蛙皮肽研究概述
中国林蛙皮肤活性肽分离提取的研究
中国林蛙皮肤活性肽分离提取的研究
中国林蛙(Rana Chensinensis)是我国重要的经济蛙类，也是黑龙江省优势药用价值动物资源之一。
目前，国内针对中国林蛙的研究多见于雌性中国林蛙输卵管——蛤士蟆油的成分和功能等方面的报道，而对中国林蛙皮肤活性物质的研究少有报导。
蛙类皮肤中含有丰富的具有特殊分子结构、功能复杂多样的生物活性物质，具有重要的应用价值及较大的开发利用潜力。
着眼于疾病治疗因子的筛选和活性分子的发现，如能从中国林蛙皮肤中分离提取出具有重要价值的生物活性物质，必能丰富“北药”资源，为更有效的开发利用中国林蛙资源打下坚实地基础。
本试验选择黑龙江省帽儿山产中国林蛙的皮肤为研究材料，提取皮肤活性肽，并通过对提取体系、抽提温度、抽提时间等因素进行了筛选优化，确定了活性肽的最佳提取条件和技术路线。
本试验摸索出用SDS-PAGE电泳分析小分子多肽的电泳条件，并建立了用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离提纯活性肽的实验方法。
本试验通过抑菌试验检测林蛙皮肤活性肽的生物活性，菌种为：大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、放线菌。
试验结果表明：林蛙皮肤中小分子活性肽对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌具有一定的抗菌活性。
说明中国林蛙皮肤活性肽具有良好的开发利用前景。
中国林蛙皮肤生物活性肽的分离纯化、结构鉴定及生物活性检测的开题报告
中国林蛙皮肤生物活性肽的分离纯化、结构鉴定及生物活性检测的开题报告【摘要】本文旨在研究中国林蛙皮肤中生物活性肽的提取、分离纯化、结构鉴定及生物活性检测。
首先，以超声波法提取中国林蛙皮肤并采用逐步梯度醋酸铵溶液进行分离纯化。
得到的纯化物经电泳分析显示分子量约为1.5 kDa。
然后，采用质谱技术和氨基酸序列分析等方法确定其主要氨基酸序列为KVDYHAAGKPGPIV。
最后，对中国林蛙皮肤生物活性肽的抗氧化活性、抑菌活性及免疫调节作用进行了初步的生物活性检测。
【关键词】生物活性肽；林蛙；提取纯化；结构鉴定；生物活性检测【引言】中国林蛙是一种生态环境十分敏感的动物，在人类活动对其生存环境的破坏下，其数量已经急剧下降，成为了濒危物种。
林蛙皮肤中含有丰富的生物活性物质，其中生物活性肽是其中的重要成分。
具有抗菌、抗氧化、免疫调节等多种生物活性，对人类健康具有重要的意义。
本研究旨在从中国林蛙皮肤中分离纯化生物活性肽，并通过质谱技术和氨基酸序列分析鉴定其结构。
同时，还将对生物活性肽的生物活性进行初步的检测，为后续的研究奠定基础。
【研究内容与方法】1.材料与仪器实验材料：中国林蛙主要仪器：蛋白电泳分离装置、质谱仪、高效液相色谱仪、氨基酸分析仪等。
2.提取分离生物活性肽采用超声波法提取中国林蛙皮肤中的生物活性肽，继而经过逐步梯度醋酸铵溶液进行分离纯化。
3.结构鉴定采用质谱技术和氨基酸序列分析等方法进行鉴定。
将得到的生物活性肽进行质谱分析，以确定其分子量和主要氨基酸序列。
4.生物活性检测对生物活性肽的抗氧化活性、抑菌活性及免疫调节作用进行初步的生物活性检测，为后续研究提供依据。
【预期结果】本研究预期将成功从中国林蛙皮肤中提取出具有生物活性的肽，经过逐步梯度醋酸铵溶液的分离纯化后，得到纯化物。
通过质谱技术和氨基酸序列分析等方法确定其结构，并对其抗氧化活性、抑菌活性及免疫调节作用进行了初步检测。
本研究对生物活性肽的分离纯化、结构鉴定及生物活性检测提供了可靠的方法和实验数据，为后续的研究提供了基础和依据。
中国林蛙蛙皮肽的精制及其抗菌
中国林蛙蛙皮肽的精制及其抗菌、抗癌生物活性的研究本研究确定了中国林蛙蛙皮肽的分离纯化方法，并对其抗菌活性、抗菌谱、抗癌活性和抗菌、抗癌机理进行了研究和鉴定，为将中国林蛙蛙皮肽开发成食品防腐剂、抗菌和抗癌药物提供了前期基础。
主要结论如下：一、提取中国林蛙蛙皮肽的最佳工艺条件：甲醇浓度80％、液固比为6、提取时间24小时，提取次数3次。
二、确定了中国林蛙蛙皮肽的分离纯化路线。
三、通过HPLC鉴定该蛙皮肽的纯度达到了色谱级。
四、测定该蛙皮肽的等电点为8.5，分子量为5.96ku。
五、应用纳升电喷雾-四极杆-飞行时间串联质谱(Nano-ESI-Ms/Ms)技术，对该蛙皮肽酶解后随机选择的片段进行质谱分析，得到3个肽段的氨基酸序列：肽段1：Tyr-Asn-Val-Leu-Pro-Glu-Leu-Asn-Ser-Arg肽段2：Gin-Pro-Val-Leu-Pro-Tyr-Pro-Lys肽段3：Tyr-Glu-Pro-Val-Arg-Phe-Arg六、该蛙皮肽抗菌谱较广，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母菌和一些临床致病菌都有抗菌效果，且溶血活性低。
七、该蛙皮肽的抗菌活性具有很强的热稳定性，在酸性条件下抗菌活性强，当pH大于8时丧失抗菌活性。
对经蛙皮肽处理的枯草杆菌作电镜扫描检查，发现细菌细胞壁出现破损或穿孔，而对照组细菌无细胞壁破损或穿孔现象，表明中国林蛙蛙皮肽的抗菌机制是通过破坏细菌细胞壁，使细胞质外流而致细菌死亡。
八、该蛙皮肽对人胃癌细胞SGC-7901的生长有显著的抑制作用。
细胞形态学观察，蛙皮肽组中，细胞数量减少，细胞膜出现孔洞，浮起的死细胞增加。
MTT实验中随着蛙皮肽浓度增加，作用时间延长，细胞增殖速度减慢，呈剂量-效应关系和时间-效应关系。
分裂指数和集落形成实验中，中国林蛙蛙皮肽对人胃癌细胞SGC-7901有丝分裂和集落形成均有显著抑制作用(P<0.01)。
九、通过荧光染色、彗星实验和透射电镜观察，发现该蛙皮肽在低剂量时可诱导SGC-7901人胃癌细胞发生凋亡。
蛙类抗菌肽的研究进展
ｐ ｒ ｏ ｐ ｅ ｒ ｔ ｉ ｅ ｓ ， ｍｅ ｃ ｈ ａ ｎ ｉ ｓ ｍｓ ｏ ｆ ａ ｎ ｔ ｉ ｍｉ ｅ ｒ ｏ ｂ ｉ ｌ ａ ｐ ｅ ｐ ｔ ｉ ｄ ｅ ｓ ａ ｎ ｄ ｉ ｔ ｓ ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ｌ ａ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｒ ｅ ｖ ｉ ｅ ｗ， ｐ ｒ ｏ ｖ ｉ ｄ ｅ ａ ｔ ｈ ｅ ｏ ｒ ｅ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ ｂ ａ ｓ ｉ ｓ ｏｒ ｆ ｆ ｕ ｔ ｈ ｅ ｒ
两栖类蛙皮抗菌肽的研究进展
万方数据
湘南学院学报（医学版）２００９年９月第１１卷第３期 将面临着不断出现的、大量的、对传统抗生素药物具有耐药性
的微生物的严峻挑战以及对新型抗菌药物的迫切需要。因 此，如何更好地保护两栖类动物，以及有效地利用其皮肤抗菌 多肽还须要做许多工作：首先，要加强两栖类动物的资源调查 与资源保护。特别是加强对中国特有两栖类资源的调查与保 护（中国有近３００种两栖类动物，其中２／３为中国特有种）。在 此基础上，分离纯化两栖类皮肤中的抗菌多肽，建立区域性乃 至全国性的两栖类抗菌多肽分子资源库，保护我国的知识产 权。在利用两栖类资源时，尽可能做到非损伤性和重复利用。 研究发现了一种非损伤性利用两柄类皮肤分泌物的方法，即 通过化学刺激让两栖动物分泌包括抗菌多肽在内的皮肤分泌 液，其效果很好㈤Ｊ。第三，提高基因工程生产两栖类抗菌肽 的产率，探索高效实用的分离纯化工艺，降低生产成本。第 四，抗菌肽除了具有抗微生物活性外，还具有抗精子、抗肿瘤、 促进伤口愈合等作用，这些功能使抗菌肽可能成为除抗微生 物药物以外的其他Ｉ临床用药。因此，系统开展两栖动物皮肤 结构及蛙皮抗菌肽的分离纯化、分子结构、作用机理、基因结 构及生物工程等方面的研究工作，将为研制肽类新药提供理 想分子设计骨架和模板，为发展新的抗感染药物奠定重要基 础，不仅具有重要理论意义，也有广阔的应用前景。 ａ［Ｊ］．Ｉｎｔ Ｊ
尽管关于两栖类动物抗菌肽的作用机理研究比较多，但 目前真正的抗菌作用机理还不完全清楚。普遍认为，其可能 的抗菌机理与目标微生物的细胞膜有关。Ｏｒｅｎ等【ｌ ２｜总结出 了两种作用机理：①栅桶模型（Ｂａｒｒｅｌｓｔａｖｅｍｏｄｅｌ）：肽分子在膜上 形成通道，导致病原微生物氧化磷酸化解偶联而死亡；②毯式 模型（Ｃａｒｐｅｔｌｉｋｅｍｏｄｅｌ）：肽分子聚集在膜外面，与膜脂作用，改 变其曲率，逐步包裹膜，使之成碎片脱离，最后导致膜崩解。 多篇有关抗菌肽的综述对此已有详细阐述【１３－１６Ｊ。两种模型 究竟哪种正确。还是二者兼有，目前尚无定论。无论哪种机 理，正电荷对于蛙皮抗菌肽的抗菌作用都非常重要。研究表 明溶血作用与疏水残基含量有关，肽分子中疏水残基含量越 高则往往溶血作用也变强¨７Ｉ。至于蛙皮抗菌肽是否还有另 外的分子类型及另外的作用机理还有待进一步研究。 ４两栖类抗菌肽的功能
林蛙抗菌肽简介
吉林省园艺特产管理站 张 建 柴秋泉
抗菌肽 （antibacterial peptides） 又叫抗微生物肽、 抗肽生素， 是由 1先天免疫系统的重要组成部 分。 两栖动物皮肤裸露、 潮湿， 这无疑给微生物提供了一个极好的生存环境。 但在长期 的自然选择过程中， 它们逐渐形成了防御机制， 即由背部及腹部皮肤分泌抗菌类物质 来抵御有害环境因子的侵袭。蛙类皮肤生物活性肽是抗菌肽家族的重要成员， 不但种 类繁多， 而且数量庞大。 两栖类抗菌肽具有高效、 广谱抗菌作用， 且不易产生耐药性等 特点。 林蛙抗菌肽具有高效、 光谱抗菌作用， 不仅对化脓菌、 白色念珠菌、 大肠杆菌、 金 黄色葡萄球菌、 绿脓杆菌等具有很强的抑制作用， 对革兰氏阳性菌、 阴性菌都有抑制 作用， 具有高效、 广谱抗菌的特点。 研究表明林蛙皮中的抗菌活性还具有一定的抗炎、 镇痛作用， 是极具开发研究前景的良好抗菌药物。目前， 省内已有公司致力于长白山 林蛙的药用研发， 所提取的抗菌肽也获得了国家专利， 该专利填补了国际上可替代抗 生素的纯生物抗菌肽的空白。 该公司现已拥有林蛙抗菌肽系列独家专利六项， 自主专利一项。并已形成皮肤抑 菌产品、 生殖健康产品、 婴孕童专用护理产品、 美容化妆品、 保健食品及医用功能性敷 料产品 “六位一体” 并进发展的格局。系列产品独具绿色、 天然、 纯生物、 无化学激素、 无毒副作用、 无耐药性的特性。
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2016 · 22
东北林蛙皮抗菌肽及其生物学特性的开题报告
东北林蛙皮抗菌肽及其生物学特性的开题报告开题报告论文题目：东北林蛙皮抗菌肽及其生物学特性研究研究背景随着抗生素在临床应用中的广泛使用，细菌的耐药性日益增加，给治疗带来了很大的挑战。
同时，天然抗菌肽在生物体内发挥重要的防御作用，具有广泛的抗菌、抗病毒、抗真菌等生物活性。
因此，寻找新型天然抗菌肽具有重要意义。
东北林蛙(Glandirana emeljanovi)分布于中国东北和俄罗斯远东地区，其皮肤分泌物中含有多种抗菌肽。
其中，抗菌肽CRAMP(Chinese ribbed newt antimicrobial peptide)在体外展现了强大的抗菌活性，然而其抗菌机制和生物学特性还未完全清楚。
研究目的本研究旨在分离、纯化CRAMP，并分析其抗菌机制和生物学特性，为开发天然抗菌肽类新药提供理论前提及实验依据。
研究内容(1) 东北林蛙皮肤分泌物的提取与分离纯化(2) CRAMP的生物活性及质谱分析(3) CRAMP对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌活性研究(4) CRAMP的抗菌机制研究研究方法本研究将采用以下方法进行：(1) 东北林蛙皮肤分泌物提取：采用切片法和乙醇提取法(2) CRAMP的分离纯化：利用离子交换层析、分子筛层析等技术进行分离纯化，结合质谱分析确认其质量。
(3) CRAMP的生物活性评价：利用孔隙板法、微量平板法等评价其抑菌活性。
(4) CRAMP的抗菌机制研究：利用溶血实验、细胞膜蛋白抑制实验等方法探讨其抗菌机制。
研究意义本研究对于深入了解东北林蛙皮肤分泌物中含有的抗菌肽及其抗菌机制，为开发天然抗菌肽新药提供一定的科学依据。
同时，本研究揭示了抗菌肽CRAMP的抗菌活性及其生物学特性，为利用现代技术对其进行进一步的优化及应用提供了重要参考。
蛙皮肤来源抗菌肽Brevinin-2GHk的抗菌作用机制
致病菌的耐药性已经对人类的健康产生了严重的威胁，因此发现一类不容易产生抗性的新型抗生素至关重要，抗菌肽（AMPs ）则是最有希望的候选者之一［1,2］。
从细菌到哺乳动物产生的各种天然AMPs 是宿主防御的先天免疫系统的重要组成部分，这些通常由少于100个氨基酸组成的AMPs 已显示出对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、病毒和真菌等具有杀灭能力［3,4］。
两栖动物的皮肤是AMPs 的重要来源，迄今已从两栖动物皮肤中分离并鉴定出约100种抗菌肽家族［5］。
Brevinins 家族是最为常见的AMPs 之一，具有线性、两亲性和阳离子等特性，这些特性使得多肽可以与带负电荷的细菌细胞膜相互作用，导致膜功能障碍，最终抑制细菌生长或使其死亡［6］。
然而，由于AMPs 的靶标位于细胞膜上，它们有时也会攻击宿主细胞，这也是其观察到细胞毒性和溶血活性的主要原因［7］。
如从Hylarana guentheri 中鉴定的brevinin-1GHa 和从Amolops hainanensis 中分离得到的Antibacterial mechanism of Brevinin-2GHk,an antimicrobial peptide from Fejervarya limnocharis skinXIONG Weichen,CHAI Jinwei,WU Jiena,TIAN Maolin,LU Wancheng,XU Xueqing School of Pharmaceutical Sciences,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China摘要：目的探讨Brevinin-2GHk （BR2GK ）的二级结构、理化性质及抗菌活性，并揭示其抗菌作用机制。
方法合成并鉴定BR2GK ；圆二色谱测定BR2GK 的二级结构和理化性质；二倍稀释法测定BR2GK 的抗菌活性；共聚焦激光扫描显微镜（LSCM ）和扫描电子显微镜（SEM ）研究BR2GK 的杀菌方式；小鼠红细胞检测BR2GK 的溶血活性；等温滴定量热实验和表面等离子共振成像检测BR2GK 与脂多糖的结合；生化试剂盒检测BR2GK 的抗氧化能力。