实验十二微丝观察荧光探针标记
实验报告-细胞骨架的荧光观察
细胞生物学实验报告实验三细胞骨架的荧光染色1引言实验目的1. 了解荧光探针的基本知识2．学习荧光显微镜的工作原理及使用方法3.掌握细胞核和微丝骨架的标记技术实验原理细胞骨架：细胞骨架是真核细胞中由蛋白质聚合而成的三维的纤维状网架体系。
细胞骨架包括微丝、微管和中间纤维。
细胞骨架在维持细胞形态，承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用。
鬼笔环肽是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反,只与聚合的微丝结合,而不与肌动蛋白单体分子结合。
它同聚合的微丝结合后,抑制了微丝的解体,因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。
Hoechst33342是一种亲脂性物质，能与DNA特异性结合的荧光探针，所以被大量用于活细胞的观察和定量的研究。
荧光激发和发射波长分别为350nm和461nm。
2实验仪器、试剂及操作步骤实验仪器荧光显微镜、载玻片、盖片、滴管、滤纸、35mm细胞培养皿（六孔板）、湿盒实验试剂PEM缓冲液、% Triton X-100、4%多聚甲醛、储存液:1mg/mL(溶于PBS)55nM Alex-phalloidin（鬼笔环肽）实验材料鼠胚成纤维细胞、鸡胚成纤维细胞实验步骤1.将原代培养的成纤维细胞放于于小盖玻片上，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中于37℃,5%CO2培养箱中培养至细胞融合度达70%～80%。
2.取出培养有细胞的小盖玻片，置于小平皿中用37℃预温 PEM轻轻漂洗3次。
3.加入37℃预温4%多聚甲醛固定15min 。
4.用37℃预温PEM漂洗3次。
5.加入 % Triton X-100通透处理约10min。
6.用37℃预温 PEM漂洗3次。
7.取一个洁净的载玻片，按照载玻片的大小在其上放置一条封口膜，在封口膜上上滴加10ul 55nMAlexa-568-phalloidin (绿)，将经上述处理的盖玻片细胞面向下孵育于染色液中，于湿盒中室温避光染色30min。
8.小心取下盖玻片，将其置于小平皿中（细胞生长的面朝上），用37℃预温PEM避光漂洗3次。
荧光探针与荧光标记引物
荧光探针与荧光标记引物荧光探针与荧光引物要提到荧光探针或者荧光引物，有⼀个基础概念需要⾸先明确，那就是荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)：⼀对合适的荧光物质可以构成⼀个能量供体(donor)和能量受体(accep tor)对,其中供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠，当它们在空间上相互接近到⼀定距离(1—10nm)时，激发供体⽽产⽣的荧光能量正好被附近的受体吸收，使得供体发射的荧光强度衰减，受体荧光分⼦的荧光强度增强。
能量传递的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等有关。
?⼀：⽔解探针法?TaqMan技术原理：除了⼀对特异性引物，TaqMan探针法增加⼀条和模版互补的基因特异性探针（通常20—30bp），探针上5''端和3''端分别标记了⼀个报告荧光基团（供体）和⼀个淬灭荧光基团（受体），在反应初始（探针完整）时系统激发供体⽽产⽣的荧光信号被临近的淬灭基团吸收，所以此时检测不到供体荧光信号；⽽当PCR过程中TaqDNA聚合酶扩增到探针结合模版的位点时，其5''-3''核酸外切酶的活性（也就是切⼝平移）切割掉探针5''端的报告基团——游离的报告基团远离淬灭基团，打破能量的传递，激发报告基团产⽣的荧光信号就可以被荧光检测系统检测到。
这样每扩增⼀条DNA链，就对应有⼀个游离的荧光分⼦（报告基团）形成，保证了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，因此对荧光信号进⾏检测就可以实时监控PCR的过程，准确定量PCR的起始拷贝数。
但是实际上探针较长使得两端基团距离较远，会导致荧光淬灭不彻底，⽽且淬灭基团也会产⽣不同波长的荧光，都会使得本底偏⾼.MGB技术?原理：针对Taqman探针荧光淬灭不彻底的问题，2000年美国ABI公司推出了⼀种新TaqMan探针——MGB探针（minorgroovebinderoligodeoxynucleotideconjugate,MGB-ODN)，3''端采⽤了⾮荧光性的淬灭基因——淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，⼤⼤降低了本底信号的⼲扰。
1.3.2 荧光探针
荧光探针1 荧光探针所谓探针(probe )，在生物、化学学科中是指生物化学实验室中用于指示特定物质(如离子、生物小分子、核酸、蛋白质、细胞结构等)的性质或物理状态的一类标记分子，或者一些仪器的探测器。
目前所说的荧光探针通常是指生物分析与化学分析中用于荧光信号输出的各类标记物，它可以为人们提供待测生物分子在生物体内或体外的存在、表达、分布等各种信息，对于整个生物个体中物质代谢过程的研究具有重要意义。
基于荧光标记物的荧光分析法具有快速、简便、灵敏度高等优点，在分析化学、生命科学、医学等领域受到研究者的广泛关注。
然而对于大多数被分析物来说，其本身可能没有荧光或者荧光很弱，这就需要将一些发荧光的物质与其偶联，从而对其进行分析和示踪。
目前荧光探针根据荧光来源主要包括三大类：第一类是有机小分子染料;第二类是以绿色荧光蛋白为代表的荧光蛋白；第三类是荧光纳米材料。
1.1 有机小分子染料早在1871年，德国科学家Adolph V on Bayer就合成了荧光素，这是科学家首次合成荧光探针。
目前，基于有机小分子的荧光探针在分析化学、生命科学领域中己经得到广泛应用，可用于离子和小分子的检测、蛋白质的标记、细胞成像等。
常见的有机荧光探针包括荧光素类、罗丹明类、花菁类、香豆素类和稠环芳烃类染料等。
这些染料大多含有发射荧光基团(如拨基、氮氮双键、碳氢双键等)和助色基团(经基、伯胺基、仲氨基、酞胺基、醚键等)。
其中仅吲哚菁绿和荧光素两种荧光染料被美国食品和药品监督管理局(FDA)批准在人体中使用。
基于有机小分子探针的生化分析应用主要分为直接法和间接法。
直接法是指利用探针本身与靶标的相互作用，使其荧光发生变化(荧光减弱、荧光增强、荧光蓝移、荧光红移等)(图1.1）。
如Yin课题组运用BODIPY ( 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene)作为原料，合成了可以快速高灵敏地响应铜离子的近红外荧光探针，且铜离子熄灭的荧光又能被重新加入的硫离子竞争得到恢复，因而构建了一个新颖的铜离子和硫离子逻辑门传感器；Li等以罗丹明B为原料，经过改性得到了高灵敏、专一性强且快速响应Fe3+的“off-on”型荧光探针。
无机化学荧光探针的设计及生物标记应用研究
无机化学荧光探针的设计及生物标记应用研究一、引言荧光探针是指利用物质在激发光作用下产生荧光这一现象来检测生物分子或药物等的一种化合物。
其中，无机化学荧光探针是一类化合物，其荧光探针通常由金属离子或金属配合物等组成。
这些探针在分析化学、生物学和临床医学等领域中得到了广泛应用。
本文主要介绍无机化学荧光探针的设计及其在生物标记应用中的研究。
二、无机化学荧光探针的分类及原理无机化学荧光探针的分类方式很多，但其主要分类方式有以下几种。
（一）金属离子探针这种探针的荧光信号来源于金属离子本身或其配体与底物结合后的荧光强度变化。
常见的金属离子可以分为镉、锌、钙、银、铬、铜、镍、铅等。
举例：Mg2+的探针取决于羧酸基的配体。
2-羟基异恶唑基甲酸（HIBA）是一种Mg2+荧光探针。
Mg2+可以通过与HIBA的羧酸基形成络合物，而HIBA所产生的荧光信号则对应着Mg2+的其它信息，如浓度、存在形式等。
（二）金属配合物探针该探针的信号源于金属配合物中的荧光基团。
这些荧光基团的螯合适性依赖于它们的受体结构和取代基的类型。
金属离子包含配合物中的金属离子，它们可以影响其空间和电荷分配，从而对配合物的荧光造成较大影响。
举例：钌配合物L2X2具有主要的Ru(II)-polypyridyl (pp)结构，其中的结构基元[3-N,N′-bis(pyrid-2-yl)-11-diphenylamino-fluorene-9-ylidene]amine ([L1H]+) 作为了一种新型的配体。
配体L1包含一个中心螺旋骨架，主要的结构基元[3-N,N′-bis(pyrid-2-yl)-11-diphenylamino-fluorene-9-ylidene]amine ([L1H]+)和多个辅助Ligand组成。
相较于类似钌配合物，L1CN-Mo配合物更容易产生荧光并且更精确地响应线性范围。
三、生物标记应用研究荧光探针在生物体系中的应用主要体现在生物标记上。
荧光探针在生物分析中的作用
荧光探针在生物分析中的作用随着生物学研究的不断深入，越来越多的生物分析技术被广泛应用。
其中，荧光探针就是一种广泛应用的生物分析技术。
荧光探针在生物分析中的作用可以说是非常重要的，下面我们就来详细探讨一下。
一、荧光探针的概念荧光探针是指具有荧光性质的、与生物分子相结合并可以产生信号响应的小分子或大分子探针。
荧光探针可以用来检测生物分子如蛋白质、核酸、糖等的某些特定性质或状态，通常被广泛应用于生物药物研究、疾病诊断、基因水平检测和化学生物学领域。
荧光探针的原理是基于荧光现象，当荧光探针与生物分子结合后，在一定的波长下可以发出特定的荧光信号。
生物分子的特定性质或状态可以通过检测荧光信号的强度、波长等变化来获取。
二、荧光探针在生物分析中的应用1. 荧光探针在疾病诊断中的应用荧光探针可以用来检测生物分子的特定性质或状态，可以应用于疾病的诊断、筛查和治疗。
例如，常见的荧光PCR技术就是一种基于荧光探针的特异性检测技术，用于检测病毒、细菌或肿瘤细胞等特定的生物学信号。
在该技术中，荧光探针与生物分子序列匹配，结合后发出荧光信号，从而实现疾病诊断。
2. 荧光探针在细胞成像中的应用荧光探针也可应用于细胞成像领域。
例如，在荧光显微镜下使用荧光标记的探针，可以进一步观测蛋白质、细胞分子的运动过程、分布和转化等，并可对生物体内的活动情况进行定量测量，如细胞增殖、药物吸收等。
3. 荧光探针在制药研发中的应用荧光探针在药物研发中也有重要应用。
荧光探针可以被设计成与靶标分子非常特异性地结合，借此实现研发与靶标特异性相关的药物分子的设计、评价和优化。
如药物-靶标相互作用的表征、药物在生物体中药代动力学研究中的标记、特定药物在人体内的淬灭动力学研究等。
三、荧光探针的发展趋势1. 荧光探针的灵敏度和特异性不断提高同时，随着荧光探针的灵敏度和特异性的不断提高，越来越多的生物分子可以被检测和识别。
例如，利用高灵敏度的荧光探针能精确定位癌症灶，帮助医生在微创手术中实现肿瘤灶的彻底切除。
化学实验知识：新型荧光探针在细胞成像中的实验研究和应用探究
化学实验知识：“新型荧光探针在细胞成像中的实验研究和应用探究”随着科技的不断进步，新型荧光探针在生命科学领域的应用越来越广泛。
荧光探针是一种能够转换能量形式的分子，它可以通过吸收光子来激发分子，进而使其发出荧光信号。
在细胞成像中，荧光探针可以用来标记特定的生物学分子或细胞结构，从而实现对生物活动的研究和监测。
一、荧光探针的分类根据生物学分子的结构特点，荧光探针可以分为分子探针和荧光蛋白探针两类。
前者是通过分子设计来实现对特定分子的选择性识别，后者则是利用天然存在的荧光蛋白来实现对生物活动的监测。
荧光蛋白探针在分子探针所无法涉及的研究领域，例如活细胞刺激响应和蛋白定位等，具有无可比拟的优势。
二、荧光探针的作用机理荧光探针的作用机理基于荧光的发光原理。
荧光物质的发光强度与其激发光子的数目成正比，因此，可以通过调整激发光的波长和强度来控制荧光探针的发光强度。
同时，荧光探针的荧光发射波长也是定量检测的关键信号，因为其波长在紫外到红外之间，既不损害细胞，也不会产生背景光影响测量。
三、荧光探针在细胞成像中的应用荧光探针在细胞成像中可以应用于多个方面，包括细胞分子标记、蛋白质定位、蛋白质互作研究等。
这些应用可以通过不同的荧光探针和成像技术来实现。
例如，针对肿瘤等细胞器缺陷场景，可以利用抑制特定靶标蛋白质的siRNA物质，然后通过体外转染技术将其投射至肿瘤等细胞，再根据密度梦境生物荧光模式，选择荧光探针进行标记等技术，实现肿瘤细胞形态结构、基因、信号分子的研究。
再如，利用信封融合等生物学技术，构建了可在活细胞端粒中标记telomerase的荧光探针，对于因年龄增长而导致的人体衰老相关疾病研究也有了越来越准确的诊断手段。
四、新型荧光探针的发展趋势新型荧光探针的发展趋势是向多功能、高灵敏度和高选择性方向发展。
新一代荧光探针不仅可以在单个分子水平上检测和追踪生物分子的运动和互作，还可以实现高通量的生物分子图像分析和定量化研究。
组织荧光探针技术步骤
组织荧光探针技术步骤一、引言荧光探针技术是一种广泛应用于生物医学研究领域的分子探针技术。
组织荧光探针技术是其中的一种，它可以用于研究生物体内特定组织或细胞的分子结构、功能和代谢等方面。
本文将详细介绍组织荧光探针技术的步骤。
二、材料准备1. 组织样本：需要研究的组织样本，可以是活体组织或固定后的组织切片。
2. 荧光探针：选择适合研究对象的荧光探针，如DNA染料、蛋白质标记剂等。
3. 显微镜：用于观察和拍摄荧光信号的显微镜。
4. 激光器：用于激发荧光探针发出荧光信号的激光器。
5. 滤波器：选择适合荧光信号波长范围的滤波器，以增强荧光信号和降低背景噪声。
三、样品处理1. 活体组织样品处理：将活体组织样品冷冻或固定后，进行切片或裂片处理，以便于荧光探针的穿透和染色。
2. 固定组织样品处理：将固定后的组织样品进行脱水、透明化和包埋等处理，以便于荧光探针的穿透和染色。
四、荧光探针染色1. 染色溶液制备：根据荧光探针的种类和浓度要求，制备相应浓度的染色溶液。
2. 染色操作：将组织样品放入染色溶液中，在恰当的温度下静置一段时间，使荧光探针进入细胞内部并与目标分子结合。
3. 洗涤操作：将染色后的组织样品进行洗涤，以去除未结合的荧光探针和背景噪声。
五、显微镜观察1. 显微镜设置：选择适当的激发波长和滤波器，调整显微镜参数以获得最佳图像质量。
2. 观察操作：在显微镜下观察样品，并记录荧光信号的位置、形态和强度等信息。
六、数据分析1. 图像处理：使用图像处理软件对荧光图像进行增强、去噪和分割等操作，以提高荧光信号的质量和准确性。
2. 数据统计：对荧光信号进行定量分析，包括信号强度、面积、形态和分布等参数的统计和比较。
七、结果解释根据数据分析结果，结合研究问题和假设，对实验结果进行解释和讨论，并提出相应的结论和展望。
八、总结组织荧光探针技术是一种重要的生物医学研究手段，它可以用于研究生物体内特定组织或细胞的分子结构、功能和代谢等方面。
荧光探针在活细胞成像中的应用研究
荧光探针在活细胞成像中的应用研究荧光探针是一种用于活体细胞成像的重要工具，其广泛应用于生物医学研究、药物开发和临床诊断等领域。
本文将探究荧光探针在活细胞成像中的应用研究，包括荧光探针的基本原理、常用的荧光探针分类和其在活细胞中的应用。
一、荧光探针的基本原理荧光探针是一种通过吸收外部光源而发射特定波长的光的物质。
其基本原理是分子在受到激发光源的刺激后，发生能级跃迁，从高能级跃迁到低能级释放出荧光。
荧光探针可以通过与特定的分子靶点相互作用来实现对其进行选择性标记和成像。
二、常用的荧光探针分类及其特点1. 核酸染料类荧光探针核酸染料类荧光探针是一类能够选择性地与DNA或RNA结合并发出荧光的染料分子。
常见的核酸染料类荧光探针包括乙啶溴化物（EtBr）、SYBR Green、DAPI等。
这些荧光探针可以用于核酸分子的定量、定位和检测等应用。
2.pH敏感型荧光探针pH敏感型荧光探针是一类能够根据环境酸碱度变化而改变荧光颜色或强度的探针。
常用的pH敏感型荧光探针有荧光素黄（FLYO）、羟基萘醌（HNQ）等。
这些荧光探针可以用于检测细胞内pH值的变化，从而研究细胞内的酸碱平衡及其与疾病的关系。
3. 钙离子指示剂钙离子是细胞内重要的信号分子，荧光探针可以通过与钙离子结合而发出荧光信号，实现对钙离子浓度和变化的检测。
常用的钙离子指示剂有Rhod-2、Fluo-4等。
这些荧光探针可以用于研究细胞内钙离子信号传导的机制及其与细胞功能之间的关系。
4. 蛋白质标记剂蛋白质标记剂是一类能够与特定蛋白质结合并发出荧光的探针。
常见的蛋白质标记剂有荧光素（Fluorescein）和鲜艳染料（Cyanine）。
这些荧光探针可以用于标记蛋白质在细胞内的分布和转运，从而研究蛋白质功能和相互作用。
三、荧光探针在活细胞成像中的应用荧光探针在活细胞成像中有着广泛的应用。
通过合理选择和设计荧光探针，可以实现对细胞生理、信号传导、代谢活动等过程的实时监测和定量分析。