本,76例利福平耐药标本；荧光PCR熔解曲线法检出269例利福平敏感标本,78例利福平耐药标本,灵敏度为93.42％,特异性为97.42％,符合率为96.54％.结论荧光PCR熔解曲线法检测速度快速、灵敏度高、特异性强,可用于结核分枝杆菌利福平耐药突变的快速检测,适于国境口岸对耐多药结核病的快速筛查.【期刊名称】《口岸卫生控制》【年(卷),期】2011(016)005【总页数】4页(P21-24)【关键词】结核分枝杆菌;熔解曲线法;利福平;检测【作者】马艳艳;李辉;赵东阳;李庆阁【作者单位】河南国际旅行卫生保健中心河南,郑州,450046;河南省疾病预防控制中心河南,郑州,450016;河南省疾病预防控制中心河南,郑州,450016;厦门大学福建,厦门,361012【正文语种】中文【中图分类】R52结核病是一种由结核菌感染引起的传染病，据估计全球约有三分之一的人感染，约10%的感染者成为结核病人。
随抗结核药物的使用，耐药结核病人逐渐增加，其中耐多药结核病(MDR-TB)［1］即至少同时耐异烟肼和利福平两种一线抗结核药物的结核病人也逐年增加，MDR-TB病人治疗的治愈率最高仅为63%，治疗周期是普通结核病治疗6-8个月的3倍(18-24个月)，高治疗成本、长治疗周期、低治愈率是 MDR-TB 的特点［2，3］。
2009年世界卫生组织报告统计，全球目前有49万耐多药结核病患者，占结核病总患病人数的5%［4］，而中国每年新发耐多药患者约12万人［5］。
结核分枝杆菌相关γ-干扰素(TB-IGRA)监测推荐书
结核分枝杆菌γ -干扰素（TB-IGRA）检测[TB 检测发展趋势]据世界卫生组织( WHO)统计，我国是全球22个结核病高负担国家之一，在结核病防治工作还面临着诸多新的问题与挑战，近年来，我国每年报告肺结核发病人数约130 万，且患者人数逐年增加，始终位居全国甲乙类传染病的前列。
国家已出台相关文件要求加强结核病防治工作，要求及早发现、治疗疾病，遏制结核病流行态势的出现。
而这无疑对结核的诊治水平提出了更高的要求。
但迄今为止，临床上用于结核分枝杆菌感染的诊断方法仍存在许多不足。
首先，结核菌素皮肤试验( TST)作为一种较常用的方法，但其特异性不够好，不利于在中国这类将卡介苗(BCG)作为常规接种疫苗的国家推广，同时，TST 对潜伏性结核分枝杆菌感染的敏感性一般，对于免疫抑制者的检测结果亦难以确定；其次，细菌学诊断无论是涂片镜检还是细菌培养，其检出率都不超过50%，灵敏度十分有限；核酸诊断虽然灵敏度大幅提高，但该方法具有成本高、操作复杂、对实验条件及技术人员要求高、肺外结核病人取样困难等特点，因而很难得到大面积推广。
近年来，一类用于诊断结核分枝杆菌感染的新方法进入了人们的视线——干扰素释放试验(Interferon Gamma Release Assay，IGRA)。
这类试验采用Elisa／Elispot(酶联免疫吸附／酶联免疫斑点)方法，定量检测检测全血／外周血单核细胞在结核菌特异性抗原刺激下释放γ -干扰素的水平，用于诊断潜伏性结核分枝杆菌感染以及结核病。
目前这类试验中，有两种较为成熟的方法，即QuantiFERON—TBGOLD 试验(QFT-G)和T-SPOT TB 试验。
其对应的方法和试剂盒先后被美国FDA 批准应用于临床，美国CDC 为其制定了使用指南。
然而，进口试剂的高成本，使得这些方法难以在国内得到广泛应用，而传统方法又存在诸多不足，因此，国内各大医疗机构及患者对一种性能稳定、质量可靠的优秀国产试剂的需求呼之欲出。
分枝杆菌分离培养和药敏试验
总
43.5
19.7
42.6
15.3
51.0
21.2
29.1Байду номын сангаас
13.1
23.2
7.9
26.9
8.8
45.0
12.6
22.2
5.3
8
分枝杆菌种类
分枝杆菌(Mycobaterium)迄今报道有100多个 种。《伯杰系统细菌学手册》将分枝杆菌军菌 种划分为两大类：缓慢生长分枝杆菌与快速生 长分枝杆菌。在营养丰富的培养基上，接种很 稀的新鲜培养物，在适宜的培养温度下，7天 以上肉眼可见单个菌落，称为缓慢生长分枝杆 菌，其代表菌种是结核分枝杆菌 (M.tuberculosis).在上述条件下，7天以内肉眼 可见单个菌落，成为快速生长分枝杆菌。
分离培养的注意事项
选择痰标本中脓性、血样、干酪样的部分进行 培养阳性率较高。
从加入前处理液到接种的时间不得多于20分钟. 涡旋振荡、离心、倾倒上清液、接种时容易产
生气溶胶，应注意使用安全仪器，正确操作。 发现培养基上菌落生长需经抗酸染色确认后方
可报告阳性。
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分离培养的优点
敏感性较直接涂片法高，理论上10~100条菌/ 毫升可检出阳性；
胸腹水,支气管灌洗液标本 参照痰标本 处理办法.
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去污染处理(其他标本)
脑脊液 无菌操作收集的脑脊液,置冰箱或室温 24h,待薄膜形成后将薄膜接种到L-J培养基;或 将脑脊液 在无菌操作环境中3000r/min离心30 min,取沉淀直接接种到L-J培养基.非无菌操作 采集的脑脊液标本,离心后的沉淀进行碱处理 [与等倍量4%氢氧化钠（NaOH)混合,处理 10~15min]后接种于酸性L-J培养基