基于酶催化银沉积质量放大的血吸虫压电免疫传感器的研究

2010年第68卷化学学报V ol. 68, 2010第23期, 2477～2481 ACTA CHIMICA SINICA No. 23, 2477～2481zywu@*E-mail:Received March 4, 2010; revised July 21, 2010; accepted August 23, 2010.2478化学学报V ol. 68, 2010传感器最突出的优点是操作简便、成本低廉、样品无需标记, 而且灵敏度高、特异性好、响应速度快、便于自动化和微型化, 符合现代分析技术的发展方向, 已广泛用于分子生物学研究、疾病诊断、环境污染监测、食品卫生监督等领域.本研究小组[1～3]曾长期开展压电免疫传感器的研究, 并报道了一种直接免疫检测日本血吸虫的压电传感器[1], 该方法可简单有效地用于血清样品中日本血吸虫抗体的检测. 但是这类直接质量响应的压电免疫传感方法检测限一般在µg水平, 难以实现一些低含量抗原抗体样品的检测.为了提高压电免疫传感器的检测灵敏度, 1988年Ward等[4]发展了酶催化质量放大压电免疫分析的方法, 通过标记酶的催化沉积反应, 传感器的检测灵敏度得到极大提高, 可实现ng水平抗原抗体分子的检测. 我们曾利用辣根过氧化物酶催化H2O2氧化底物 4-氯-1-萘酚, 实现酶催化质量放大, 发展了一种高灵敏的日本血吸虫的压电传感器, 检测限为5 ng/mL[5].但是, 目前报道的催化质量放大压电免疫传感方法都是一些液相检测方法, 在检测池中进行, 难以实现传感器阵列化和批量检测. 相对而言, 气相压电免疫传感器[6～8]无需检测池, 且由于没有液相的阻尼效应, 使用的晶振无需封闭, 传感器成本更低也更稳定, 操作简便, 具备了理想生物传感器所需要的许多特性, 可以实现多个晶振同时检测, 也更容易实现传感器的阵列化和商品化. 自气相压电传感检测技术发展以来, 在免疫分析中的应用已引起了广泛的兴趣[9～11]. 1983年Guilbault[12]首先将甲醛脱氢酶固定在晶体表面用于甲醛的检测. 随后出现将对硫磷抗体固定测对硫磷的气相压电免疫传感器[10], 以及测定空气中氮氧化合物的压电传感器[13]. 近年来, 压电嗅觉传感器及压电味敏传感器的研究又有了较大进展, 将压电传感器阵列作微型化处理, 则可组成与人鼻、人舌相似功能的“人工鼻”、“人工舌”. 有报道台湾学者研制的检测不同气体的压电石英晶体传感器其灵敏度可达10－7 g, 与人鼻的阈值一致[14]. 但目前尚未有利用酶催化质量放大以进一步提高气相压电免疫传感技术检测灵敏度的报道. 目前已报道的液相酶催化质量放大压电免疫传感技术大多是采用有机物作为沉积物, 如4-氯-1-萘酚、3,3'-联苯二胺氧化产物等, 这些有机物沉淀产物在实验洗涤过程中容易被洗脱, 用于气相压电免疫传感检测难以保证传感器的重现性和灵敏度.为了克服酶催化有机物沉淀产物容易洗脱的问题, 我们利用碱性磷酸酶催化金属银沉积技术, 基于酶催化沉积的金属银在石英晶振表面吸附力强、不易被洗脱的特点, 发展一种可用于气相检测的新型高灵敏酶催化质量放大压电免疫传感器.1 实验部分1.1 试剂与仪器试剂: SjAg32 (1.25 mg/mL)、SjAb (1 mg/mL) (中南大学湘雅医学院); BSA (sigma公司); 碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG、半胱胺(北京鼎国生物试剂有限公司); pH 7.4的PBS缓冲液(由0.01 mol/L Na2HPO4和KH2PO4配制); 1/15 mol/L的36Fe(CN)－/46Fe(CN)－溶液; 其它试剂均为分析纯, 所用水为二次蒸馏水.仪器: CN3165型高分辨计数器(石家庄无线电器厂); AT－切型石英晶振, 9 MHz, 双面被金芯片Ф12 mm, 电极直径6 mm (北京晨兴无线电器材厂); 振荡电路自制TTL-I电路; 恒温器CS5 (重庆试验设备厂); 电化学工作站660 b (上海辰华仪器公司).1.2 晶振的预处理石英晶振用新配的piranha [V(浓H2SO4)∶V(H2O2)＝31∶]洗涤3次, 每次3 min, 得到干净的晶振用乙醇和去离子水冲洗, 氮气吹干.1.3 传感器的组装室温下, 将预处理好的晶振浸泡在1 mmol/L 半胱胺溶液中放置过夜, 用乙醇冲洗. 然后在自组装了半胱胺的石英晶振上滴加一定量 2.5%戊二醛溶液, 室温下反应1 h. 经去离子水清洗吹干后, 再将 20 µL SjAg32 滴加到晶振上, 室温下放置1 h. 经 PBS 清洗后, 水洗吹干, 再用1%的牛血清白蛋白(BSA)封闭晶振上的活性结合位点, 时间为0.5 h.1.4 免疫检测过程实验流程示意于图 1. 将固定了抗原的石英晶振在不同浓度的血吸虫抗体溶液中于37 ℃下培育1 h, 然后图1 实验流程示意图No. 23 申田田等：基于酶催化银沉积质量放大的血吸虫压电免疫传感器的研究2479用pH 7.4 PBS清洗, 水洗吹干, 以去除没有结合的抗体分子. 再在晶振上滴加 20 µL浓度为0.02 mg/mL ALP-羊抗兔IgG, 37 ℃下温育 0.5 h, 经PBS 清洗, 吹干后, 将石英晶振置于真空干燥器检测并记录其起始频率值. 再在晶振上滴加 20 µL 磷酸化抗坏血酸脂和AgNO3混合溶液(浓度比为2∶3 mmol/L), 37 ℃下温育40 min,反应后用50 µL 10 mmol/L 硫脲洗涤 3 min, 干燥 2 h,再于真空干燥器检测并记录其频率值.2 结果与讨论2.1 压电传感器表面的酶催化金属银沉积为了提高气相检测压电免疫传感器的质量响应灵敏度以及克服酶催化有机物沉淀信号放大中的问题, 我们采用碱性磷酸酶催化金属银沉积来实现压电免疫传感器表面的质量放大, 提高传感器的检测灵敏度. 考虑到本传感器为适应低检测限的要求, 界面结合的免疫识别分子相对较少, 实验中我们利用交流阻抗技术对传感器表面抗原分子的固定、抗原抗体免疫结合以及酶催化金属银沉积等进行了表征(图2). 当晶振表面组装半胱胺并接上戊二醛之后, 阻抗比空白裸晶振的阻抗有所增加(图2a), 阻抗增加约20 Ω. 当在传感器表面固定了抗原并和抗体发生免疫反应以后, 结合的蛋白质分子阻碍了石英晶振传感器金电极表面的电子传递, 阻抗增加约20 Ω(图2b). 再固定上酶标二抗之后, 结合的蛋白质分子进一步阻碍了电子的传递, 阻抗又增加约20 Ω(图2c). 当发生了底物酶催化沉积反应以后,金属银沉积到晶振上, 此时阻抗增加约 140 Ω, 这可能由于晶振表面沉积的金属银在洗涤、干燥过程中被氧化, 形成的氧化银导电性不好, 再进一步阻碍了电极表面的电子传递, 最后导致阻抗明显增加(图2d).2.2 洗涤液的选择本实验由于石英晶振表面结合了大量的蛋白质, 其氨基酸残基对银离子存在一定的络合作用, 测量过程中部分银离子结合到石英晶振表面, 用常规水洗方法难以洗去晶振表面吸附的银离子, 使得石英晶振频率变化加大, 从而增大测量背景值. 实验中我们在洗涤液中加入与银离子具有较大络合能力的络合剂洗涤去除晶振表面吸附的银离子. 由于银离子和硫脲、硫酸钠的络合常数均大于和氨的络合常数, 所以我们选择并比较了10 mmol/L的硫脲和10 mmol/L的硫代硫酸钠两种洗液, 实验结果表明(平行测定5次): 硫脲洗涤液降低背景明显,较常规水洗方法减小了约60 Hz; 硫代硫酸钠洗涤液亦可使背景降低约25 Hz(图3). 本实验选择10 mmol/L的硫脲作为洗涤液.图2传感器不同时期的交流阻抗图a是自组装了半胱胺后的晶振; b是在a的基础上固定上抗原/抗体; c 是在a和b基础上固定上ALP-IgG; d是c在底物中反应40 min沉积金属银后, 所有测量均在1/15 mol/L的36Fe(CN)－/46Fe(CN)－-溶液中进行, 实验在晶振上进行Figure 2 Faradic impedance spectra measureaments in the pres-ence of 1/15 mol/L的36Fe(CN)－/46Fe(CN)－[in the form of Nyquist plot, In(Z) vs. Re(Z)] that correspond to (a) the cys-teamine modified crystal; (b) after addition of antigen/antibody;(c) after addition of ALP-IgG; (d) after further allowing the bio-catalyzed precipitation process to occur in the presence of 2 mmol/L ascorbate-2-phosphate and 3 mmol/L AgNO3 for 40 min图3去离子水, 10 mmol/L硫脲和10 mmol/L硫代硫酸钠三种洗液对背景值的影响Figure 3 Effect of washing solutions of distilled water, or thio-urea (10 mmol/L) or sodium thiosulfate (10 mmol/L) on reducing the background2.3 包被抗原SjAg的浓度对传感器的影响石英晶体表面单位面积包被抗原的量越多, 抗体结合位点就越多, 越有利于抗体及抗原抗体免疫复合物结合到石英晶体表面上. 考察了传感器包被不同浓度SjAg时检测信号的差异, 抗体为225 ng/mL, 酶催化时间为30 min. 结果显示随着SjAg浓度不断增大, 石英晶体频移值也逐渐增大. 当SjAg浓度大于62.5 µg/mL后,2480化 学 学 报 V ol. 68, 2010传感器响应信号趋于稳定, 可以认为此时石英晶体表面 已铺满SjAg 分子, 基本达到饱和(图4). 本实验为了减小SjAg 试剂用量, 选择50 µg/mL 作为包被抗原浓度.图4 血吸虫抗原对传感器的影响Figure 4 Effect of the concentration of SjAb on the frequency shift2.4 ALP-羊抗兔IgG 的浓度对传感器性能的影响本实验是利用碱性磷酸酶催化磷酸化的抗坏血酸酯水解产生还原性的抗坏血酸, 从而使溶液的银离子还原, 生成的大量金属银沉积在晶振表面上, 从而放大石英晶振传感器的质量响应信号. 实验中酶标二抗的浓度会直接影响结合到石英晶振表面碱性磷酸酶的量, 进而影响传感器的响应信号. 考察了ALP-羊抗兔IgG 酶标二抗浓度对传感器响应的影响. 结果如图 5所示, 随着ALP-羊抗兔IgG 的浓度的增大, 传感器响应逐渐增大, 当浓度大于0.04 mg/mL 时频率趋于平稳, 为了减小非特异性吸附, 本实验选择了0.02 mg/mL 的酶标二抗浓度.图5 ALP-IgG 的浓度对传感器响应的影响Figure 5 Effect of the concentration of ALP-IgG on the fre-quency shift2.5 底物浓度对传感器性能的影响混合液中银离子浓度可直接影响到晶振表面沉积金属银的量, 从而影响到相应频移信号的大小. 实验考察了混合液磷酸化抗坏血酸酯和AgNO 3的最佳浓度, 缓冲溶液采用pH 9.8的0.1 mol/L Tris-HNO 3, 混合液磷酸化抗坏血酸酯和 AgNO 3 的最佳浓度配比为1∶1.5[15]. 实验结果表明随着底物浓度的增加传感器响应信号逐渐增加, 当磷酸化抗坏血酸酯的浓度大于 7.5 mmol/L 时, 频率变化趋于稳定(图6). 为了减小背景值, 本实验选用磷酸化抗坏血酸酯的浓度为 2 mmol/L, AgNO 3 的浓度为3 mmol/L.图6 底物浓度对传感器的影响Figure 6 Effect of the concentration of substrate on the fre-quency shift2.6 血吸虫检测校正曲线本实验在优化条件下测量了一系列不同浓度的SjAb 溶液, 传感器的响应结果为5次测量的平均值, 得到SjAb 与传感器响应频率的关系曲线(图7). 通过线性回归分析, 得到传感器方法检测线性范围为1～225 ng/mL, 相关系数为0.9964, 检测限达1 ng/mL, 显示了较高的检测灵敏度.图7 传感器的校正曲线Figure 7 The calibration curve of piezoelectric immunosensorNo. 23 申田田等：基于酶催化银沉积质量放大的血吸虫压电免疫传感器的研究24813 小结本文采用利用碱性磷酸酶催化金属银沉积来实现压电免疫传感器表面的质量放大, 发展了一种新型气相检测的质量放大压电免疫传感检测方法, 提高传感器的检测灵敏度, 并实现了日本血吸虫抗体的高灵敏检测. 由于气相压电传感器可以实现多个样品的同时快速检测, 降低检测成本, 易于实现传感器阵列化、批量检测, 因此该方法为生物体医学传感检测打下了良好的基础, 有望成为商品化的高灵敏免疫传感检测方法.References1Wu, Z.-Y.; 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