KJ03 喹诺酮类药物残留检测方法O.

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4
1 概述
1.2 氟喹诺酮类药物的结构

氟喹诺酮类药物的共同特点是喹啉环 （个别为萘啶环）的C-6位上有氟原 子，C-7位上连接哌嗪基或吡咯基， 又称为6-氟喹诺酮类。
O F R2 X N R1 COOH
5
1 概述
1.3 喹诺酮类药物的性质



QNs均为白色或淡黄色晶型粉末，游离酸形式一般 易溶于稀碱、稀酸溶液和冰醋酸，在pH6-8的水中 溶解度最小，在多数有机溶剂中难溶或不溶。 QNs在C-3位含有羧基，在C-7位连接哌嗪等含氮碱 性基团，因此属酸碱两性化合物，这也是设计提取、 净化和分离方法的主要依据。 QNs结构中含有苯并杂环或并杂环骨架和羰基、羧 基、杂原子等组成的共轭系统，在紫外区具有特征 性和强的吸收；在酸性介质中具有较强的稳定荧光 性质；对光照、温度和酸/碱具有较好的稳定性。



色谱柱：Inertsil C8-3，5 m，150 mm×2.1 mm i.d.或相当者； 流动相：0.1%甲酸的乙腈溶液+0.1%甲酸的水 溶液，梯度洗脱（梯度时间表见表1）； 流速：300 L/min； 柱温：30 ℃； 进样量：30 L。
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４ 液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）
8
1 概述
1.4 喹诺酮类药物的代谢与残留

QNs在动物体内分布很广，一般肝、肾组织中浓度 最高，肌肉、血浆中浓度最低。
QNs主要经肾和胆管排泄，故尿液或胆汁中药物浓 度较高；另外QNs可以代谢进入毛发而长期存在， 氟甲喹和恶喹酸可进入骨骼组织而蓄积。 组织中QNs残留物主要是原形药物，一般选择原形 药物作为残留标示物；但恩诺沙星的残留标示物为 恩诺沙星及其主要代谢产物环丙沙星。
3500 r/min, 离心5 min
上清液
溶解、脱脂、过滤
上清液 HPLC分析 合并上清液
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3 高效液相色谱法（HPLC）
3.2 检测流程
5g样品
2× 15 mL1%醋酸-乙腈溶液提取 15 mL乙腈饱和 正己烷净化 正己烷脱脂净化 弃去正 己烷层
旋蒸至近干、氮气吹干
乙腈层
溶解、脱脂、过滤
HPLC分析
3.3 仪器条件

液相色谱条件
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４ 液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）
3.3 仪器条件

质谱条件


离子化模式：ESI+； 质谱扫描方式：MRM； 分辨率：单位分辨率； 雾化气（NEB）：6.00 L/min；气帘气（CUR）： 12.00 L/min；喷雾电压（IS）：5 000 V；去溶 剂温度（TEM）：500 ℃；去溶剂气流7.00 L/min；碰撞气（CAD）：6.00 mL/min（氮气）。 其它质谱参数见表2。
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４ 液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）
3.1 原理及适用范围


试样中的喹诺酮类药物残留用酸性乙腈溶液提取， 经正己烷脱脂净化，浓缩、定容后，用液质联用仪 测定，子离子丰度比定性，外标峰面积法定量。 适用于肌肉、肝脏、水产品、奶等动物源性食品中 萘啶酸、恶喹酸、氟甲喹、诺氟沙星、依诺沙星、 环丙沙星、洛美沙星、丹诺沙星、恩诺沙星、氧氟 沙星、沙拉沙星、二氟沙星、麻保沙星、培氟沙星、 司帕沙星、奥比沙星等16种喹诺酮类质谱法（LC/MS/MS）
3.2 检测流程
5g样品
2× 15 mL1%醋酸-乙腈溶液提取 正己烷净化
旋蒸至近干、氮气吹干
溶解、脱脂、过滤
LC/MS/MS分析
LC/MS/MS ，ESI+ ，MRM模式检测
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４ 液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）
3.3 仪器条件

液相色谱条件
喹诺酮类药物残留检测方法
主要内容

1 概述 2 常见检测方法 3 高效液相色谱法（HPLC） 4 液相色谱串联质谱法(LC/MS/MS)
2
1 概述
1.1 喹诺酮类药物的分类

喹诺酮类（quinolones, QNs）抗菌 药是指人工合成的含有吡酮酸（1,4二氢-4-氧吡啶-3-羧酸）基本结构的 一类抗菌药物。按母环的差异可分为 喹啉类、萘啶类、吡啶并嘧啶类和噌 啉类；按其发展历史，目前可分为三 代药物。
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４ 液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）
3.3 仪器条件

质谱条件
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４ 液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）
3.4 重构离子色谱图
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４ 液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）
3.4 重构离子色谱图
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４ 液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）
3.5 方法的性能指标


16种喹诺酮类药物残留的测定低限均为10.0 g/kg。 本方法的平均回收率为：鸡肉71.9% -102 %、鸡肝66.4%-102%、鱼肉62.4%-89.6%、 牛奶68.7%-104%，相对标准偏差为：鸡肉 1.5% 11.9 %、鸡肝2.7%-9.1%、鱼肉 1.4%-11.4%、牛奶4.1%-12.7%。


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2 常见测定方法

微生物抑制法 酶联免疫法 放射免疫法 HPLC法 LC/MS/MS法
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3 高效液相色谱法（HPLC）
3.1 原理及适用范围

将均质样品以1%醋酸-乙腈溶液提取 喹诺酮类药物残留，提取液用正已烷 净化。用配有荧光检测器的高效液相 色谱仪测定。适用于畜、禽、水产品 组织中氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙 星、丹诺沙星、沙拉沙星、氟甲喹的 同时检测。
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1 概述
1.3 喹诺酮类药物的药理学与毒理学

QNs对革兰氏阴性菌、支原体和 一些革兰氏阳性菌具有强大的杀 灭作用，组织渗透能力强，毒副 作用低。可用于呼吸道、肠道、 泌尿、皮肤和深部组织感染或败 血症的治疗。
7
1 概述
1.3 喹诺酮类药物的药理学与毒理学



但QNs同时也是人类最有效的抗菌药之一，由于 细菌对喹诺酮类药物耐药性的产生和某些喹诺酮 类药物的潜在致癌性质，其残留问题已引起广泛 关注。 2003年我国的鳗鱼产品就曾因氟喹诺酮类药物残 留问题出口日本受阻。 包括我国在内的许多国家和地区都对喹诺酮类药 物的使用范围和最大残留限量做出规定，根据不 同动物品种和药物种类，MRL在30～ 1900g/kg之间。
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3 高效液相色谱法（HPLC）
3.3 色谱条件

检测波长：
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3 高效液相色谱法（HPLC）
3.4 色谱图
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3 高效液相色谱法（HPLC）
3.5 方法的性能指标

６种喹诺酮类药物的测定低限(LOQ)均 为15 µg/kg。 ６种喹诺酮类药物的线性范围均为： 10~50µg/kg。 ６种喹诺酮类药物的回收率为64%106.3%；相对标准偏差为1.3%-9.5%。
3
1 概述
1.1 喹诺酮类药物的分类


第一代：萘啶酸、恶喹酸和吡咯酸，由于抗菌谱 窄、半衰期短、毒副作用强和细菌耐药性等原因， 现已很少应用； 第二代：吡哌酸和氟甲喹； 第三代：沙拉沙星、单诺沙星、恩诺沙星、环丙 沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、二氟沙星、麻保沙 星等氟喹诺酮类（fluoroquinolones，FQs）， 由于抗菌谱广、抗菌作用强，已逐渐成为该类药 物的主流。
旋蒸至近干、氮气吹干
溶解、过滤
HPLC分析 HPLC-FLD
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3 高效液相色谱法（HPLC）
3.3 色谱条件

色谱柱：4.0 mm×250 mm×5 µm，Hyprsil ODS
柱温：30℃；进样量：20µL A.- 0.01mol/L磷酸盐/三乙胺缓冲液（80+20）
（pH3.0） B - 乙腈；流速：0.8ml/min
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４ 液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）
3.2 检测流程
5g样品
2× 15 mL1%醋酸-乙腈溶液提取 正己烷净化
旋蒸至近干、氮气吹干
-在残渣中加入5 mL 流动相，快速混
溶解、脱脂、过滤
LC/MS/MS分析
匀和超声3 min溶解残渣； -5mL正己烷脱脂，弃去正己烷层； -注射器滤膜（0.45 µm）过滤。
旋蒸至近干、氮气吹干
-在残渣中加入2 mL HPLC流动相2，
溶解、脱脂、过滤
HPLC分析
快速混匀和超声3 min溶解残渣； -2mL正己烷脱脂，弃去正己烷层； -注射器滤膜（0.45 µm）过滤。
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3 高效液相色谱法（HPLC）
3.2 检测流程
2g样品
2× 20 mL1%醋酸-乙腈溶液提取 正己烷净化
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3 高效液相色谱法（HPLC）
3.2 检测流程
5g样品
2× 15 mL1%醋酸-乙腈溶液提取 正己烷净化
旋蒸至近干、氮气吹干
于45℃水浴中旋转蒸发近干， 用氮气吹干
溶解、脱脂、过滤
HPLC分析
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3 高效液相色谱法（HPLC）
3.2 检测流程
5g样品
2× 15 mL1%醋酸-乙腈溶液提取 正己烷净化
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3 高效液相色谱法（HPLC）
3.2 检测流程
5g样品
2× 15 mL1%醋酸-乙腈溶液提取 正己烷净化
旋蒸至近干、氮气吹干
溶解、脱脂、过滤
HPLC分析
12
3 高效液相色谱法（HPLC）
3.2 检测流程
5g样品
2× 15 mL1%醋酸-乙腈溶液提取 正己烷净化 残渣 旋蒸至近干、氮气吹干 重复提取1次 -加入15 mL 1%醋酸-乙腈溶液， 均质1 min后放入超声波池中超声5 min