基因工程实验报告

基因工程实验报告

姓名：杜琳颖学号：2017051141 学院：生命科学院专业：生化与分子一、实验目的

学习并掌握从目的基因克隆到蛋白质表达的实验流程及原理。

二、实验流程

实验一、质粒提取载体DNA提取及酶切鉴定

一、实验目的

学习质粒的酶切及电泳分析。

二、实验原理

质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA 分子。它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。目前，经人工改造的质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。

质粒DNA 的提取是依据质粒DNA 分子较染色体DNA 分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA 与大肠杆菌染色体DNA 分离。现在常用的方法有：碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理：利用染色体DNA 与质粒DNA 的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA 的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA 氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8 的乙酸钠将其pH 调到中性时，变性的质粒DNA 又恢复到原来的构型，而染色体DNA 不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA 与大分子RNA、蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。

限制性内切酶可以识别双链DNA 特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA 片段再连接。限制性内切酶对环状质粒DNA 有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA 为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA 的相对分子质量。

三、实验材料、仪器及试剂

（一）实验材料

含载体质粒pET28a的大肠杆菌

（二）试剂

1、LB 液体培养基

2、质粒提取试剂盒(天根生物科技)

3、TBE 缓冲液

4、点样缓冲液Loading buffer（10×）

5、琼脂糖

6、NcoⅠ酶，XhoⅠ酶(Takara)

7、DNA回收纯化试剂盒（天根生物科技）

（三）仪器

1、Eppendorf 管、离心管架

2、10，50，200，1000 μL 微量加样器

3、Eppendorf台式高速离心机

4、电泳仪系统

5、恒温水浴箱

6、凝胶成像仪

7、摇床等

四、实验步骤

（一）质粒提取

1、柱平衡步骤：向吸附柱CP3 中（吸附柱放入收集管中）加入500μL 的平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2、取1.5 mL 过夜培养的菌液（已备好），加入1.5mL离心管中，使用12,000rpm离心1min，尽量吸除上清，再收集一次菌体（根据浓度选择）。

3、向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL 溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

4、向离心管中加入250μL 溶液P2，温和地上下翻转6-8 次使菌体充分裂解。

5、向离心管中加入350μL 溶液P3，立即温和地上下翻转6-8 次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10min，此时在离心管底部形成沉淀。

6、将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3 中（吸附柱放入收集管中），注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3 放入收集管中。

7、向吸附柱CP3 中加入600μL 漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3 放入收集管中。重复漂洗一次。

8、将吸附柱CP3 放入收集管中，12,000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

9、将吸附柱CP3 置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50μL 洗脱缓冲液EB，室温放置2 min，12,000rpm离心2min 将质粒溶液收集到离心管中。

（二）琼脂糖凝胶电泳法检测提取的质粒DNA

吸取4μL所提质粒，加入2μL loading buffer 混匀后点样至0.8%琼脂糖凝胶中，电泳20min左右后拿出放入凝胶成像系统，根据图像判断所提质粒浓度及质量。

（三）质粒载体DNA 酶切

1、按下表将各种试剂分别加入每个Eppendorf 管中。

2、加样后混匀，置于37℃水浴中，保温5 h。

3、吸出8μL酶切产物，加入2μL loading buffer 混匀后点样琼脂糖凝胶电泳，鉴定

酶切是否正确，两个酶切位点之间片段大约150bp左右，理论上双酶切电泳应出现两条带，一条较亮的长片段和一条很暗的小片段。而单酶切只出现一条带，即线性化载体。同时应点样质粒作为阳性对照。

4、确认酶切正确后，在酶切产物中加入loading buffer 终止反应，准备胶回收。

（四）载体片段的获得

1、取酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测确认酶切完全后，然后进行载体片段的回收。

2、制备胶回收的琼脂糖凝胶。

3、将双酶切样品加入点样空中，进行电泳分离。

4、将凝胶板染色后，在凝胶成像仪中切取DNA 大片段。

5、柱平衡步骤：向吸附柱CB2 中加入500μL 平衡液BL，12,000rpm离心1 min，倒

掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

6、将单一的目的DNA 条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。

7、向胶块中加入等倍体积溶胶PC，50℃水浴放置10 min，其间不断温和地上下翻转

离心管，以确保胶块充分溶解。

8、将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中

的废液，将吸附柱CB2 放入收集管中。

9、向吸附柱中加入600μL 漂洗液PW，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，

将吸附柱CB2 放入收集管中。重复漂洗一次。

10、将吸附柱CB2 放回收集管中，12,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱

CA2 置于室温放置数分钟，彻底地晾干。

11、将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加35μL洗脱缓冲液

EB，室温放置2min。12,000rpm离心2min，收集DNA溶液，此就为连接所用载体Vector。

五、实验结果及分析

1.质粒提取检测结果