一株产淀粉酶_蛋白酶益生芽孢杆菌的分离与鉴定

电泳产物进行 0.8 %琼脂糖凝胶水平电泳检 测。 1 μL PCR 产物与 0.5 μL 溴酚蓝溶液混合加 样，电泳缓冲液为 1×TAE，140 V 电泳 20 min。 电 泳结束后，以 EB 染色 10 min。 UV 下观察，检测扩 增片段长度和产量。 1.6.3 DNA 序 列 测 定 与 分 析 PCR 产 物 测 序 工 作由上海英骏生物技术有限公司完成。 序列的拼 接使用 DNAMAN 软件， 并在线（http：//www.ncbi. ）与 GeneBank 中的已知序列进行 Blast
表 3 P-12 菌株的生理生化特征
特征
活性
特征
活性
D- 葡 萄 糖 产 酸
＋
生长温度 5 ℃
＋
L- 阿 拉 伯 糖 产 酸
－
生长温度 20 ℃
＋
D- 木 糖 产 酸
蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），其 16S rDNA GeneBank 登录号为 GU269268，具有产蛋白酶、淀粉酶活性。
[关键词] 芽孢杆菌；16S rDNA；鉴定
[中图分类号] S811.6
[文献标识码] A
[文章编号] 1004-3314（2010）18-0013-03
[Abstract] According to the biological qualification of Bacillus，a strain P-12 was isolated from cecal contents of the
14
中国饲料
2010 年第 18 期
孵育 10 min，取 0.1 mL 以无菌水稀释成 10-6、10-7 和 10-8 三个浓度梯度， 涂布牛 肉膏蛋白胨 平板， 37 ℃培养 24 h。 挑选菌落进行芽孢染色，染色方 法参 《农业微生物学及实验教程》（袁红莉和王贺 祥，2009）。挑选具有芽孢的菌落，利用牛肉膏蛋白 胨平板划线培养，获得单菌落。 1.4 革兰 氏 染 色 与 镜 检 获 得 的 芽 孢 杆 菌 纯 培 养接种 在牛肉膏蛋 白胨平板 上 ，37 ℃培 养 24 h。 取新鲜菌体进行革兰氏染色并镜检拍照， 染色方 法参考 《农业微生物学及实验教程》（袁红莉和王 贺祥，2009）。 1.5 细菌生理生化测定 菌株糖醇利用、产酸产 气、生长温度、pH 范围、耐盐试验、溶菌酶抗性试 验、V-P 试验、接触酶反应、卵黄反应、吲哚反应、 明胶穿刺、淀粉水解、硝酸盐还原、厌氧生长、柠檬 酸盐利用、苯丙氨酸脱氨酶活性、酪素水解和酪氨 酸水解的测定方法参考《常见细菌系统鉴定手册》 （东秀珠和蔡妙英，2001）。 1.6 16S rDNA 鉴定 1.6.1 细菌总 DNA 提取 参照丁延芹 （2004）的 方法。 1.6.2 16S rDNA 的 PCR 扩增 以 10 ng 纯 化 的 细菌总 DNA 作为模板，扩增 16S rDNA。 所用引物 为大肠杆菌 （Escherich coli）16S rDNA 基因序列 引物 P1 和 P6， 由上海英骏生物技术有限公司合 成，序列如下：
healthy Japanese Quail（Coturnix japonica） using the pour plate method.Biochemical properties and chemotaxonomy，cul-
tural characteristics，morphology，physiological of strain P-12 were studied.The results showed that phylogenetic analysis
正 向 引 物 P1：5′ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3′；
反 向 引 物 P6：5′ -TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′。
以灭菌的 ddH2O 代替模板 DNA 作为阴性对 照 ，PCR 扩 增 体 系 （25 μL）的 具 体 反 应 体 系 见 表 1，PCR 反应程序见表 2。
表 2 PCR 反应程序
过程 95 ℃预变性
94 ℃变性 58 ℃退火 72 ℃延伸 72 ℃最终延伸
时间 5 min 30 s 30 s 2.0 min 5.0 min
×30 个循环
比对分析（丁延芹，2004）。 1.7 系统发育树的构建 所测细菌 16S rDNA 全 序 列 与 GeneBank 中 已 知 芽 孢 杆 菌 模 式 菌 的 16S rDNA 全序列一起， 利用 MEGA 3.0 软件，绘 制系统发育树，并计算遗传距离。发育树中芽孢杆 菌 属 （Bacillus）菌 株 分 别 为 ： 附 琼 脂 芽 孢 杆 菌 （B.agaradhaerens）、 嗜 碱 芽 孢 杆 菌 （B.alcalophilus）、 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 （B.amyloliquefaciens）、产 氮 芽 孢 杆 菌 （B.azotoformans）、栗 褐 芽 孢 杆 菌 （B.badius）、 蜡 状芽孢杆 菌 （B.cereus）、 环 状 芽 孢 杆 菌 （B.circulans）、克氏 芽孢杆菌（B.clarkii）、克 劳氏芽孢杆 菌 （B.clausii）、 凝 结 芽 孢 杆 菌 （B.coagulans）、 苛 求 芽 孢 杆 菌 （B.fastidiosus）、坚 强 芽 孢 杆 菌 （B.firmus）、 霍氏芽孢杆菌 （B.horikoshii）、 缓病芽孢杆菌（B. lentimorbus）、迟 缓 芽 孢 杆 菌 （B.lentus）、地 衣 芽 孢 杆菌（B.licheniformis）、海洋芽孢杆菌（B.marinus）、 巨 大 芽 孢 杆 菌 （B.megaterium）、蕈 状 芽 孢 杆 菌 （B. mycoides）、巴 氏 芽 孢 杆 菌 （B.pasteurii）、短 小 芽 孢 杆 菌 （B.pumilus）、 球 形 芽 孢 杆 菌 （B.sphaericus）、 枯 草 芽 孢 杆 菌 （B.subtilis）和 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 （B. thuringiensis）。 1.8 蛋白酶活性测定 将获得的芽孢杆菌，先经 过 37 ℃培养 24 h 活化， 以牙签点接种于蛋白酶 测定平板上。 37 ℃培养 24 h，测定水解透明圈直 径（H）与菌落直径（C），计算 H/C 值。
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!"
Байду номын сангаас
[摘 要] 本 试 验 根 据 芽 孢 杆 菌 生 理 特 点 ，采 取 稀 释 平 板 法 从 健 康 日 本 鹌 鹑 （Coturnix japonica）盲 肠 内 容 物 中 分 离
获得一株芽孢杆菌 P-12，结合细菌生理生化鉴定、16S rDNA 测序和系统发育树对其进行分析。 研究表明，该菌种为
基金项目：“十一五”国家技术支撑 计 划 （2006BAD12B05）； 动物营养学国家重点实验室自主研究课题 （2004DA125184G0811） * 通讯作者
益生菌的开发提供了理论依据。 1 试验材料与方法 1.1 菌株来源 芽孢杆菌 P-12 分离于健康成年 日本鹌鹑（Coturnix japonica）盲肠内容物。 1.2 培养基 1.2.1 牛肉膏蛋白胨液体培养基 牛肉膏 3.0 g， 蛋 白 胨 10.0 g，NaCl 5.0 g， 蒸 馏 水 1000 mL，pH 7.0 ～ 7.2。 1×105 Pa 灭菌 20 min。 1.2.2 牛肉膏蛋白胨固体培养基 牛肉膏 3.0 g， 蛋 白 胨 10.0 g，NaCl 5.0 g， 琼 脂 粉 20.0 g， 蒸 馏 水 1000 mL，pH 7.0 ～ 7.2。 1×105 Pa 灭菌 20 min。 1.2.3 蛋白酶测定培养基 10 %脱脂牛奶 113 ℃ 灭菌 30 min， 与牛肉膏蛋白胨固体培养基以 1∶9 混匀，铺成平板备用。 1.2.4 淀粉酶活性测定培养基 淀粉 10 g， 蛋白 胨 10 g，酵母 5 g，NaCl 10 g，琼脂粉 20.0 g，蒸 馏 水 1000 mL，pH 7.0 ～ 7.2。 1×105 Pa 灭菌 20 min。 1.3 菌株分离与纯培养 肠道内容物 0.5 g 置于 50 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基内，37 ℃、150 r/min 富集培养 24 h。 将获得的菌悬液在 90 ℃水浴中
based on 16S rDNA sequence demonstrated that it was closely related to the genus Bacillus cereus.The accession num-
bers of its 16S rDNA sequence in GeneBank is GU269268.The bacterium had protease and amylase activity，and could
表 1 PCR 扩增体系（25 μL）
试剂 Taq 酶（0.5 U/mL） 10×Reaction buffer
dNTP Mixture 模板 DNA
正向引物（10 μmol/L） 反向引物（10 μmol/L）
ddH2O Total
添 加 量 /μL 0.25 2.5 2.0 1.0 1.0 1.0 17.25 25.0
2010 年第 18 期
中国饲料
15
1.9 淀粉酶活性测定 将获得的芽孢杆菌，先经 过 37 ℃培养 24 h 活化， 以牙签点接种于淀粉酶 测定平板上。 37 ℃培养 24 h，取出后在平板上滴 加卢哥氏碘液， 显色后测定水解透明圈直径（H） 与菌落直径（C），计算 H/C 值。 2 结果与分析 2.1 细菌形态及菌落特征 P-12 菌株在牛肉膏 蛋白胨平板上 37 ℃培养 24 h，菌落扁平、成圆形 或近圆形，表面略粗糙，乳白色（近似蜡烛颜色）， 稍带光泽，不产色素。在光学显微镜下，菌体杆状， 末端钝圆，（1.0 ～ 1.2）μm×（3.0 ～ 5.0）μm，成短链 状。革兰氏阳性，产芽孢，芽孢圆形或柱形，中生或 近中生，1.0 ～ 1.5 μm。 2.2 细菌生理生化测定 P-12 菌株的生理生化 特征见表 3。 根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯 杰氏细菌鉴定手册》（第八版）芽孢杆菌属特征，初 步鉴定 P-12 菌株为蜡状芽孢杆菌。