牛孕酮(P)酶联免疫分析(ELISA) 试剂盒使用说明书
酶联免疫吸附实验
记录结果有下列几种方法： 1、“+”或“-”：所有超过规定的O.D值（如O.D，0.4） 的标本均属阳性，此规定O.D值是根据事先测定大量阴 性标本所取得的，此规定值是阴性标本的上限。或者以 一组阴性标本O.D平均值加2～3个标准差作为阳性阈值。 2、直接以O.D值来表示，如0.4、0.7、1.2，O.D值越 大，阳性反应越强，但此数值是在固定实验条件下得到 的结果，而且每次实验都要有参考标本作对照。 3、以终点滴度表示：将标本作连续稀释，最高稀释度 能出现阳性反应者（即OD值仍大于阳性阈值，即为该 标本的滴度。
（三）试验样品
（四）结合物
(五）洗涤剂与稀释剂
（六）底物
（七）作用时间
（八）结果判断
(九)试验的重复性（精确度）
（十）对使用仪器要求
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（一）固相载体
在ELISA中最常用的是聚苯乙烯或聚氯乙烯微量反应板及塑 料管。但每批微量反应板对抗原或抗体蛋白质的吸附性能 是有显著差别的。实验证明，吸附效果似乎与塑料的类型 及其表面性质有关。特别是塑料制品在加工过程中因工艺 不同或受其他因素的影响而造成吸附性能的极大差异，甚 至完全丧失吸附能力。因此，对每批制品在使用前，必须 经过实验室鉴定 。
5、以“单位”来表示：在测定被检标本的同时，再测定一 个含已知单位数的阳性参考血清，用不同稀释度作ELISA检 测后，以O.D值为纵坐标，单位数为横坐标，画出标准曲线。 以后可根据被检标本的O.D值，从曲线上找出相应的单位数， 再乘于血清的稀释倍数，即可得出被检标本的单位数。
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（十）对使用仪器要求
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（八）结果判断
ELISA的试验结果可用肉眼观察颜色反 应的深浅作出判断，也可用分光光度计作 精确测定。当然,后者更为正确。而肉眼观 察更为简便，而且也有一定正确性。
酶联免疫分析试剂盒说明书
人chemerin酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用预期应用ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关液体中chemerin含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中chemerin水平。
用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入chemerin抗原、生物素化的抗人chemerin抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。
TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的chemerin呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制1.酶联板：一块（96孔）2.标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为20,000pg/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释10,000pg/ml，5,000pg/ml，2,500pg/ml，1,250pg/ml，625pg/ml，312.5pg/ml，156pg/ml，样品稀释液直接作为标准浓度0pg/ml，临用前15分钟内配制。
如配制10,000pg/ml标准品：取0.5ml20,000pg/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。
3.样品稀释液：1×20ml/瓶。
4.检测稀释液A：1×10ml/瓶。
5.检测稀释液B：1×10ml/瓶。
6.检测溶液A：1×120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液A1:100稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。
如1ul检测溶液A加99ul检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
7.检测溶液B：1×120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B1:100稀释。
碧云天生物技术 Human IL-1β ELISA Kit 说明书
碧云天生物技术/Beyotime Biotechnology 订货热线：400-168-3301或800-8283301 订货e-mail ：******************技术咨询：*****************网址：碧云天网站 微信公众号Human IL-1β ELISA Kit产品编号 产品名称包装 PI305Human IL-1β ELISA Kit96次产品简介：碧云天的Human IL-1β ELISA Kit (Human Interleukin-1β Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit)，即人白细胞介素1β酶联免疫吸附检测试剂盒，是一种用于特异性地高灵敏地定量检测人血清、血浆、细胞或组织裂解液、或细胞培养上清液中的IL-1β的ELISA 试剂盒。
本产品检测灵敏度高，特异性强，重复性好。
多次重复检测结果表明，最小检出量为2.2pg/ml ，与人IL-1r α、IL-1sRII 、IL-1sRI 、小鼠IL-1α、小鼠IL-1β等均没有交叉反应，板内、板间变异系数均小于10%。
IL-1即白细胞介素-1(简称白介1)，其家族由IL-1α(也称IL-1F1)、IL-1β(也称IL-1F2)、IL-1受体拮抗剂(IL-1 receptor antagonist, 简称IL-1RA, 或IL-1F3)及IL-18、IL-33和IL-1F5~F10组成。
IL-1主要由巨噬细胞产生，此外几乎所有的有核细胞，如B 细胞、NK 细胞、体外培养的T 细胞、角质细胞、树突状细胞、星形细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、内皮细胞以及平滑肌细胞均可产生IL-1。
正常情况下只有皮肤、汗液及尿液中含有一定量的IL-1，绝大多数细胞在受到外来抗原或细菌内毒素刺激后才能合成和分泌IL-1。
IL-1β在免疫和炎症反应、骨重建(bone remodeling)、发烧、碳水化合物代谢等生理、病理过程中都有重要作用。
elisa试剂盒实验说明书
PRRSV N蛋白抗体检测间接ELISA方法的建立1 材料：1.1 蛋白、血清、酶标二抗原核表达PRRSV N蛋白；标准阳性血清和阴性血清，待检血清；自制HRP标记兔抗猪IgG；1.2 主要试剂和溶液包被液（50 mmol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液）Na2CO3 1.59 gNaHCO3 2.93 g准确称取后，溶于950 mL的蒸馏水中，调pH值为9.6，定容到1 L；PBS-T洗涤液1000 mL 10 mmol/L pH7.4的PBS中加入0.5 mL Tween-20；封闭液和血清稀释液含10%小牛血清的PBS-T缓冲液，10%马血清的PBS-T缓冲液，含5%BSA的PBS-T缓冲液，含10%BSA的PBS-T缓冲液，含5%脱脂奶的PBS-T缓冲液；底物溶液100 mmol/L的柠檬酸溶液（21 g柠檬酸C6H6O7•H2O溶于去离子水，定容至1 L）24.3 mL，200 mmol/L Na2HPO4•12H2O（71.6 g Na2HPO4•12H2O溶于去离子水，定容至1 L）25.7 mL混匀，加入50 mg的四甲基联苯胺（TMB），临用前加入50 μL的30% H2O2；终止液（2 mol/L H2SO4）每200 mL终止液，由蒸馏水177.8 mL和浓硫酸22.2 mL 混和而成。
1.3 主要仪器设备电热恒温培养箱；4℃冰箱；酶标仪。
2 步骤：2.1抗原包被浓度和二抗稀释度的确定将原核表达的N蛋白分别作2.0 μg/mL，1.0 μg/mL，0.5 μg/mL，0.25 μg/mL，0.1μg/mL，0.05 μg/mL连续稀释6个稀释度，每个稀释度重复两孔，100 μL/孔，4℃包被酶标反应板过夜。
将自制HRP标记的兔抗猪二抗分别做1:50、1:100、1:200和1:400一系列倍比稀释，南京金益柏生物技术有限公司Tel:025-********Fax*************每个稀释度重复两孔，100 μL/孔，组成方阵确定重组蛋白的最佳包被浓度和二抗稀释度。
人促红细胞生成素(EPO)-酶联免疫试剂盒(ELISA试剂盒)
仅供科研使用，不得用于临床检验。
人促红细胞生成素（EPO ）酶联免疫试剂盒（ELISA试剂盒）说明书黄石市艾恩斯生物科技有限公司【产品名称】通用名称：人促红细胞生成素（EPO ）酶联免疫试剂盒（ELISA试剂盒）英文名称：Human Erythropoietin（EPO ）ELISA KIT【包装规格】48人份/盒，96人份/盒【预期用途】仅供科研使用，定量检测血清、血浆、细胞培养上清液中人促红细胞生成素（EPO ）的浓度。
【检验原理】本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）。
在预包被抗人促红细胞生成素（EPO ）抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入人促红细胞生成素（EPO ）校准品和待测样本，再加入另一株HRP标记的抗人促红细胞生成素（EPO ）抗体（酶标抗体），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，在微孔板固相表面形成固相抗体-抗原-酶标抗体的夹心复合物。
加底物A和B，底物在HRP催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M 硫酸）作用下，最终转化为黄色，在酶标仪上测定吸光度（OD值），吸光度（OD值）与待测样品中人促红细胞生成素（EPO ）的浓度正相关。
拟合校准品曲线，可以计算出样本中人促红细胞生成素（EPO ）的浓度。
【主要组成成分】主要成分校准品检测范围：47-3000pg/ml。
校准品已经通过测试，结果表明HBs抗原阴性，HIV1、HIV2和HCV抗体阴性，由于不存在一种试验方法能够完全保证没有这些物质，本品必须按照具有潜在的感染性进行处理，处理过程应当遵循通用的安全措施。
需要但未提供的材料及耗材1、酶标仪2、精密移液器及一次性吸头3、蒸馏水4、洗瓶或者自动洗板机5、37℃水浴锅或恒温箱6、500ml量筒7、无粉一次性乳胶手套【储存条件及有效期】1、2-8℃保存，切勿冷冻，有效期6个月。
2、开封使用后，包被微孔板放入带有干燥剂的自封袋中，密闭自封袋，并将全部试剂放回2-8℃冰箱。
牦牛LC3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用
畜牧兽医学报 2023,54(6):2436-2447A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.06.022开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):牦牛L C 3B 蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用焦正兴1,潘阳阳1,2,王 萌1,2,王靖雷1,马文斌1,高 翔1,张 晖1,崔 燕1,2,余四九1,2,王立斌1,2*(1.甘肃农业大学动物医学院,兰州730070;2.甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心,兰州730070)摘 要:旨在克隆牦牛微管相关蛋白1轻链3B (m i c r o t u b u l e a s s o c i a t e d p r o t e i n 1l i gh t c h a i n 3B ,L C 3B )基因,制备牦牛L C 3B 多克隆抗体,为探究自噬在牦牛生殖生理过程中的作用奠定基础㊂本研究通过基因克隆方法获得牦牛L C 3B 基因序列,利用原核表达㊁亲和层析法纯化牦牛L C 3B 重组蛋白,使用纯化的蛋白为抗原免疫10月龄日本大耳白兔,S e p h a r o s e 4B 柱层析法纯化制备牦牛L C 3B 多克隆抗体,利用酶联免疫吸附试验(E L I S A )测定抗体效价,并使用蛋白质免疫印迹(W B )㊁免疫组织化学法(I H C )和免疫荧光技术(I F )检测牦牛生殖器官中L C 3B 蛋白的表达㊂结果显示,本研究成功克隆了牦牛L C 3B 基因(登录号:O P 572227),构建的重组质粒p E T -32a -L C 3B 能够诱导产生重组蛋白,并且在包涵体和上清中均有表达;所纯化的牦牛L C 3B 重组蛋白大小为34k u (含T r x 和H i s 标签),符合预期结果㊂通过免疫日本大耳兔后得到的兔抗牦牛L C 3B 蛋白血清,抗体效价分别为1ʒ640000和1ʒ320000,特异性良好,表明牦牛L C 3B 蛋白多克隆抗体制备成功㊂纯化后的抗体应用于牦牛生殖器官中L C 3B 的表达检测,L C 3B 在牦牛卵巢㊁输卵管和子宫中表达,并且能识别L C 3B -Ⅰ和发生脂化后的L C 3B -Ⅱ,主要表达于细胞质及细胞核周㊂本研究通过成功克隆牦牛L C 3B 基因制备了牦牛L C 3B 多克隆抗体,使用抗体检测发现L C 3B 蛋白在牦牛生殖器官中均有表达,表明所制备的多克隆抗体特异性良好,能够应用于牦牛L C 3B 蛋白的检测和细胞自噬水平的研究㊂关键词:牦牛;L C 3B ;原核表达;多克隆抗体;生殖中图分类号:S 823.85 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)06-2436-12收稿日期:2022-10-26基金项目:国家自然科学基金(32160850);甘肃省自然科学基金(22J R 5R A 864);甘肃省重点人才项目(2022-0623-R C C -0307)作者简介:焦正兴(1998-),男,甘肃永靖人,硕士生,主要从事动物生殖生理学研究,E -m a i l :1264847838@q q .c o m *通信作者:王立斌,主要从事动物生殖生理学和胚胎工程研究,E -m a i l :w a n gl b @g s a u .e d u .c n P r e p a r a t i o n o f P o l y c l o n a l A n t i b o d y a g a i n s t Y a k L C 3B P r o t e i n a n d I t s A p pl i c a t i o n i n D e t e c t i o n o f E x p r e s s i o n i n R e p r o d u c t i v e O r ga n s J I A O Z h e n g x i n g 1,P A N Y a n g y a n g 1,2,WA N G M e n g 1,2,WA N G J i n gl e i 1,MA W e n b i n 1,G A O X i a n g 1,Z H A N G H u i 1,C U I Y a n 1,2,Y U S i ji u 1,2,WA N G L i b i n 1,2*(1.C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,G a n s u A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,L a n z h o u 730070,C h i n a ;2.T e c h n o l o g y a n d R e s e a r c h C e n t e r o f G a n s u P r o v i n c e f o r E m b r y o n i c E n g i n e e r i n g o fB o v i n e a n d S h e e p ,L a n z h o u 730070,C h i n a )A b s t r a c t :T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y w a s t o c l o n e t h e m i c r o t u b u l e a s s o c i a t e d p r o t e i n 1l i gh t c h a i n 3B (L C 3B )g e n e o f y a k a n d p r e p a r e t h e p o l y c l o n a l a n t i b o d y o f y a k L C 3B ,s o a s t o l a y af o u n d a t i o n f o r e x p l o r i ng th e r o l e o f a u t o p h a g yi n t h e r e p r o d u c t i v e p h y s i o l o g y of y a k .T h e s e q u e n c e o f y a k L C 3Bg e n e w a s o b t a i n e d b y g e n e c l o n i n g .Th e r e c o m bi n a n t p r o t e i n o f ya k L C 3B6期焦正兴等:牦牛L C3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用w a s p u r i f i e d b y p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n a n d a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y.T h e p u r i f i e d p r o t e i n w a s u s e d a s a n t i g e n t o i mm u n i z e10-m o n t h-o l d J a p a n e s e b i g-e a r w h i t e r a b b i t s.T h e p o l y c l o n a l a n t i b o d y a g a i n s t L C3B w a s p u r i f i e d a n d p r e p a r e d b y S e p h a r o s e4B c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y,a n d t h e a n t i b o d y t i t e r w a s d e t e r m i n e d b y e n z y m e l i n k e d i mm u n o s o r b e n t a s s a y(E L I S A).W e s t e r n b l o t(W B),i mm u n o h i s t o c h e m i s t r y(I H C)a n d i mm u n o f l u o r e s c e n c e(I F)w e r e u s e d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n s o f L C3B p r o t e i n i n y a k r e p r o d u c t i v e o r g a n s.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e y a k L C3B g e n e(a c c e s s i o n n u m b e r:O P572227)w a s s u c c e s s f u l l y c l o n e d.T h e c o n s t r u c t e d r e c o m b i n a n t p l a s m i d p E T-32a-L C3B i n d u c e d t h e p r o d u c t i o n o f r e c o m b i n a n t p r o t e i n a n d e x p r e s s e d i n i n c l u s i o n b o d i e s a n d s u p e r n a t a n t.T h e s i z e o f p u r i f i e d y a k L C3B r e c o m b i n a n t p r o t e i n w a s34k u(c o n t a i n i n g T r x a n d H i s t a g s).T h e r a b b i t a n t i-y a k L C3B p r o t e i n s e r u m o b t a i n e d b y i mm u n i z i n g J a p a n e s e b i g-e a r w h i t e r a b b i t s h a d a n t i b o d y t i t e r s o f1ʒ640000a n d1ʒ320000,r e s p e c t i v e l y,w i t h g o o d s p e c i f i c i t y,w h i c h s h o w e d t h a t t h e p o l y c l o n a l a n t i b o d y o f y a k L C3B p r o t e i n w a s s u c c e s s f u l l y p r e p a r e d.T h e p u r i f i e d a n t i b o d y w a s u s e d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n s o f L C3B i n t h e r e p r o d u c t i v e o r g a n s o f y a k s.I t s h o w e d t h a t L C3B w a s e x p r e s s e d i n t h e o v a r i e s,o v i d u c t s a n d u t e r u s o f t h e y a k,a n d r e c o g n i z e d L C3B-Ⅰa n d L C3B-Ⅱa f t e r l i p i d a t i o n,i t w a s l o c a t e d m a i n l y i n t h e c y t o p l a s m a n d p e r i n u c l e a r.I n c o n c l u s i o n,L C3B p o l y c l o n a l a n t i b o d y w a s p r e p a r e d s u c c e s s f u l l y b y c l o n i n g L C3B g e n e i n t h i s s t u d y,a n d t h e e x p r e s s i o n o f L C3B p r o t e i n w a s d e t e c t e d i n t h e r e p r o d u c t i v e o r g a n s.I t i s s t a t e d t h a t t h e a n t i b o d y p r e p a r e d h a s g o o d s p e c i f i c i t y a n d i t c a n b e a p p l i e d t o d e t e c t L C3B p r o t e i n i n y a k s a n d f u r t h e r s t u d y o n t h e l e v e l s o f a u t o p h a g y.K e y w o r d s:y a k;L C3B;p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n;p o l y c l o n a l a n t i b o d y;r e p r o d u c t i o n*C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:WA N G L i b i n,E-m a i l:w a n g l b@g s a u.e d u.c n自噬(a u t o p h a g y)是一种细胞内成分自我清除和自我更新的过程㊂根据底物识别和作用方式不同分为分子伴侣介导的自噬(c h a p e r o n e-m e d i a t e d a u t o p h a g y,C MA)㊁微自噬(m i c r o a u t o p h a g y)和巨自噬(m a c r o a u t o p h a g y)㊂自噬发生时,细胞内衰老或损伤的成分被具有双层膜结构的自噬体包裹,进而与溶酶体结合并降解,完成细胞内的自我清除和自我更新[1]㊂微管相关蛋白1轻链3(m i c r o t u b u l e a s s o c i a t e d p r o t e i n1l i g h t c h a i n3,L C3)蛋白是自噬发生过程中表达的重要蛋白之一,在胞浆内以L C3-Ⅰ的形式存在,自噬发生时L C3-Ⅰ与磷脂酰乙醇胺结合形成L C3-Ⅱ并定位于自噬体膜上㊂当自噬体与溶酶体结合时,自噬体内膜上的L C3-Ⅱ蛋白被降解,外膜上的L C3-Ⅱ蛋白被切割修饰后变为L C3-Ⅰ蛋白[2]㊂L C3蛋白分为A㊁B㊁C三种亚型[3],其中L C3B在自噬过程中发挥双重作用,既作为吞噬细胞形成的重要细胞因子,又作为快速m R N A降解的R N A结合蛋白[4]㊂L C3B蛋白作为自噬体膜上的标记蛋白,与自噬体的发育和成熟有关,常用来监测自噬水平[5]㊂在哺乳动物的繁殖过程中自噬参与配子的分化㊁生成及早期胚胎发育[6-9]㊂在雄性动物生殖系统中,支持细胞在生精细胞生成过程中起保护和营养作用[10]㊂据报道,自噬缺陷会影响支持细胞的骨架结构,破坏支持细胞与生精细胞联系,进而抑制精子的生成[11]㊂此外,自噬参与顶体反应,对精卵融合起着重要作用[12]㊂在雌性动物生殖系统中,自噬促进黄体细胞分泌孕酮,维持妊娠[13]㊂在子宫内膜粘连的小鼠中,子宫内膜自噬水平低,并且以子宫内膜纤维化为特征[14]㊂子宫内膜发生自噬,对胚胎植入至关重要,并且在妊娠早期发挥着重要作用[15]㊂有试验证据表明,自噬相关基因A t g16L是小鼠子宫内膜蜕膜化的必需基因[16]㊂研究发现,自噬缺陷型小鼠表现为原发性卵巢功能不全,导致生育力低下[17]㊂通过低氧诱导颗粒细胞发生自噬,可以促进颗粒细胞发生分化和黄体形成[18]㊂颗粒细胞敲除B e c l i n1构建的自噬缺陷型模型中,小鼠分泌孕酮的量显著减少,从而导致流产[13]㊂研究表明,自噬完全缺陷型胚胎停滞在4细胞到8细胞阶段,最终导致胚胎死亡,且自噬缺陷型胚胎蛋白合成率也降低了30%[19]㊂L C3B蛋白作为自噬发生的标识蛋白,在相关研究中被用来检测自噬的发生和评估自7342畜牧兽医学报54卷噬通量㊂牦牛(B o s g r u n n i e n s)是我国青藏高原重要的动物资源,也是牧民经济收入的主要来源之一㊂由于自然条件恶劣,饲养水平低下,牦牛的自然繁殖率较低,如何提高牦牛的繁殖率越来越受到重视㊂目前有关L C3B蛋白在牦牛生殖活动中作用机理的研究较少,且未见商业化的牦牛L C3B蛋白抗体㊂为了进一步研究自噬在牦牛生殖活动中的作用,本研究通过基因克隆㊁原核表达和动物免疫的方法制备牦牛特异性L C3B蛋白多克隆抗体,并应用于牦牛生殖器官中L C3B蛋白表达检测,以期为牦牛体内L C3B蛋白和繁殖过程中自噬的研究提供依据㊂1材料与方法1.1试验动物与样品采集1.1.1试验动物日本大耳白兔购自中国农业科学院兰州兽医研究所,10月龄,室内饲养,饮水充足,健康状况良好㊂1.1.2样品采集本试验中所用牦牛睾丸㊁卵巢㊁子宫㊁输卵管等样品来自于青海省某屠宰场㊂健康成年牦牛经颈动脉放血屠宰后,30m i n内采集组织样,修剪周围结缔组织后用生理盐水冲洗干净,分别储存于液氮和4%多聚甲醛溶液中运回实验室备用㊂牦牛输卵管上皮细胞样品由甘肃省牛羊胚胎工程技术研究中心提供㊂1.2主要仪器与试剂P C R仪购自德国艾本德公司,超声波细胞破碎仪购自宁波新芝生物公司,酶标仪购自美国T h e r m o公司,显微拍照仪购自日本O l y m p u s公司,T a q P C R M a s t e r M i x㊁E v o M-M L V反转录预混型试剂盒购自湖南艾科瑞生物公司,T r i z o l试剂盒㊁R I P A裂解液㊁通用型D N A纯化回收试剂盒购自北京全式金公司,p M D T M19-T V e c t o r C l o n i n g K i t㊁J M109感受态细胞均购自日本T a K a R a公司, p E T-32a载体质粒购自美国T h e r m o公司,6ˑ蛋白上样缓冲液㊁氨苄青霉素(a m p i c i l l i n,A m p)㊁5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-b r o m o-4-c h l o r o-3-i n-d o l y l-b e t a-D-g a l a c t o p y r a n o s i d e,X-g a l),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷I P T G(i s o p r o p y l-β-D-t h i o g a l-a c t o p y r a n o s i d e,I P T G)均购自北京S o l a r b i o公司, W e s t e r n b l o t所用试剂均购自武汉博士德公司, G o a t A n t i-R a b b i t I g G/H R P a n t i b o d y㊁S P试剂盒及D A B试剂盒购自北京B i o s s公司,P r o t e i n m a r k e r 购自加拿大F e r m e n t a s公司,亲和层析柱料购自美国G E H e a l t h c a r e公司,佐剂购自上海S i g m a A l d r i c h公司,感受态细胞B L21(D E3)㊁P M S F购自北京碧云天公司㊂1.3牦牛L C3B基因克隆1.3.1引物设计参照G e n B a n k公布的牛(B o s t a u r u s)L C3B基因序列(NM_001001169.1),利用P r i m e r5进行引物设计,由上海生工进行引物合成,引物序列为L C3B-F:C A C G A G C C A A C T C G C, L C3B-R:A T C G G T G A T T A G A T G A A C T,产物长度为519b p,退火温度为54ħ,用于克隆牦牛L C3B基因㊂1.3.2总R N A的提取及反转录以体外培养的牦牛输卵管上皮细胞为材料,参照T r i z o l试剂盒说明书提取牦牛输卵管上皮细胞总R N A,并进行反转录合成c D N A,-20ħ保存㊂1.3.3L C3B基因的扩增与克隆以c D N A为模板对L C3B基因进行扩增㊂反应体系为20μL: 2ˑE x p T a q H S P C R M a s t e r M i x10μL,c D N A 2μL,上㊁下游引物各0.5μL,d d H2O7μL;反应条件:95ħ5m i n;95ħ45s,54ħ30s,72ħ2m i n; 4ħ保存㊂反应结束后用1%琼脂糖凝胶进行电泳验证㊂将胶回收产物与p M D-19T v e c t o r连接转化入D H5α感受态细胞(E s c h e r i c h i a c o l i)并涂布于L B(L u r i a-B e r t a n i)固体培养基(A m p,X-g a l, I P T G),过夜培养,挑取阳性单克隆菌落接种于L B 液体培养基(A m p)摇菌16h,吸取100μL菌液并送往北京擎科生物科技有限公司测序㊂1.3.4牦牛L C3B基因生物信息学分析用N C B I-B L A S T(h t t p s:ʊb l a s t.n c b i.n l m.n i h.g o v/ B l a s t.c g i)对牦牛L C3B基因进行同源性比对;利用M E G A7.0绘制进化树;用N C B I在线软件进行开放阅读框分析(h t t p s:ʊw w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/ o r f f i n d e r);用在线软件预测L C3B蛋白的二级结构(h t t p:b i o i n f.c s.u c l.a c.u k/p s i p r e d)㊁三级结构(h t-t p s:ʊs w i s s m o d e l.E x p a s y.o r g),分析L C3B蛋白的理化性质(h t t p s:ʊw e b.e x p a s y.o r g/p r o t p a r a m),用在线软件分析L C3B蛋白亲疏水性(h t t p s:ʊw e b.e x-p a s y.o r g/p r o t s c a l e),用在线软件T M H MM S e r v e r V2.0预测跨膜结构域(h t t p:w w w.c b s.d t u.d k/s e r v i c e s/ T MHMM-2.0/)和磷酸化位点(h t t p:w w w.c b s.d t u.d k/se r v i c e s/N e t P h o s)㊂83426期焦正兴等:牦牛L C3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用1.4L C3B重组质粒的构建与原核表达测序比对正确的L C3B基因由武汉戴安生物技术有限公司合成,与表达载体p E T-32a(该载体含有T r x和H i s标签蛋白,分子量约为20k u)连接㊂将构建好的阳性质粒转化到B L21(D E3)感受态细胞,接种氨苄抗性L B培养基,过夜;挑选转化平板的4个单克隆,分别接种3m L抗性液体培养基; 37ħ,220r㊃m i n-1培养至O D600n m为0.5~0.6,加入0.5mm o l㊃L-1I P T G20ħ诱导表达3.5h;离心收集菌体,超声破碎,S D S-P A G E检测表达情况㊂1.5L C3B重组蛋白的纯化选择原核表达良好的60μL菌株接种至200m L抗性液体培养基,37ħ,220r㊃m i n-1培养过夜㊂加入新鲜抗性培养基至800m L,培养2h至O D600n m为0.5~0.6㊂加入200μL的1m o l㊃L-1 I P T G37ħ诱导表达3.5h㊂4ħ离心收集菌体(66r㊃s-1,15m i n),弃上清,加入30m L P B S T悬浮菌体,加入终浓度1mm o l㊃L-1P M S F,超声波200W破碎6m i n之后摇床4ħ孵育1h㊂4ħ高速离心(133r㊃s-1,15m i n),取上清,加入400μL于镍柱中,4ħ过夜㊂收集镍柱(33r㊃s-1,5m i n),用20mm o l㊃L-1咪唑洗脱液洗涤磁珠,洗去杂蛋白(1m L,3次)㊂加入300μL300mm o l㊃L-1咪唑洗脱液与磁珠充分结合1h,离心收集上清㊂再次向磁珠加入300μL的洗脱液,洗脱1h,离心收集上清㊂两次洗脱液合为一管,对P B S缓冲液透析换液㊂进行S D S-P A G E鉴定蛋白质㊂1.6多克隆抗体的制备及效价检测用纯化后的400μg L C3B重组蛋白与弗氏完全佐剂1ʒ1融合乳化,背部多点注射免疫日本大耳白兔,分别在第一次注射后的28㊁42㊁47㊁54d进行4次加强免疫,每次150μg㊂第四次加强免疫10d 后采集兔子血液,置于4ħ冰箱,次日离心收集血清㊂10m L抗血清与S e p h a r o s e4B亲和纯化柱过夜孵育,p H为5.0H C l洗去杂抗体,p H为2.5, 0.15m o l㊃L-1甘氨酸缓冲液洗脱,10ˑP B S缓冲液中和,制备亲和纯化抗体㊂将牦牛重组L C3B蛋白包被液稀释至1μg㊃m L-1作为抗原加至96孔板(100μL㊃孔-1)于4ħ冰箱中过夜,次日弃去孔内液体,洗涤3次,每孔加200μL封闭液,室温静置1h㊂兔抗L C3B蛋白抗体按1ʒ10000稀释后作为一抗,未注射任何免疫原的兔子血清作为阴性对照,H R P 标记的羊抗兔I g G作为二抗,一抗㊁二抗皆于37ħ孵育1h,孵育抗体前后P B S T洗涤5次㊂每孔加50μL显色液,室温显色20m i n后用50μL终止液终止显色㊂以O D450n m阳性血清/O D450n m阴性血清>2.1的最大稀释倍数为抗体效价㊂1.7W e s t e r n b l o t鉴定牦牛L C3B多克隆抗体1.7.1蛋白变性经液氮快速冷冻后的组织样品充分研磨,每100m g组织样加入1m L高效R I P A裂解液和10μL P S M F,冰浴反应3h,4ħ, 1500r㊃m i n-1离心15m i n,取上清液,与6ˑ蛋白上样缓冲液3ʒ1混合,100ħ变性10m i n后冷却至室温,-20ħ保存㊂1.7.2W e s t e r n b l o t检测牦牛L C3B蛋白抗体特异性制备12%的分离胶与5%的浓缩胶,进行S D S-P A G E,电泳后转膜至P V D F上,用5%脱脂奶粉封闭3h㊂弃去封闭液,分别以所得的兔血清和牦牛L C3B抗体为一抗(1ʒ1000),4ħ孵育12h, P B S T清洗5次,10m i n㊃次-1,H R P标记的羊抗兔抗体为二抗(1ʒ7000),室温摇床孵育1h,P B S T清洗4次,10m i n㊃次-1㊂之后在P V D F膜上滴加电化学发光液,使用化学发光仪进行检测㊂1.8L C3B蛋白在牦牛生殖器官中的表达定位经4%多聚甲醛固定的睾丸㊁卵巢㊁输卵管㊁子宫样品进行脱水后,制作石蜡切片,用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复,滴加3%H2O2溶液37ħ作用10m i n,P B S洗涤3次,3m i n㊃次-1,后滴加封闭液,室温封闭15m i n,滴加牦牛L C3B抗体(1ʒ500),阴性对照滴加P B S,4ħ孵育12h㊂P B S洗涤3次(3m i n㊃次-1),滴加二抗,37ħ作用15m i n后P B S 洗涤3次,3m i n㊃次-1,滴加三抗,37ħ作用15m i n,P B S洗涤3次㊂滴加D A B工作液显色,蒸馏水终止,苏木精复染,脱水,透明,树脂封片,观察拍照㊂1.9免疫荧光鉴定0.25%胰酶消化原代输卵管上皮细胞,用P B S 清洗输卵管上皮细胞3次,制成细胞悬液,将4ˑ105个㊃m L-1接种至有盖玻片的六孔板中,温箱培养24h,进行细胞贴壁,取出爬片,用P B S洗涤3次, 3m i n㊃次-1㊂2%多聚甲醛进行固定,洗涤后加入含有0.1%T r i t i o n-X100室温透化20m i n后,P B S洗涤3次,5m i n㊃次-1,用牛血清白蛋白(B S A)室温封闭2h,弃去封闭液,加入牦牛L C3B抗体(1ʒ500), 4ħ过夜孵育,P B S洗涤3次,5m i n㊃次-1,加入F I T C标记的二抗(1ʒ1000)室温孵育1h,P B S洗涤9342畜牧兽医学报54卷后,用D A P I染色液染核4m i n,用抗荧光淬灭剂封片后,在荧光显微镜下观察并拍照㊂2结果2.1牦牛L C3B基因克隆P C R扩增结果显示,目的条带单一且特异性良好,大小为519b p,与预期产物大小一致(图1A)㊂将纯化后的牦牛L C3B片段连接至P M D-19T载体后挑取单克隆进行菌液P C R验证(图1B),目的条带大小与普通P C R结果一致㊂后使用菌液进行测序,结果进一步提示所得序列为牦牛L C3B序列㊂测序结果已提交至G e n B a n k,登录号为:O P572227㊂A.L C3B基因P C R扩增电泳:M.D N A相对分子质量标准,1~4.牦牛L C3B基因扩增产物㊂B.单克隆菌液P C R扩增电泳:1~6.菌液P C R扩增产物A.L C3B g e n e P C R a m p l i f i c a t i o n e l e c t r o p h o r e s i s:M.D N A m a r k e r;1-4.Y a k L C3B g e n e a m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s.B.S i n g l e c o l o n y P C R a m p l i f i c a t i o n e l e c t r o p h o r e s i s:1-6.B a c t e r i a l i q u i d P C R a m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s图1牦牛L C3B基因P C R扩增电泳与菌液P C R扩增电泳F i g.1Y a k L C3B g e n e P C R a m p l i f i c a t i o n e l e c t r o p h o r e s i s a n d b a c t e r i a l i q u i d P C R a m p l i f i c a t i o n e l e c t r o p h o r e s i s2.2牦牛L C3B基因生物学信息分析2.2.1牦牛L C3B基因开放阅读框分析和进化树构建结果表明牦牛L C3B的开放阅读框全长378b p,总共编码125个氨基酸㊂系统进化树结果显示(图2),牦牛L C3B基因与普通牛(B o s t a u-r u s)㊁野牦牛(B o s m u t u s)㊁印度牛(B o s i n d i c u s)亲缘性最高㊂图2牦牛L C3B基因的系统进化树F i g.2P h y l o g e n e t i c t r e e o f y a k L C3B g e n e2.2.2牦牛L C3B蛋白理化性质分析和高级结构预测牦牛L C3B蛋白分子式为C659H1057N179O189S6,原子总数为2090,理论等电点(P I)为8.71,不稳定指数60.93,是一种不稳定蛋白㊂L C3B蛋白预测分子量大小为14.7k u,共编码19种氨基酸㊂牦牛L C3B基因编码的氨基酸中带正电的氨基酸总数为(A r g+L y s)19个,带负电的氨基酸总数为(A s p+G l u)17个,该蛋白带正电㊂牦牛L C3B基因编码的蛋白中α-螺旋共有37个氨基酸,占总数的29.6%,延伸链结构有22个氨基酸,占17.6%;无规则卷曲结构有66个氨基酸,占52.8%㊂牦牛L C3B蛋白的二级及三级结构结果如图3A㊁3B所示㊂2.2.3牦牛L C3B基因编码蛋白亲疏水性㊁跨膜结04426期焦正兴等:牦牛L C3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用构域和磷酸化位点分析牦牛L C3B蛋白为亲水性蛋白(图3C)㊂疏水性最强的为第79位的苯丙氨酸(P h e),其分值为1.556,亲水性最强的为第12位的苏氨酸(T h r),其分值为-2.867;L C3B蛋白不含跨膜区域,是非跨膜蛋白(图3D)㊂有4个丝氨酸(S e r)㊁3个苏氨酸(T h r)和1个酪氨酸(T y r)的磷酸化位点大于阈值,有成为蛋白质激酶磷酸化位点的可能(图3E)㊂A.牦牛L C3B蛋白二级结构预测;B.牦牛L C3B蛋白的三级结构;C.牦牛L C3B蛋白亲疏水性分析;D.牦牛L C3B蛋白跨膜结构域分析;E.牦牛L C3B蛋白磷酸化位点分析A.S e c o n d a r y s t r u c t u r e p r e d i c t i o n o f y a k L C3B p r o t e i n;B.T h e t e r t i a r y s t r u c t u r e p r o t e i n o f y a k L C3B p r o t e i n;C.H y d r o p h o-b i c i t y a n a l y s i s o f y a k L C3B p r o t e i n;D.A n a l y s i s o f t r a n s m e m b r a n e d o m a i n s o f y a k L C3B p r o t e i n;E.P h o s p h o r y l a t i o n s i t e s a n a l y s i s o f L C3B p r o t e i n i n y a k图3牦牛L C3B蛋白生物学信息分析F i g.3B i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s o f y a k L C3B p r o t e i n1442畜牧兽医学报54卷2.3重组质粒的构建及重组蛋白表达对重组质粒用B a m HⅠ和P s tⅠ进行双酶切验证,结果显示成功构建了p E T32a-L C3B重组质粒(图4A)㊂诱导蛋白表达结果如图4B所示,上清液和包涵体中都有牦牛L C3B重组蛋白的表达,大小为34k u,其中T r x标签蛋白大小约为20k u ㊂A.重组质粒双酶切验证:M.D N A相对分子质量标准;1.双酶切产物;2.p E T32a-L C3B重组质粒㊂B.重组质粒诱导表达: M.蛋白质量分子标准;1~4.全菌液诱导表达A.D o u b l e e n z y m e d i g e s t i o n v e r i f i c a t i o n o f r e c o m b i n a n t p l a s m i d:M.5000D N A M a r k e r;1.D o u b l e d i g e s t i o n p r o d u c t;2. p E T32a-L C3B r e c o m b i n a n t p l a s m i d.B.R e c o m b i n a n t p l a s m i d i n d u c e d e x p r e s s i o n:M.P r o t e i n m a s s m o l e c u l a r s t a n d a r d;1-4.W h o l e c e l l i n d u c e d e x p r e s s i o n图4重组质粒双酶切验证与诱导表达F i g.4V e r i f i c a t i o n a n d i n d u c e d e x p r e s s i o n o f r e c o m b i n a n t p l a s m i d b y d o u b l e d i g e s t i o n2.4牦牛L C3B蛋白的纯化使用亲和层析法纯化牦牛L C3B重组蛋白,咪唑洗脱液洗脱镍柱中的蛋白,S D S-P A G E检测结果显示(图5A),大约在34k u处出现较为单一的条带,表明纯化后的蛋白为牦牛L C3B重组蛋白,与预期结果一致㊂透析牦牛L C3B重组蛋白后经S D S-P A G E分析,获得3m g纯化蛋白(图5B)㊂A.上清诱导纯化蛋白S D S-P A G E:M.蛋白质量分子标准;1.300mm o l㊃L-1咪唑洗脱液一;2.300mm o l㊃L-1咪唑洗脱液二;3.B e a d s样㊂B.透析后蛋白S D S-P A G E:M.蛋白质量分子标准;1.B S A上样;2.透析后蛋白A.T h e s u p e r n a t a n t i n d u c e d p u r i f i e d p r o t e i n S D S-P A G E:M.P r o t e i n m a s s m o l e c u l a r s t a n d a r d;1.300mm o l㊃L-1i m i d a z o l e e l u e n t o n e;2.300mm o l㊃L-1i m i d a z o l e e l u e n t t w o;3.B e a d s.B.P o s t-d i a l y s i s p r o t e i n S D S-P A G E:M.P r o t e i n m a s s m o-l e c u l a r s t a n d a r d;1.B S A l o a d i n g;2.P r o t e i n a f t e r d i a l y s i s图5牦牛L C3B重组蛋白纯化F i g.5P u r i f i c a t i o n o f y a k L C3B r e c o m b i n a n t p r o t e i n24426期焦正兴等:牦牛L C 3B 蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用2.5 多克隆抗体的制备及鉴定根据O D 450n m 阳性血清/O D 450n m 阴性血清>2.1的最大稀释倍数为抗体效价,本试验制备的抗体效价为1ʒ640000㊁1ʒ320000(表1,图6A )㊂制备的血清(含T r x 和H i s 标签)能与牦牛L C 3B 蛋白发生特异性反应(图6B ),并且能识别L C 3B -Ⅰ(36k u )和脂化的后的L C 3B -Ⅱ(34k u )蛋白,表明该蛋白多克隆抗体特异性良好,可用于后续试验㊂表1 不同稀释度O D 450n m 值T a b l e 1 O D 450n m va l u e s o f d i f f e r e n t d i l u t i o n s 吸光值A b s o r b a n c e10K 20K 40K 80K 160K 320K 640K 1280K 2560K 5120K 10240K 阴性N e g a t i v e 1#兔多抗1#r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y1.0450.9860.8600.6720.4980.3610.2230.1450.1030.0700.0690.0582#兔多抗2#r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y1.0180.8970.7140.5150.3360.2200.1390.1000.0830.0710.0650.053A.不同稀释度的O D 450n m 值;B .免疫后血清特异性验证:1.卵巢;2.输卵管;3.子宫A.O D 450n m va l u e s o f d i f f e r e n t d i l u t i o n s ;B .V e r i f i c a t i o n o f s e r u m s p e c i f i c i t y a f t e r i mm u n i z a t i o n :1.O v a r y ;2.O v i d u c t ;3.U t e r u s图6 多克隆抗体效价及特异性检测F i g .6 P o l y c l o n a l a n t i b o d y t i t e r a n d s p e c i f i c i t y de t e c t i o n 2.6 兔抗牦牛L C 3B 多克隆抗体应用2.6.1 W e s t e r n b l o t 检测L C 3B 在牦牛睾丸㊁卵巢㊁输卵管和子宫中的表达 牦牛L C 3B 纯化抗体能与牦牛蛋白发生特异性反应,并且能够识别L C 3B 蛋白,包括L C 3B -I (16k u )和脂化后的L C 3B -I I (14k u ),与预测的牦牛L C 3B 蛋白大小一致(图7)㊂1.睾丸;2.卵巢;3.输卵管;4.子宫1.T e s t i s ;2.O v a r y;3.O v i d u c t ;4.U t e r u s 图7 W e s t e r n b l o t 检测L C 3B蛋白在牦牛生殖器官中的表达F i g .7 E x p r e s s i o n o f L C 3B p r o t e i n i n y a k r e p r o d u c t i v e o r ga n s d e t e c t e db y We s t e r n b l o t 2.6.2 免疫组织化学和免疫荧光染色检测L C 3B蛋白在牦牛生殖器官中的分布 L C 3B 蛋白在牦牛睾丸㊁卵巢㊁输卵管㊁子宫均有阳性表达㊂在睾丸中,主要表达于精子细胞(S P )㊁间质细胞(I C )㊁支持细胞(S C );在卵巢中,主要表达于黄体细胞(C L )㊁颗粒层(S G )和卵泡膜(T F );在输卵管中,主要表达于黏膜上皮(E M );在子宫中,主要表达于子宫腺(U G )和子宫内膜(E N )(图8)㊂免疫荧光显示,L C 3B 蛋白主要表达于牦牛输卵管上皮细胞的细胞核周和细胞质中(图9)㊂3 讨 论本试验通过基因克隆,获得了大小为519b p 的牦牛L C 3B 基因,该序列已提交至G e n B a n k ,登录号为:O P 572227㊂对牦牛L C 3B 基因序列在线比对3442畜 牧 兽 医 学 报54卷a ㊁b ㊁c .睾丸;d ㊁e ㊁f .卵巢;g ㊁h ㊁i .输卵管;j ㊁k ㊁l .子宫㊂a ㊁b ㊁d ㊁e ㊁g ㊁h ㊁j ㊁k 为阳性表达;c ㊁i ㊁l 为阴性对照㊂S P .精子细胞;S C .支持细胞;I C .间质细胞;S T.生精小管;S G.颗粒层;T F .卵泡膜;C L .黄体细胞;E M.黏膜上皮;U G.子宫腺;E N.子宫内膜a ,b ,c .T e s t i s ;d ,e ,f .O v a r y ;j ,h ,i .F a l l o p i a n t u b e ;j ,k ,l .U t e r u s .a ,b ,d ,e ,g ,h ,j ,k a r e p o s i t i v e e x p r e s s i o n ;c ,i ,l a r e n e g a t i v e c o n t r o l .S P .S pe r m c e l l s ;S C .S e r t o l i c e l l s ;I C .I n t e r s t i t i a l c e l l s ;S T.S e m i n if e r o u s t u b u l e s ;S G.G r a n u l a r l a y e r ;T F .T h e c a f o l l i c l e ;C L .L u t e a l c e l l ;E M.E p i t h e l i u m m u c o s a e ;U G.U t e r i n eg l a n d s ;E N.E n d o m e t r i u m 图8 L C 3B 蛋白在牦牛生殖器官中的分布F i g .8 D i s t r i b u t i o n o f L C 3B p r o t e i n i n y a k r e p r o d u c t i v e o r ga ns 图9 L C 3B 蛋白在牦牛输卵管上皮细胞中的分布F i g .9 D i s t r i b u t i o n o f L C 3B p r o t e i n i n o v i d u c t e pi t h e l i a l c e l l s o f y a k 44426期焦正兴等:牦牛L C3B蛋白多克隆抗体制备及在生殖器官表达检测中的应用后发现,与普通牛㊁印度牛㊁野牦牛的L C3B基因序列高度一致,体现了L C3B基因的高度保守性,这与B a e k e n等[20]的研究结果一致㊂在前人的研究中提出,L C3B蛋白可发生脂化,表现为L C3B-Ⅰ和脂化后的L C3B-Ⅱ两种形式[21]㊂本研究通过理化性质分析后发现,牦牛L C3B共编码125个氨基酸,牦牛L C3B蛋白是非跨膜性的不稳定蛋白,提示牦牛L C3B蛋白也可发生脂化㊂该蛋白有4个丝氨酸㊁3个苏氨酸和1个酪氨酸成为磷酸化位点的可能㊂N i e t o-T o r r e s等[22]认为,L C3B蛋白发生磷酸化对自噬体与细胞核周围的溶酶体结合有重要意义㊂本试验成功构建了p E T-32a-L C3B重组质粒,经原核诱导表达后进行动物免疫,获得了免疫原性良好的抗牦牛L C3B血清,经纯化后制得了牦牛L C3B多克隆抗体㊂P E T-32a载体广泛应用于自噬相关蛋白表达,是较为稳定的原核表达载体[23-24]㊂但因p E T-32a标签蛋白分子量小,不利于小分子蛋白的诱导表达,因此,添加了T r x和H i s标签,以优化诱导表达条件㊂硫氧还蛋白(T r x)增强蛋白的可溶性表达,减少蛋白的浪费㊂牦牛L C3B重组蛋白的成功制备和高水平的表达是成功制备牦牛L C3B 多克隆抗体的关键㊂对该蛋白进行纯化后,制得牦牛L C3B多克隆抗体效价达到1ʒ320000和1ʒ640000,而余振兴等[25]制备的紫贻贝L C3B抗体效价仅为1ʒ25600,表明本研究所制备的兔抗牦牛L C3B多克隆抗体具有较高的灵敏性㊂通过W e s t e r n b l o t检测,本试验制备的牦牛L C3B多克隆抗体能正常识别L C3B蛋白,并且能够识别L C3B-Ⅰ和脂化后的L C3B-Ⅱ,证明本试验成功制备了特异性较好的牦牛L C3B蛋白抗体㊂将本试验制备的纯化抗体应用于L C3B蛋白的表达定位检测㊂W e s t e r n b l o t结果显示,L C3B在牦牛睾丸㊁卵巢㊁输卵管和子宫中均有表达,并且能够检测到L C3B-Ⅰ和脂化后的L C3B-Ⅱ蛋白㊂目前, L C3B-Ⅱ/L C3B-Ⅰ的比值常用来评估自噬[26]㊂因此,本研究结果提示所制备的兔抗牦牛L C3B多克隆抗体可用于牦牛自噬流的评估㊂免疫组织化学结果显示,L C3B蛋白在牦牛睾丸的精子细胞和支持细胞中表达㊂睾丸支持细胞在生殖细胞的存活和精子的生成中起着重要作用,与性腺的发育也有着紧密的联系[27]㊂Y i n等[28]已证实,自噬可抑制精母细胞凋亡,进而促进精子生成,说明牦牛L C3B蛋白也可能参与精子的生成过程㊂L C3B蛋白在山羊卵巢黄体类固醇生成细胞中表达[29],U l l a h等[30]检测L C3B蛋白表达,发现增强自噬可改变黄体类固醇细胞的亚细胞结构,有助于黄体功能的维持㊂本研究发现,L C3B蛋白在牦牛黄体细胞中表达,提示该蛋白可能参与牦牛孕酮的产生,与牦牛维持妊娠和调节发情和排卵有关㊂研究发现,促卵泡素(F S H)在促进卵泡发育的同时,伴有自噬的发生,在有腔卵泡中检测到L C3蛋白[31]㊂牦牛L C3B蛋白在颗粒细胞和卵泡膜中表达,说明L C3B蛋白参与牦牛卵泡的生长和发育㊂这与Z h e n g等[32]的报道一致㊂输卵管和子宫作为受精㊁早期胚胎的发育和妊娠的场所,在动物繁殖过程中起着重要作用㊂S u等[15]通过检测子宫内膜上L C3蛋白的表达,发现子宫内膜发生的自噬影响胚胎的着床㊂本研究发现,在牦牛输卵管上皮黏膜和子宫内膜中检测到了L C3B蛋白的表达,表明L C3B蛋白在卵子的输送过程㊁胚胎着床和妊娠中发挥着作用㊂总之,本研究所制备的牦牛L C3B多克隆抗体能识别牦牛L C3B蛋白,抗体特异性良好,可用于以牦牛为模型的分子试验;免疫组化和免疫荧光结果显示,L C3B在牦牛生殖器官中的表达部位与其他动物一致,提示L C3B蛋白在牦牛繁殖活动中发挥着重要作用,同时也进一步加深了对自噬在牦牛生殖生理中作用的理解㊂4结论本研究成功克隆了牦牛L C3B基因(G e n B a n k 登录号:O P572227),构建了重组质粒p E T-32a-L C3B,成功制备了特异性良好的牦牛L C3B多克隆抗体,该抗体可特异性识别牦牛L C3B蛋白㊂牦牛L C3B蛋白在睾丸㊁卵巢㊁输卵管和子宫中均有表达,且主要表达于细胞核周和细胞质中㊂研究结果提示,所制备的牦牛L C3B抗体可用于以牦牛为模型的分子试验,且发现L C3B蛋白参与牦牛生殖生理过程,为进一步研究牦牛L C3B蛋白和细胞自噬提供了基础资料㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] D E R E T I C V.A u t o p h a g y i n i n f l a mm a t i o n,i n f e c t i o n,a n d i mm u n o m e t ab o l i s m[J].I m m u n i t y,2021,54(3):437-453.[2] K UMA A,K OMA T S U M,M I Z U S H I MA N.A u t o p h a g y-m o n i t o r i n g a n d a u t o p h a g y-d e f i c i e n t m i c e[J].A u t o p h a g y,2017,13(10):1619-1628.5442畜牧兽医学报54卷[3] MA R U Y AMA T,N O D A N N.A u t o p h a g y-r e g u l a t i n gp r o t e a s e A t g4:s t r u c t u r e,f u n c t i o n,r e g u l a t i o n a n di n h i b i t i o n[J].J A n t i b i o t,2018,71(1):72-78.[4] HWA N G H J,HA H,L E E B S,e t a l.L C3B i s a nR N A-b i n d i n g p r o t e i n t o t r i g g e r r a p i d m R N Ad e g r a d a t i o n d u r i n g a u t o p h a g y[J].N a t C o mm u n,2022,13(1):1436.[5] Y O S H I I S R,M I Z U S H I MA N.M o n i t o r i n g a n dm e a s u r i n g a u t 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牛磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)酶联免疫分析(ELISA)
牛磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定牛血清，血浆及相关液体样本中肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体1(TRAIL-R1)的含量。
实验原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中牛磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)水平。
用纯化的牛磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体1(TRAIL-R1)，再与HRP标记的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体1(TRAIL-R1)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体1(TRAIL-R1)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中牛磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PCK)浓度。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×48 1×96 2-8℃保存标准品：2700ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
ELISA 检测试剂盒 说明书
本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断小鼠小鼠（（MouseMouse））肿瘤坏死因子可溶性受体肿瘤坏死因子可溶性受体ⅠⅠ（TNFsR-TNFsR-ⅠⅠ）ELISA检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。
往预先包被肿瘤坏死因子可溶性受体Ⅰ（TNFsR-Ⅰ）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。
用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的肿瘤坏死因子可溶性受体Ⅰ（TNFsR-Ⅰ）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。
3000转离心30分钟取上清。
3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。
3000转离心10分钟取上清。
5.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3.37℃恒温箱操作注意事项1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。
从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。
2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。
4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5.所有液体组分使用前充分摇匀。
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牛孕酮(P)酶联免疫分析（ELISA）
试剂盒使用说明书
本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定牛血清，血浆及相关液体样本中孕酮(P)的含量。
实验原理：
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中牛孕酮(P)水平。
用纯化的牛孕酮(P)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入孕酮(P)，再与HRP标记的孕酮(P)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP 酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的孕酮(P)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中牛孕酮(P)浓度。
试剂盒组成：
试剂盒组成48孔配置96孔配置保存
说明书1份1份
封板膜2片（48）2片（96）
密封袋1个1个
酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品：1800pmol/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液20ml×1瓶20ml×1瓶2-8℃保存
样本处理及要求：
1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上
清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心
20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程
中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/
分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞
浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5.组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
用液氮迅速冷冻保存备
用。
标本融化后仍然保持2-8℃的温度。
加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上
进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
7.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标
准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。
（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为1200pmol/L，800pmol/L，400pmol/L，200pmol/L，100pmol/L）。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待测样
品孔。
在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用。
5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此
重复5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色
15分钟.
10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。
测定应在加终止
液后15分钟以内进行。
注意事项：
1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。
一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4．请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。
如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6．底物请避光保存。
7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9．本试剂不同批号组分不得混用。
10.如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
计算：
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，
在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD
值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释
倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标
准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值
代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释
倍数，即为样品的实际浓度。
（此图仅供参考）
试剂盒性能：
1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990以上。
2.批内与批间应分别小于9%和11%
检测范围：
50pmol/L-1500pmol/L
保存条件及有效期：
1.试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月。