重组PP150抗原用于胶体金免疫斑点技术检测抗HCMV_IgM

研究原著 文章编号:1000-2790(2005)19-1764-04重组PP150抗原用于胶体金免疫斑点技术检测抗HC MV -Ig M王 清1,王锡波1,徐龙强1,于维林1,于 红2,张文卿2(青岛大学医学院:1附属医院检验科,2病原生物学教研室,山东青岛266003)收稿日期:2005-01-09; 修回日期:2005-02-28基金项目:山东省教育厅科研基金(J 97k51)通讯作者:张文卿.Te.l (0532)88011309Em ai.l z hang w enq i ng01@ya -hoo .co 作者简介:王 清(1968-),男(汉族),山东省淄博市人.硕士.Te.l (0532)82911511 Em ai.l w angq i ng0533@sohu .co mR eco m bi nant PP150of hu m an cyto -m egalovirus as antigene for colloi dalgol d i m m uno -dot assay to detect HC -MV -Ig M i n seraWANG Q i ng 1,WAN G X i -B o 1,X U L ong-Q i ang 1,YU W ei -L i ng 1,YU H ong 2,ZHANG W en -Q ing 21D epart m ent of C li n ical L aborato ry ,A ffiliated H ospita ,l2D epart m ent o f M ed icl M icrobio l ogy ,M ed i ca l Co llege ,Q i ngdaoU n i versity ,Q i ngdao 266003,Ch i na【Abstract 】A I M:To us e recomb inan t pp 150o f human cyto -mega lovirus (HC MV )in co llo ida l go l d m i m uno -do t assay (CG I DA )f o r t he de tection o f HCMV-I gM in sera .M ETH-OD S :A frag m ent o f gene cod ing f o r pp 150antigen ep it opes (840-1048aa)was exp ressed in E.co li and t he f usion p ro t e in wa s pur ifi e d .The results we re co m pa red w ith t hose o f specifi c an tibod i e s EL I SA Ig M.RE SULT S :Recomb inant an ti g en CG I DA had a good agreemen t (96.0%)w it h EL I SA k i.t The spec ificity o fCG I DA w as 100%and t he sen -sitivit y was 74.2%.CONCLU SI ON :Recomb inan t pp 150is an e ff ective and va luab le an tigen used in CG I D A f o r de t ec -ting HCMV -Ig M.【K ey word s 】cyto m ega lovirouses ,human ;gene pp 150;p ro -karyo tic exp ress i o n ;go l d co llo ida;l m i m uno -do t assay【摘 要】目的:探索应用重组人巨细胞病毒(HC M V )PP150抗原用于免疫滴金技术检测血清中抗H C MV-Ig M 的诊断价值.方法:PCR 扩增H C MV pp150抗原决定簇(840~1048aa)编码基因片段,插入原核表探索应用重组人巨细胞病毒(H C -M V )PP150抗原用于胶体金免疫斑点技术(CG IDA )检测血清中抗HC M V-Ig M 的诊断价值.达载体p M A -l p2,转化宿主菌E.co li ,诱导表达及纯化.重组抗原CG I DA 与酶联免疫吸附试验(EL IS A )试剂盒对比检测.结果:重组抗原CG IDA 与EL IS A 试剂盒比较,符合率达96.0%;CG IDA 检测HC M V-Ig M 的敏感度为74.2%,特异性为100%.结论:重组抗原pp150用于CG I DA 对HC M V 的早期诊断,具有较好应用价值.【关键词】巨细胞病毒,人;基因pp150;原核表达;胶体金;免疫斑点法【中图号】R373 【文献标识码】A0 引言胶体金免疫斑点法(co ll o idal gold i m m uno -dot as -say ,CG I DA )快速简便,吕贯廷等[1]成功地建立了CGI DA 检测H C MV-Ig G 的方法,但国内关于抗人巨细胞病毒(H C MV )-Ig M 的临床检测的报道较少.我们用基因工程方法合成HC MV pp150(841~1084aa)抗原,以胶体金为标记手段,建立了检测血清抗pp150I g M 抗体的胶体金免疫斑点法.1 材料和方法1.1 材料 HC MV AD169毒种、宿主菌E.coli DH 5 ,原核表达质粒p MA-l p2为山东省分子病毒学重点实验室提供.E co R I ,H in d Ⅲ,T4DNA L i g ase ,W izard PCR Preps DNA Purification Syste m,W izard PlusM i n i p reps DNA Prurification Syste m s ,I PTG ,硝酸纤维素膜(孔径0.65 m )等均购自Pro m ega 公司.麦芽糖结合蛋白(MBP)纯化树脂购自B io -Rad 公司.抗人-I g M 及HC MV-I g M ELISA 试剂盒由山东省分子病毒学重点实验室提供.H C MV Ig M 阳性血清120份经青岛大学医学院附属医院妇产科研究室提供(晶美生物工程有限公司人巨细胞病毒Ig M ELISA 试剂盒检测);266份临床血清采自青岛大学医学院附属医院正常孕妇.正向引物:5 TGGCG ↓AATTCAC -CTC TTCCGC TTCTTCGGC3 ,反向引物:5 GTGTTA ↓AGCTTCTATTCCTCCGTGTTCTT3 ,PCR 产物长度为651bp,产物上游酶切位点为E co R1,下游酶切位点为H in d Ⅲ.1.2 方法1.2.1 重组pp150抗原的制备 HC MV AD169株接种人胚肺二倍体细胞,待细胞出现病变( )后,收集细胞,提取总DNA 作为模板,通过PCR 扩增出HC -MV pp150多个强抗原决定簇区目的基因.分别用限制性内切酶E co R I,H in dⅢ酶切上述扩增片段和质粒p MAL-p2,回收酶切产物和载体片段,然后进行连接反应.将连接产物转化感受态宿主菌 E.co li DH5 ,挑取经鉴定的单个菌落,37 培养至A600n m约为0.5.加I T PG分别诱导1,2,3,4,5h后收集菌体,在50mm o l/L T ris-HC l(p H8.0)溶液中超声波裂解(12s/次,共3次),将沉淀溶于包涵体溶解缓冲液中(8mo l/L尿素,100mm ol/L NaC,l1mm ol/L EDTA,0.1mm o l/L P M SF,50mm o l/L T ris-HC,l p H 8.0),4 ,6000g离心10m i n,回收上清.每隔1h用复性液(10mm o l/L GSH,2mmo l/L GSSG,50 mmo l/L Tris-H C,l p H8.0),将尿素浓度逐步降低到0.5mm o l/L,4 复性过夜,在透析液(50mm ol/L Tris-H C,l p H8.0)中4 充分搅拌去除剩余尿素.4 ,6000g离心10m in,取上清,复性蛋白1.5mL (0.5g/L)上样,用麦芽糖结合蛋白(M BP)纯化树脂纯化(具体操作见说明书).应用150g/L SDS-PAGE 检测表达及纯化情况.1.2.2 CG I D A试剂盒的置备及检测方法 在300 mL双蒸水中加入10g/L枸橼酸钠4.5mL,煮沸后迅速加入0.2g/L氯金酸3.6mL,继续煮沸10~15 m in,冷却后用0.1m o l/L碳酸钾调p H值至8.5;取已纯化抗体作线性稀释,每管加入制备好的胶体金溶液1mL,静置2h,以保持红色不变的最小量管为胶体金与待标记蛋白的最适比例;取已纯化的抗原多肽与水溶性碳化二亚胺活化过夜,用PBS透析1d;以3 mL胶体金溶液为基准,加入抗人Ig M迅速混匀,15 m in后加入10g/L稳定剂7.5m L,混匀,以1000g 10 离心40m in,弃上清夜,沉淀重悬于等体积10g/ L稳定剂(p H7.2~7.4)中,1000g10 离心30m in,弃上清液,沉淀用1/5体积恢复液恢复.用孔径为0.65 m的硝酸纤维素膜制成1c m直径的方片, PP150蛋白、H C MV-Ig M(阳性对照)、PBS(阴性对照) 3 3的点阵滴定后,将活化抗原稀释至浓度为0.25 m g/L,直接滴加于载体膜上,室温干燥后用10mL/L 牛血清白蛋白(BSA)封闭,再用10 m ol/L PBS洗涤3次,干燥后于4 中保存.将已凉干的抗原膜片装入塑料小盒中,盒内充满吸水材料;在膜盒的中央分别滴加血清标本,人H C MV-Ig M,PBS各15 L,待渗入后用10 m ol/L PBS洗涤3次,加入胶体金标记抗人I g M,观察结果,阳性者在膜中央出现红色斑点,阴性者则无红色斑点形成.HC MV-I g M ELIS A的检测按试剂盒说明书操作.CGI DA检测120份H C MV-Ig M阳性血清标本,同时检测100例单纯疱疹病毒Ⅰ型Ig M阳性血清标本.免疫斑点检测试剂在4 下放置6m o,每月检测抗HC MV-I g M阳性及阴性血清各30份.于37 和4 均放置1w k,然后分别检测阳性和阴性血清各50例作稳定性试验.2 结果2.1 目的基因的PCR扩增 PCR扩增产物长度为651bp,其中目的基因为624bp,扩增产物两端引入限制性内切酶识别位点序列、保护性碱基共27bp.核苷酸片段大小与预期值一致,阴性对照未增出特异性片段(F i g1).1:N egati ve con tro;l2:PCR a m pli fi cati on product;M:DNA m ark er.F i g1 PCR a m plifica tion produc t 图1 PCR产物2.2 原核重组表达质粒的鉴定 少量碱裂解法快速提取重组质粒经Eco R I及H in dⅢ双酶切后电泳见2条带,分别约为6.7kb和624bp,与预测结果一致,证明重组克隆成功(Fig2).M:M ar k er DL2000;1:PCR p roduct;2,3:p M AL-p2/E co R I+H i n dⅢ; 4-8:p M AL-p2-pp150/E co R I+H in dⅢ.F i g2 Identifica tion of p M AL-p2-pp150by restr i ction edonucle-ases图2 重组质粒p M AL-p2-pp150酶切鉴定2.3 S D S-PAGE蛋白电泳及考马斯亮蓝染色鉴定重组蛋白的检测 分析菌体裂解液,表明诱导表达产物主要存在包涵体中.SDS-P AGE蛋白电泳显示p MA-l P2-PP150克隆全菌裂解物在M r64000的位置出现一条蛋白条带,而未诱导的重组质粒转化菌在相应位置的无蛋白条带;含质粒p MA-l P2的诱导菌则在M r43000位置出现一条带.电泳结果与理论预测值相一致.另外,从蛋白带型来看,诱导5h的融合蛋白表达量最高,经凝胶成像系统扫描分析,融合蛋白含量占全菌体的10%.纯化的融合蛋白经SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色后,融合蛋白M r64000位置出现一清晰蛋白条带,p MAL-p2转化菌诱导表达的M BP则出现于M r43000位置.2.4 重组蛋白的抗原性 随机挑选15份I g M阳性患者血清进行W ester n印迹检测,其中12份与表达的融合蛋白有反应,检测的20份Ig M阴性血清均为阴性,表明此融合蛋白识别Ig M特异性抗体的识别率为80%.阳性血清与M BP无反应.2.5 CG I DA检测HC MV Ig M 纯化重组抗原CG I D A检测正常孕妇血清标本266份,其中14份阳性,阳性率为5.3%,与ELI SA试剂盒检测阳性率为6.0%比较,符合率为96.0%(Tab1).表1 重组抗原CG IDA与EL IS A检测结果比较(份)T ab1 Co m parison of detection resu lts bet w een CG I DA and EL ISAM ethod Reco m binant an ti gen CGI DAPos iti ve NegativeTotalEL ISA Positive11516N egati ve3247250Tot al142522662=0.125.2.6 CG I DA检测HC MV Ig M敏感性与特异性 HC MV I g M阳性血清标本120份中,检出阳性标本89例,同时检测100例单纯疱疹病毒Ⅰ型I g M阳性血清标本,结果均为阴性.可见,重组抗原CGI DA检测HC MV I g M方法的敏感性为74.2%,特异性为100%.免疫斑点检测试剂在4 下放置6m o,每月检测抗HC MV I g M阳性及阴性血清各30份,其特异性和敏感性非常稳定.于37 和4 均放置1wk,然后分别检测阳性和阴性血清各50例,二者差异没有显著性.3 讨论血清特异性I g M检测是诊断急性或活动性HC-MV感染的重要方法,但是由于迄今采用的抗原仍是通过细胞培养获得的全病毒抗原,而HC MV病毒本身含有与单纯疱疹病毒和细胞膜成份(m p60)等的交叉抗原,病毒虽经纯化也难以避免由于交叉抗原引起的非特异反应.同时由于HC MV培养周期长和病毒产量低等原因使HC MV纯化困难较大.我们克服了用感染的人胚肺二倍体细胞培养物制备全病毒抗原需严格的防护条件、产量有限、稳定性欠佳、与其他疱疹病毒有交叉反应等不利因素.DNA重组技术的发展使得大量选择性地制备病毒抗原或抗原性片段成为可能,研究表明,将一种或几种重组蛋白作为抗原即可检测H C MV阳性血清. Ro lf等[2]用PCR方法扩增HC MV8种不同开放读码框架的DNA片段,并表达了相应的重组蛋白,免疫印迹结果表明只有病毒蛋白的3种重组多肽对血清学诊断是必需的.PP150的495~691aa片段是确诊HC MV既往感染的最适抗原(I gG结合表位);而862~1048aa片段(Ig M结合表位)是急性感染的最佳血清学标志物之一.国内周铁群及王清等研究证实,H C MV主要结构蛋白PP150的羧基末端部分是HC MV-Ig M的重要结合表位,在检测H C MV原发及急性期感染中起着极其重要的作用[3,4].我们构建了含有H C MV特异性强抗原决定簇片段的重组抗原(841~1084aa),用W ester n-b lot检测了15份HC MV Ig M阳性患者的血清,其中12份发生阳性反应,阳性识别率为80.0%.目前国内检测血清抗HC MV-Ig M主要采用间接ELI SA法,但该法检测所需时间长,操作步骤繁琐、易受类风湿因子等的影响,所以结果不稳定.CGI DA与酶联免疫分析法比较[5]具有多方面的优点:①不需要酶标检测仪等仪器,更适合现场应用;②实验结果和胶体金试纸可长期保存;③省去底物反应这一步,加快了检测速度;④胶体金标记蛋白质时金颗粒与蛋白分子之间的结合属于物理吸附过程,所以整个标记过程对蛋白质的生物活性影响很小,且易获得较高的标记率;⑤胶体金不属于生物活性物质,干扰检测结果的因素将大大减少.本研究比较了CG I D A与商品化ELIS A试剂盒检测结果,符合率为96.0%,敏感性为74.2%,特异性100%,研究结果表明重组抗原pp150用于CGI DA对HC MV的早期诊断,具较好的应用价值.【参考文献】[1]吕贯廷,郭晏海,卢 冰,等.胶体金免疫斑点法检测人巨细胞病毒pp150抗体[J].临床检验杂志,2002;20(6):358-359.L GT,Guo YH,Lu B,et a l.D etecti on of Ig M anti bod ies t o HCMV PP150by C ol o i dalG ol d I m m un odotti ng A ss y[J].Ch i n J C li n La b Sc i,2002;20(6):358-359.[2]RolfV,Vornhagen R,Plach ter B,et al.Earl y serod i agnosis acutehum an cyto m ega l ov i ru s i n fection by en z y m e-li nk ed i m m unos orben t assay u si ng reco m b i nan t anti gens[J].J C lin M i crobio,1994;32(4):981-986.[3]周铁群,沈月雷,邱 平,等.人巨细胞病毒大外膜磷蛋白pp150羧基末端的高效表达及初步应用[J ].微生物学免疫学进展,1999;27(2):28-31.Zhou TQ,Shen YL ,Q i u P ,e t a l .H i gh effici en cy prokaryotic ex -pression of t h e carbox ter m i nus of human cyto m egal ov i ru s phosphory-l ated tegum en t protei n pp150and p reli m i nary app lication for detecti n ofHCM V Ig M [J ].M ic robiol I mmunol P rogress ,1999;27(2):28-31.[4]王 清,张文卿,于 红.人巨细胞病毒pp150基因的原核表达及抗原性分析[J].青岛大学医学院学报,2003;39(1):23-25.W ang Q,Zhang WQ,Yu H.Prokaryotic exp ressi on of hum an cyt o -m egalovirus pp150gene and its an ti gen ici ty analys i s[J].A cta Aacad M e d Q i ngd ao Univ ,2003;39(1):23-25.[5]陈小锋,刘曙照.胶体金标记免疫分析及其在小分子化合物快速检测中的应用[J].药物生物技术,2004;11(4):278-280.Ch en XF ,L i u SZ .C oll oidalGol d Lebelling I mm unoass ay and it s ap -pli cati on i n rap i d det ecti on of s ma llm olecu le[J].Pharm B iot ech ,2004;11(4):278-280.编辑 井晓梅经验交流 文章编号:1000-2790(2005)19-1767-01肿瘤化疗中PICC 导管的长期应用张美丽,胡宁丽(西安交通大学第一医院肿瘤内科,陕西西安710061)收稿日期:2004-12-16; 修回日期:2005-03-18作者简介:张美丽(1964-),女(汉族),陕西省西安市人.主管护理师.T e.l (029)85324036 Em ai.l w eiyongchang8@163.co m【关键词】中心静脉导管;化疗;护理【中图号】R 730 【文献标识码】B1 临床资料 2004-03/2004-08将外周插管的中心静脉导管(per i phera lly i nserted cen tral ca t hete r ,P I CC)运用于肿瘤化疗患者38(男29,女9)例,年龄35~73(平均41)岁.其中肺癌17例,肝癌6例,乳腺癌9例,淋巴瘤5例,胃癌1例.初发初治30例,反复化疗8例.采用美国巴德公司生产的蓝色P ICC 导管,管长60cm,管腔容积1mL ,以后采用美国A rrow 公司生产的豪华装4F r 导管.插管前紫外线消毒治疗室,光线应充足,并备好用于穿刺的物品.P ICC 穿刺包、无菌手套、碘酒、乙醇、医用棉签、皮尺、止血带、无菌肝素生理盐水、可莱福输液接头、20mL 注射器、静脉穿刺包、康乐保透明贴膜、A rrow 豪华包.了解患者目前病情、精神意识状态、生命体征;检查拟穿刺部位血管充盈程度;询问患者有无凝血功能异常,查阅病历以排除患者血小板计数异常及凝血功能障碍;评估患者心理状态(有无恐惧、焦虑),合作程度;向患者及家属讲解P ICC 插管知识,包括置管的目的,方法及优点,请已作P ICC 插管的患者做示范以消除其紧张心理;注意患者有无P I CC 插管禁忌证:如上腔静脉综合征、乳腺癌患肢等.患者预穿刺侧上肢与躯干成角90 ,测量自穿刺点至右胸锁关节,然后向下至第3肋间的总长度为导管置入长度;建立无菌区,预冲导管;消毒范围为穿刺点上下各10c m,两侧到臂缘;静脉穿刺进针15 ~30 ,见回血后穿刺针与血管平行,继续推进1~2mm,然后保持针芯位置,单独向前推进插管鞘,避免由于进钢针造成血管壁穿透;拍胸片确定导管位置:导管尖端应在上腔静脉,距心脏3c m 处;撤出导管:于靠近穿刺点处捏住导管,缓慢抽出导管,压迫局部5~10m in ,消毒穿刺点后敷料包扎24h ,检查导管是否完整.全部患者一次插管成功,导管保留时间最短11d .其中1例头静脉插管35cm 处,因受阻未再深进.本组病例中,右上肢置管18例,左上肢置管20例,贵要静脉29例,肘正中静脉6例,头静脉3例.有5例在术后1d 内局部有红、肿、痛;3例在置管3~5d 内发生机械性静脉炎;1例因感染表皮葡萄球菌而拔管,无一例发生化疗药物渗漏.2 讨论 P ICC 操作方便,并发症较少,能减轻患者痛苦[1],其成功的关键在于静脉的选择和局部穿刺的成功[2].肿瘤患者机体多处于高凝状态,插管时动作应轻柔,避免擦伤血管内膜,置管后及输液完毕应立即用肝素盐水封管.若堵管,用尿激酶溶栓通管.置管后患者适当活动,促进血液循环以降低血栓发生率.在P ICC 开展早期,1例患者导管尖端细菌培养为表皮葡萄球菌感染,主要原因可能是没有及时换药,或操作不够熟练[3].现代化疗血管的选择应是粗大且弹性好,以免药物外渗造成肌肉、肌腱的坏死.P I CC 使用时间长,本组导管保留时间最短已达11d ,其导管末端留置在锁骨下静脉或上腔静脉,血流量大,化疗药物注入血管后很快被稀释,从而缓解了化疗药对血管壁的刺激,避免药物引起的浅静脉炎及外渗性损伤.P ICC 是一种全新的理念[4],国外已广泛使用.【参考文献】[1]Todd J ,H a mm ond P .Choice and use of peri ph erall y i nserted cen tralcathet ers by nurs es[J].P ro f N urse ,2004;19(9):493-497.[2]袁 玲,叶惠华,叶明枝,等.肿瘤病人PI CC 插管未到位所致并发症的原因分析及护理[J ].护士进修杂志,2004;19(2):178-179.[3]胡 洁.静脉导管留置时易忽视的感染危险因素分析[J].中华医院感染学杂志,2004;14(7):773-774.[4]Kum arM ,Am i n M.Th e peri ph erall y i nserted central venous cat he -ter ;friend or f oe ?[J].In t J OralM ax illofac Su rg ,2004;33(2):201-204.编辑 潘伯荣。