Protein A亲和介质说明书
ProteinASepharose4FF产品使用说明书
Protein A Sepharose 4FF 产品使用说明书——高IgG结合特异性高流速低蛋白A脱落产品特点特点结合特异性强，基颗粒大小50-160 μm团脱落少推荐流速50-300cm/h基质4%的交联琼脂糖凝胶配基重组protein A 使用温度常温pH范围3-10配基密度6mg重组蛋白A/ml动态吸附载量60mg人IgG/ml 保存温度+4~8℃保存液体20%乙醇蛋白A残留小于3ng蛋白A/mg IgG产品介绍Protein A sepharose介质是经过我们公司长期开发，在公司生产的native protein A 的基础上精致而成。
通过Protein A Sepharose 4FF，可分离和纯化多种哺乳动物不同亚型的抗体或包含抗体Fc片段的基因工程重组蛋白。
本产品相对同类产品具有如下优势：1、偶联条件温和，更好的保持了protein A的构象，所以抗体载量高，同体积的介质，相同规模的纯化设备，相同体积介质，抗体的产量明显高于用同类产品，大大的降低了抗体药物生产成本。
2、非常稳定，不易脱落，用其生产的抗体中protein A的残留比同类产品的更少。
3、公司的Protein A 以及Protein A sepharose的生产都是在清洁车间生产，符合制药企业生产需求。
4、公司生产的Protein A sepharose使用寿命长，常规条件下能够重复使用100次以上。
使用说明（1）缓冲液的准备：平衡缓冲液：纯化不同动物和不同亚型抗体平衡缓冲液成分时所用平衡缓冲液是不同的，部分参照如下：抗体种类人IgG1、人IgG2、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b 10mM 磷酸盐缓冲液，150mM NaCl，pH7.21人IgG3、人IgG4、小鼠IgG1、大鼠IgG3 50mM Tris-Cl，3M NaCl，pH7.8-8.5（2）样品的准备样品上柱前先用平衡缓冲液稀释5至10倍，从而确保样品液的成分和pH与平衡缓冲液相近。
蛋白A亲和层析介质
蛋白A亲和层析介质（征求意见稿）编制说明《蛋白A亲和层析介质》国家标准起草工作小组二〇一九年一月《蛋白A亲和层析介质》国家标准编制说明（征求意见稿）一、任务来源本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会专项《国家质量基础的共性技术研究与应用》项目《生物产业共性技术标准研究》中课题《海洋生物产品质量控制与检测技术标准研究》，项目编号“2016YFF0202304”。
本项任务由中国标准化研究院提出并归口，定于2019年完成。
本标准起草工作组由中国科学院过程工程研究所等单位共同组成。
二、目的和意义单抗药物对生产制造纯化工艺的效能和成本要求非常高，单抗分离纯化成本占其生产总成本的50-70%，其中蛋白A亲和层析介质是其生产的关键原材料之一，其性质和成本将决定单抗产品的最终生产成本、纯度和收率。
目前，80%以上的抗体纯化使用蛋白A 亲和层析。
蛋白A亲和层析介质的载量、稳定性等是单抗纯化选择介质时的首要考虑。
蛋白A来源于金黄色葡萄球菌的一个株系，它含有5个可以和抗体分子Fc段特异性结合的结构域。
将蛋白A偶联至基质上（以琼脂糖基质为主）制成蛋白A亲和层析介质，可以与抗体特异性结合，选择性极高，一步亲和层析可达到95%以上的纯度。
蛋白A 亲和层析因特异性强、操作简单、处理量大等优势，已成为抗体药物研发和生产阶段的核心纯化步骤。
蛋白A亲和层析介质作为单抗药物生产过程的关键分离材料之一，其性质和成本决定单抗产品的最终纯度、收率和生产成本。
我国当前尚未建立相应的国家及行业标准，国内市场上的蛋白A亲和层析介质产品质量良莠不齐，缺乏产品生产、检验和质量规范。
这在一定程度上限制了我国蛋白A亲和层析介质的发展及相关层析技术的应用，更阻碍了国内单抗产业的发展水平。
因此建立蛋白A亲和层析分离介质的国家标准，对于规范蛋白A亲和介质行业，推进层析技术应用，以及促进单抗产业发展，均具有重要的理论和现实意义。
目前，蛋白A亲和层析介质的性能参数测定方法多种多样，以动态载量测定方法为例，一种是将介质装柱并连在层析仪上，平衡，上样抗体，待流出液浓度与上样浓度相等时上样结束，依次经淋洗、洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液体积及洗脱液浓度，计算洗脱载量。
Protein A Resin纯化抗血清
Protein A Resin（Cat.No.L00210）纯化抗血清操作程序1实验原理Protein A亲和层析介质是纯化和分离IgG常用手段。
Protein A是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要通过Fc片段结合哺乳动物IgG。
天然Protein A有5个IgG结合域和许多其它的未知功能域。
重组Protein A包含5个高IgG结合域(Ka=108/M)，并去除了其它非主要结合域以降低非特异性结合。
目前，Protein A亲和层析介质已经广泛用于从生物流体或细胞培液中分离纯化各种类型的IgG或者IgG片段。
实验已经证明，Protein A和IgG的相互作用仅涉及Fc区域，而不影响Fab片段和抗原的结合。
Protein A Resin（Cat.No.L00210）的特性Resin 体积5ml（10ml含5ml浆液）配体 E.coli表达的重组链球菌Protein A每个配体结合IgG位点的数目 5配体的分子量约34kDa配体的PI 5.17配体密度≈2mg重组蛋白A/mlresin静态结合能力大于20mg猪IgG/ml Resin基质4%琼脂糖凝胶颗粒大小90µm（45-165µm）储存液含20%乙醇的1XPBS储存条件4-8℃有效期未开封前可保存12个月2实验试剂和器材2.1实验试剂Na2HPO4、NaCl、甘氨酸、浓盐酸、Tris、蒸馏水、20%乙醇2.2实验器材Protein A Resin（金斯瑞生物科技L00210）、4℃冰箱、PH计或PH试纸、锥形瓶、量筒、漏斗、移液器、tip头、试剂瓶、0.22µm滤膜、注射器、纯化柱（约10ml）2.3样品抗血清2.5ml（约20mg IgG/ml Resin，根据血清中IgG含量正常范围 7.6～16.6g／L，每mlResin可以纯化至少1.2ml血清，本实验按2mlProteinA纯化抗血清2.5ml进行试验。
Protein At Beads 4FF 预装柱说明书
ProteinAt Beads 4FF 的预装柱说明书货号：YA2471规格：1*1mL /1*5mL /5*1mL /3*1mL+1*5mL /5*5mL保存：2-8℃产品说明：Protein At Beads 4FF 是用于分离和纯化单克隆抗体、多克隆抗体或Fc-融合蛋白的亲和层析介质。
Protein A 是一种分离自金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，主要通过Fc 片段结合哺乳动物IgG 。
Protein At Beads 4FF 的配体蛋白Protein At 是在天然蛋白A 的基础上进行生物工程突变得到的一种耐碱蛋白A(Alkaline tolerate ，故缩写为At)。
Protein At Beads 4FF 是以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质，可以在相对较高的流速下进行单克隆抗体和多克隆抗体的纯化。
表1：介质性能参数介质高度交联的4%琼脂糖平均粒径～90μm配体耐碱性Protein A结合载量>40mg 人lgG/ml 介质化学稳定性可耐受抗体纯化过程中的所有试剂工作pH 3-12在线清洗0.1-0.5M NaOH 线性流速50-300cm/h 保存20%乙醇纯化流程：1、Buffer 的准备所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22μm 或0.45μm 滤膜过滤。
平衡/洗杂液：0.15M NaCl 、20mM Na 2HPO 4，pH7.0洗脱液：0.1M 甘氨酸，pH 3.0中和液：1M Tris-HCl ，pH 8.5。
2、样品准备上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH 值，可以用平衡/洗杂液对血清样品、腹水或细胞培养液稀释，或者样品用平衡/洗杂液透析。
样品在上样前建议离心或用0.22μm 或0.45μm 滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。
3、样品纯化1.上柱：将泵管道中注满去离子水。
去掉上塞子，将层析柱连接至色谱系统中。
再折断下口，将预装柱接到色谱系统中，并旋紧。
rProtein A层析填料说明书
rProtein A Sepharose Fast Flow原理蛋白质A来自金黄色葡萄球菌属，包含5个区域，可以用来结合IgG的Fc区域。
作为一个亲和配基，蛋白质A偶联到Sepharose上，似的这些区域可以结合游离的IgG分子。
一份子的蛋白质A可以至少结合两分子的IgG。
尽管蛋白质A主要是与人类免疫球蛋白IgG进行结合，一些其他类型的免疫球蛋白也显示出能够结合蛋白质A。
蛋白质A能够与人初乳IgA发生相互作用，同时也可以和人类的骨髓瘤IgA2发生反应，但是不能与IgA1发生反应。
一些人类的单抗IgMs和一些来自正常的和巨球蛋白血症血清中的IgMs能够结合蛋白质A。
进行一个分离操作结合缓冲液：20mM磷酸纳，pH7.0洗脱缓冲液：100mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH3~6中和缓冲液：1M Tris-HCl，pH9.01，用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。
2，用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。
3，上样，流速为1-4ml/min（1ml的柱子），或者5ml/min（5ml的柱子）。
收集流穿片段。
4，用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合物质都被冲洗出柱子（紫外检测器在280nm波长检测）。
5，用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。
洗脱液立即用中和缓冲液（0.06ml~0.2ml 1M Tris-HCl，pH9.0每毫升馏分）中和至中性。
6，立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子。
使用注意1，样品需要离心（10000g/20min）去除细胞和细胞碎片。
离心下来的上清经过一个0.45μm 的滤膜过滤。
2，来自多数物种的IgGs和亚类，在接近生理pH值和离子强度的条件下，可以结合到蛋白质A上。
如果蛋白质和配基之间的互相作用较弱，应该避免过度冲洗，因为这样可能会减少最终的产量。
3，对于一些抗体，比如小鼠IgG，当使用蛋白质A进行纯化时，可能需要向结合缓冲液中加入3M的氯化钠，达到最有效的结合，例如1.5M的甘氨酸和3M的氯化钠，pH为8.9。
蛋白AProteinA酶联检测试剂盒可拆卸说明书
蛋白A(Protein A)酶联检测试剂盒(可拆卸)说明书产品目录编号# AB000109C此试剂盒包含检测生物药物内蛋白A (Protein A) 杂质所需要的全部组分。
请在操作之前仔细阅读此说明书。
本试剂盒只能用于科学研究，不能用于医学诊断。
背景资料在单克隆抗体药物的纯化过程中，以蛋白A（Protein A）为基础的亲合层析是广泛应用的纯化方法之一，单克隆抗体可以有效的在此步骤中得到纯化。
蛋白A 的最初来源是细菌（Staphylococcus aureus）细胞壁中的一个蛋白质，研究表明蛋白A 可能对人体有潜在的危害，它的生物学作用包括刺激人体多种细胞素（IFNγ, TNFα, IL-1α,IL-1β, IL-2, IL-4）的释放。
由于在蛋白A 亲合层析柱使用过程中会有微量的蛋白A 从层析柱上脱落下来，因此用精确灵敏的方法来确证单克隆抗体药物中蛋白A 的残留处于一个较低的和稳定的水平是单克隆抗体药物的质量标准之一。
蛋白A (Protein A) 酶联检测试剂盒是用来定量分析生物药物中蛋白A杂质的试剂盒。
首先，用不同浓度的蛋白A标准蛋白制作一条标准曲线，然后再根据标准曲线来分析生物药物中残留蛋白A的含量。
具体方法为：先将蛋白A标准蛋白或者待测样品适当稀释后加入已包被好抗蛋白A抗体的96孔平板中。
经过1.5小时的保温，蛋白A与已经固定在平板上的抗体结合形成抗原－抗体复合物。
此复合物被随后加入的生物素标记的抗蛋白A的抗体结合并进一步形成更高级的复合物，反应45分钟后洗去未结合的物质。
再加入链霉亲合素-辣根过氧化物酶复合物（Streptavidin-HRP Conjugate），静置30分钟。
因链霉亲合素可以与任何带生物素标记的抗体相结合，从而使链霉亲合素-辣根过氧化物酶复合物连接到平板上。
接下来冲洗掉未结合的物质，加入TMB底物。
固相上的酶催化底物产生颜色反应，待颜色反应一段时间后，终止反应。
用酶标仪在450 nm波长下测定其结果，此结果能间接地反应结合到平板上的蛋白A数量的多少。
蛋白a柱使用手册
蛋白a柱使用手册
蛋白A柱是一种亲和层析柱，常用于纯化含有Fc区域（浅链）
的抗体。
在使用蛋白A柱之前，需要将其活化。
活化方法：
1. 用20mM乙酰胺（pH5.0）或1M的乙酸钠（pH4.0）洗脱缓冲
液进行洗脱。
注意：洗脱缓冲液需要在使用前pH值平衡至目标 pH 值。
2. 在规定压力和流速下，将洗脱缓冲液穿过蛋白A柱。
3. 在一定的时间内保持连续流动，以确保蛋白A柱得到充分的
活化。
使用方法：
1. 使用浓盐缓冲液如2M NaCl或者制备完整抗体来预洗蛋白A 柱，以去除不特异性结合物。
2. 将条件适当的待纯化样品施加在蛋白A柱上，并以规定的压
力和流速连续流加至柱子中。
3. 使用洗脱缓冲液（例如50mM甲基胆碱（pH5.0）或50mM乙醯
丙酮（pH4.0）去除不特异性结合物，如有必要，可以多次洗脱。
4. 使用醋酸钠或氯化钠等适宜的缓冲液或乙酰胺调节pH，并用
其他相关方法如聚焦脱盐或超滤等方法对目标蛋白进行进一步的纯化
和浓缩。
注意事项：
1. 蛋白A柱床高度和采用的缓冲液类型都可能对柱子的效果有
所影响，因此，建议在第一次使用时检查各个实验条件的最佳化。
2. 在样品很少且需要高效纯化的情况下，可以使用前列腺素A2
或乳糖脱盐来洗脱蛋白A柱。
3. 需要牢记的是，使用蛋白A柱时必须要注意操作稳定，避免
各种缓冲液和样品的混合，避免浓度冲击和质量不稳定的问题，以确
保高产和高纯度的结果。
ProteinA亲和层析介质
Protein A亲和层析介质使用说明书UniMab®NanoMab使用之前请认真阅读产品使用手册苏州纳微科技有限公司Suzhou Nano-Micro Tech, Co., Ltd通用缩略术语：AC：亲和层析，文献中也有被记为AC280 nm：在指定波长的紫外吸收M：物质的量的浓度单位，mol/l的简写mM: 物质的量的浓度单位，mmol/l的简写BV：柱体积，bed volume的简写Mr：相对分子量MPa：兆帕斯卡Bar：压强单位，工程上“公斤力”的单位psi：压强单位，磅每平方英寸压强单位之间换算：1 MPa = 10 bar ≈ 145 psi索引目录1.Protein A亲和层析产品简介 (4)2.Protein A亲和纯化操作步骤 (4)2.1 层析柱装填 (5)2.2 柱效评价 (5)2.3预装柱使用方法 (6)3.产品基本特性 (6)3.1 单分散高度均匀的粒径 (6)3.2 更快的流速、更高的效率 (7)3.3超高的结合载量 (7)3.4 更卓越的耐碱性和化学稳定性 (8)3.5 更低的配基脱落风险 (9)4.细胞培养液中单克隆抗体(mAb)捕获应用 (9)5.储存 (10)6.故障排除 (11)7.订购信息 (12)1.Protein A亲和层析介质简介纳微科技提供全球领先的Protein A亲和层析介质和预装柱产品，该产品以单分散均匀多孔型聚甲基丙烯酸酯（PMMA）或聚苯乙烯/二乙烯苯（PS/DVB）微球为基质，采用领先的基因工程优化的耐碱性重组rProtein A，通过独特的表面键合技术制成，专门用于单克隆抗体以和含有Fc片段的重组蛋白类生物大分子的分离纯化。
图1.1 纳微科技Protein A亲和介质的制备示意图产品系列UniMab®介质NanoMab介质分离原理Protein A亲和捕获Protein A亲和捕获基质聚甲基丙烯酸酯(PMMA) 聚苯乙烯/二乙烯苯(PS/DVB)配基耐碱性rProtein A 耐碱性rProtein A粒径（μm）50 μm 15 μm结合载量(人IgG)> 35 mg / mL（4 min驻留时间）>30 mg / mL（4 min驻留时间）纯化阶段捕获、中度纯化捕获、精细纯化或样品制备基本特点高载量、高耐压、高分离效率、耐清洗中高载量、极高耐压、高分辨率、耐清洗最大耐受压力116 psi（8 bar，0.8MPa ）870 psi ( 60bar，6MPa )pH稳定性 3 - 12 3 - 12CIP在位清洗0.1 - 0.5 M NaOH 0.1 - 0.5 M NaOH使用温度 4 ~ 40 摄氏度 4 ~ 40 摄氏度存储20%乙醇，2 – 8 摄氏度20%乙醇，2 – 8 摄氏度典型应用适合于大规模抗体和免疫球蛋白等纯化生产，比如当克隆抗体等。
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Protein A 亲和介质（Protein A QZT 4FF ）产品说明书
1. 产品简介
Protein A 能特异性地与抗体的Fc 区结合，所以Protein A 亲和介质可用于抗体（单抗和多抗）的分离纯化，经过一步亲和层析，即可从腹水、血清和培养液等样品中得到高纯度的抗体。
Protein A QZT 4FF 亲和介质以自制的琼脂糖凝胶为基质，以重组Protein A 为配基，具有很高的物理化学稳定性，配基不易脱落，寿命长，使用方便，应用广泛。
2. 产品特性
3. 使用方法
Protein A QZT 4FF 广泛用于各种抗体的分离纯化。
层析操作通常包括装柱、平衡、进料、淋洗、洗脱、再生等步骤。
平衡：用5~10CV 的平衡缓冲液（20 mM PB+0.15M NaCl ，pH 7.0，添加适当浓度的NaCl 抑制非特异性吸附）平衡层析柱，至流出液电导和pH 不变（与平衡液一致）。
进料：样品缓冲液应尽可能与平衡液一致。
固体样品可用平衡液溶解配制；低浓
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Biotechnology (Beijing)
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度样品溶液可用平衡液透析；高浓度样品溶液可用平衡液稀释。
为了避免堵塞层析柱，样品应经离心或微滤（0.45μm ）处理。
进料量根据介质的载量和料液中目标蛋白的含量计算。
淋洗：上样完毕后继续用平衡缓冲液淋洗至基线。
洗脱：用洗脱缓冲液（20 mM 柠檬酸，pH 3.0-4.0；或0.1M 甘氨酸，pH 3.0；或20 mM 乙酸钠，pH 3.0-4.0；具体洗脱条件与抗体的结合强度和稳定性密切相关，效果不好时应进行洗脱缓冲液（种类和pH 或添加剂）的优化）洗脱，收集流出液。
洗脱后，应立刻用碱性缓冲液（如1M Tris/HCl, pH 9.0）将收集到的抗体溶液中和到抗体稳定的pH ，避免抗体失活，维持抗体的生物活性。
再生、原位清洗：介质使用数次（5-10次，具体次数与原料的种类和来源及实验要求有关）后，需要对介质进行再生、在位清洗。
（1）用0.1M 的乙酸或0.1M 的乙酸/20%乙醇淋洗柱子3-5CV ，然后用缓冲液洗到中性即可重复使用；
（2）也可用0.05M NaOH+1M NaCl 或6M 盐酸胍淋洗柱子3-5CV ，并用3~10 CV 的纯水冲洗，然后用缓冲液洗到中性即可重复使用。
其它注意事项：在装柱、使用和保存柱子的时候，要避免柱子流干，气泡进入。
4. 具体应用
1 载量分析：利用人免疫球蛋白（血浆来源，纯度95%，3mg/ml ）进行载量分析（柱体积2ml ；Buffer A ：20 mM PB+0.15M NaCl ，pH 7.0，Buffer B ：0.1M 甘氨酸，pH 3.0；流速：0.5ml/min ；上样量：40ml ），层析谱图如图1（A ：进口介质；B ：本中心介质）所示，结果表明两种介质的层析谱图（穿透行为、洗脱峰）基本一致，无明显差异。
洗脱峰的蛋白浓度分析结果表明，二者的载量相似，均在40-45mg h-IgG/ml 介质之间。
2 纯化效果分析：利用小鼠腹水（Buffer A 稀释4倍）上样进行亲和层析，考察介质的分离纯化效果（柱体积2ml ；Buffer A ：20 mM PB+0.15M NaCl ，pH 7.0，Buffer B ：20mM 柠檬酸，pH 3.0；流速：0.5ml/min ；上样量：4ml ），层析谱图如图2所示，纯度分析结果表明，经过一步亲和层析，即可得到纯度95%以上的IgG 。
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图1 h-IgG 在Protein A 介质上的动态穿透曲线（A ：对照介质；B ：本中心介质）
图2 Protein A 亲和层析谱图（小鼠腹水）
5 特色服务
（1）提供介质筛选及工艺开发的咨询。
（2）接受客户委托开发各种分离介质和分离工艺。
（3）按客户要求提供各种介质及相应规格的预装柱。
（4）为客户提供专业的售前和售后服务。
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