第九章 高效液相色谱实验技术
高效液相色谱分析实验
高效液相色谱分析实验高效液相色谱(HPLC)是一种用于分离、检测和定量分析化学样品的分析技术，具有高分辨率、高灵敏度和高选择性。
在实验室中，HPLC广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全等领域。
本文将介绍HPLC的实验原理、步骤及关键技术。
一、实验原理HPLC的原理是将混合物通过高压注射，经过固定相柱进行分离。
在HPLC中，固定相柱是最重要的组成部分之一，它可以根据样品之间的化学性质选择不同的固定相柱，如反相柱、离子交换柱、手性柱等。
在HPLC实验中，样品可以通过两种方式进样，一种是自动进样器，另一种是手动进样。
进样器将样品注入进样站点后，通过高压泵将样品推入柱子中，样品在柱子中分离后，被通过光学检测器检测，进而得到分离的结果。
二、实验步骤1.样品准备：根据实验要求，准备需要进行分析的物质样品，将其溶解或稀释到适当的浓度。
2.选择柱子：根据样品的性质选择适当的固定相柱。
例如，如果样品是极性的，则选择反相柱。
3.设定实验条件：根据样品的特征和实验需求，设置高压泵的流速、检测器、柱温等参数。
4.样品进样：将样品使用自动进样器或手动进样器进行进样。
5.柱子分离：开启高压泵，将样品推入柱子中。
样品将在柱子中根据化学性质进行分离。
6.数据检测和记录：通过光学检测器检测样品的峰值，并记录分离结果。
可以使用计算机软件进行数据分析。
7.清洗和重用：实验完成后，需要对HPLC仪器进行清洗和重置，以便下次使用。
三、关键技术1.换柱：为了保证实验结果的准确性和可靠性，柱子需要定期更换。
柱子的寿命取决于样品的特性和使用情况。
2.校准标准品：在实验中使用标准品校准HPLC仪器，以确保仪器的准确性和灵敏度。
3.优化实验条件：通过改变流速、温度、柱子等实验条件，可以优化分离效果。
4.检测器选择：根据样品的性质选择合适的检测器，例如紫外检测器、荧光检测器等。
5.数据分析：使用HPLC软件对数据进行分析，生成和保存分析报告。
四、实验安全1.注意个人防护：在操作HPLC仪器时，应佩戴安全防护眼镜和手套，避免接触有害物质。
高效液相色谱实验
1、了解HPLC的结构和流程及操作方法；2、了解流动相的制备和样品溶液的制备；3、掌握该仪器的运行程序和具体操作内容；4、学会用HPLC对样品进行分析，并从图谱中获得有用数据。
二、实验原理高效液相色谱由储液器，泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动，经过反复多次的吸附—解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。
三、仪器和试剂1、仪器：美国安捷伦1200型HPLC一台（如图一）、50μL的微量注射器一个图一、常见的HPLC图2、试剂：磷酸乙腈溶液(PH=3)、重蒸水、邻氯苯甲酸1、流动相的准备 流动相只有一组：PH=3的磷酸乙腈溶液，进过脱气，用蠕动泵输送。
2、样品溶液的准备配置好邻氯苯甲酸溶液，按要求选好滤纸的孔径大小。
用低压过滤装置过滤，由于美国安捷伦1200型HPLC 配有脱气装置，因此滤液无需事先脱气就可以进行分析。
3、开机 当2完成后，开机，待色谱柱平衡。
4、基线的查看由于仪器内部压力的变化可以引起基线的不断波动，因此，需等待压力稳定后，基线平稳才能进行进样。
5、样品进样分析用微量注射器取10μL 的邻氯苯甲酸，微量注射器中不能有气泡，将微量注射器的针头插入到注射的孔时，打开微量注射阀，将邻氯苯甲酸注射进去后，迅速关闭阀门，抽出针头，等待仪器的分析结果。
6、色谱柱的清洗分析工作结束后，要清洗进样阀中的残留样品，也要用甲醇溶液来清洗色谱柱。
7、关机实验完毕后，关闭仪器和电脑。
五、实验数据及处理1、LC 参数表5-1 LC 参数数据表温度 流速 停止时间VWD 信号 后运行时间 最大压力 最小压力 25.0℃ 1.000 mL/min0.00 min236 nm0.00 min300 bar0 bar2、色谱柱参数 色谱柱柱子 柱长 柱子内径 运行压力 C18150 mm4.6mm88bar表5-2色谱柱参数表3、根据色谱分析谱图（见附页），经过注射10μL 的邻氯苯甲酸，得到了三组实验色谱图，列出谱图上的数据如下表：峰 # 保留时间/min 类型 峰宽/min 峰面积/mAU*s 峰高/mAU 峰面积/% 1 1.411VV 0.3191 76.03598 3.25529 0.3692 2 2.444 VV 0.1151 2.03350e4 2806.48608 98.7468 33.220VBA0.1189159.4780720.732140.7744表5-3 实验数据表4、理论塔板数的计算与分析已知，色谱柱长(L)、理论塔板高度(H)与理论塔板数(n)三者的关系为： n = L / H而且，理论塔板数和色谱参数之间的关系为： n = 16 ( t R / W b ) 2 = 5.54 ( t R / Y 1/2 ) 2 取第1组的数据计算可以得到： t R = 1.411 min = 84.66 sY 1/2 = 2.354(0.3191 / 4 ) =0.1878min= 11.27 s 则：n 1= 5.54 ( t R / Y 1/2 ) 2 = 313 (块)同上法，得到其他两组的理论塔板数：n 2=7227(块) n 3=11732(块)根据塔板理论，单位住长的理论塔板数越多，表明柱效越高，则可以得出，保留时间越长，色谱柱分离效能的越好。
高效液相色谱测定
高效液相色谱测定；
色谱条件与系统适用性实验：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水（25：75）为流动相；检测波长为250nm，理论板数按葛根素峰计算应不底于4000。
对照品溶液的制备：
精密称取葛根素对照品10mg，置25ml量瓶中，加30%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。
精密量取2ml，置10ml量瓶中，加30%乙醇至刻度，摇匀，即得（每1ml 中含葛根素80ug）。
供试品溶液的制备：
取本品粉末（过三号筛）约0.1g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入30%乙醇50ml，称定重量，加热回流30分钟，放冷，再称定重量，用30%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品按干燥品计算，含葛根素不得少于2.4%
1。
高效液相色谱技术
高效液相色谱技术
高效液相色谱(HPLC)技术是一种用于分离、纯化、定性和定量分析溶液中化合物的技术。
它是在液相色谱技术基础上发展起来的，具有分离能力强、分辨率高、灵敏度高、分析速度快等优点。
HPLC技术的核心是色谱柱和溶液泵。
色谱柱是分离样品的重要部分，根据不同的分离目标可以选择不同类型的柱子，例如反相柱、离子交换柱、大小分子排阻柱等。
溶液泵用于将样品溶液以一定的流速推动通过色谱柱，保持流动相的恒定。
高效液相色谱技术主要包括以下几个步骤：
1. 样品预处理：将待分析样品进行处理，如提取、浓缩、溶解等，以便于后续的分析。
2. 进样：将样品注入到进样装置中，通过自动或手动控制，精确地给定进样体积。
3. 分离：在色谱柱中根据样品分离目标的性质和柱上固定相的特性，通过流动相的带动将样品分离。
4. 检测：利用检测器检测样品的浓度或质量，并将信号转化为电信号输出。
5. 数据处理：通过对检测器输出信号的处理和计算，得到对样品的定性和定量分析结果。
高效液相色谱技术在许多领域得到广泛应用，如药学、环境监测、食品安全等。
它能够对样品中的化合物进行高效、灵敏、准确的分离和分析，为科研和工业生产提供了强有力的工具。
高效液相色谱实验报告
高效液相色谱实验报告一、实验目的。
本实验旨在通过高效液相色谱技术，对给定的混合物进行分离和分析，掌握高效液相色谱仪的操作方法，以及对不同成分的定量分析。
二、实验原理。
高效液相色谱（HPLC）是一种高效、灵敏、准确的分析技术，它利用高压泵将样品溶液以高压送入色谱柱，通过与填料相互作用而进行分离。
在色谱柱中，不同成分将因其在填料中的亲和力不同而被分离开来。
通过检测器检测各个组分的峰面积或峰高，从而进行定量分析。
三、实验步骤。
1. 样品制备，将待分析的混合物溶解于适当的溶剂中，并进行过滤处理。
2. 色谱柱准备，连接色谱柱，并进行平衡处理。
3. 仪器调试，将色谱仪的流动相、检测器等参数进行调试。
4. 样品进样，将处理好的样品通过自动进样器送入色谱柱。
5. 数据采集，通过色谱仪软件进行数据采集和记录。
6. 数据分析，根据色谱图进行各组分的峰识别和定量分析。
四、实验结果。
通过本次实验，我们成功地对给定的混合物进行了分离和定量分析。
得到了混合物中各组分的峰面积和峰高，并通过标准曲线进行了定量分析。
实验结果表明，本实验的色谱分离效果良好，各组分分离度高，定量分析结果准确可靠。
五、实验总结。
通过本次实验，我们掌握了高效液相色谱技木的基本操作方法，了解了色谱柱的选择和调试、样品的制备和进样、数据采集和分析等基本步骤。
同时，我们也认识到了高效液相色谱技术在化学分析中的重要性和广泛应用性。
希望通过今后的实验操作，能够进一步提高我们的操作技术和分析能力。
六、参考文献。
1. Skoog, D. A., Holler, F. J., & Crouch, S. R. (2017). Principles of instrumental analysis. Cengage Learning.2. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Glajch, J. L. (2011). Practical HPLC method development. John Wiley & Sons.以上就是本次高效液相色谱实验的全部内容，希望对大家有所帮助。
高效液相色谱实验报告
高效液相色谱实验报告引言：高效液相色谱(HPLC)是一种基于溶液动力学的分析方法，广泛应用于药学、化学、生物学等领域。
本实验旨在通过HPLC技术，分离和鉴定复杂混合物中的化合物，并探究其分离机制。
实验方法：1. 样品制备：取一定比例的复杂混合物样品，将其溶解于合适的溶剂中，得到均匀的样品溶液。
2. 色谱柱选择：根据样品性质和分离目标，选择合适的色谱柱和填料。
3. 流动相选择：根据样品溶解度和分离效果，选择合适的流动相组成和pH值。
4. 色谱条件设置：设置适当的进样量、流速和温度等参数，优化分析条件。
5. 样品进样：通过自动进样器将样品溶液注入色谱柱。
6. 梯度洗脱：通过调节流动相组成或浓度梯度，实现目标化合物的分离。
7. 检测器选择：根据样品性质和目标化合物的特征，选择合适的检测器。
8. 数据分析：利用色谱软件分析检测到的信号，得到峰面积和保留时间等参数。
实验结果：本实验以植物提取物为样品，以色谱柱A为分离柱，以甲醇-水（70:30）为流动相，在室温下进行HPLC分析。
优化的分析条件为：进样量为10 μL、流速为1 mL/min、检测波长为254 nm。
在色谱图中，观察到多个峰出现，对比标准品峰的保留时间和UV-Vis吸收谱与该峰相似度，结合质谱分析，成功鉴定了4种化合物：峰1为黄酮类化合物，峰2为苯丙素类化合物，峰3为生物碱类化合物，峰4为酚类化合物。
讨论：通过本实验，我们可以看到HPLC技术的优势和应用价值。
首先，HPLC可以对复杂混合物进行高效、准确的分离和定量分析，为后续鉴定提供了重要数据。
其次，HPLC操作简便，结果可靠，且可适用于不同种类的样品。
此外，优化实验条件对提高分析效果至关重要，需要通过不断试验和调整，找到最佳条件。
然而，HPLC仍存在一些局限性。
首先，HPLC分析所需的仪器设备和耗材相对昂贵，需要较高的投资成本。
其次，样品制备和前处理过程可能引入误差，影响分析结果的准确性。
高效液相色谱实验报告
联苯、甲苯、萘和菲以及它们混样的高效液相色谱分析实验目的1.熟练掌握高效液相色谱相关仪器的操作流程。
3.通过谱图分析，掌握运用谱图数据处理目标物质的方法。
一、实验原理色谱分析是运用物质在固定相和流动相两相间的分配系数不同而达到分离，它是一种分离技术，主要目的是对混合物中目标产物进行分离并定量分析的一种技术。
二、实验内容运用高效液相色谱仪测定联苯、甲苯、萘和菲以及四者混合物的色谱，熟练仪器的相关操作流程，能从检测的谱图中定性的指认四者峰的归属，并能定量的描述四者混合物中各自的相对含量。
三、实验步骤1、打开仪器电源开关，让仪器预热一段时间，此时可准备待测样品；2、待仪器运转正常，打开测试软件，先用甲醇清洗柱子（在Load状态下进样，分析时在Inject状态下）；3、进样状态下插入微量注射器，切到装填状态，注入样品，切回到进样状态。
4、点击分析按钮，输入分析的样品名；5、数据分析，通过软件查看积分面积。
五、实验结果液相色谱图0.00.51.01.52.0 2.53.0 3.54.0 4.55.0 5.56.0min0.01.02.03.04.05.06.0mV(x100)Detector A:254nm1.722/156063.034/11168863.383/7097684.037/25429775.046/7069594（2）联苯0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.5mV(x100)Detector A:254nm1.7312.5784.1475.2130.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0mV(x10)Detector A:254nm1.7213.0433.4084.0845.152（4）甲苯0.01.02.03.04.05.06.07.0min0.00.51.01.52.02.53.03.5mV(x10)Detector A:254nm1.7213.0565.193（5）菲0.01.02.03.04.05.06.07.0min0.01.02.03.04.05.06.07.0mV(x100)Detector A:254nm1.7303.4065.075谱图分析：依据各个物种标样的色谱图可以知道他们各自的出峰时间大致为：菲：5.075min ；联苯：4.147 min ；萘：3.408 min ；甲苯：3.032 min ；故此可以判断混样中出峰位置所对应的物种，5.046 min 对应为菲，4.037 min 对应为联苯，3.383 min 对应为萘，3.034 min 对应为甲苯。
高效液相实验报告
一、实验目的1. 熟悉高效液相色谱（HPLC）的基本原理和操作方法。
2. 掌握液相色谱仪的构造及其各部分的功能。
3. 学习并运用高效液相色谱法对样品进行分离和定量分析。
二、实验原理高效液相色谱法是一种利用高压液体作为流动相，通过固定相对样品进行分离和分析的技术。
其原理基于不同物质在固定相和流动相之间的分配系数差异，从而实现分离。
实验中，样品经过高压泵送入色谱柱，在流动相的作用下，不同物质在色谱柱中停留时间不同，从而实现分离。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：高效液相色谱仪、色谱柱、流动相过滤器、样品瓶、高压泵、检测器、数据工作站等。
2. 试剂：乙腈、甲醇、水、磷酸、氨水等。
四、实验步骤1. 样品准备：准确称取一定量的待测样品，用适当溶剂溶解，配制成一定浓度的溶液。
2. 流动相配置：根据实验要求，配置合适的流动相，并进行过滤。
3. 色谱柱准备：将色谱柱安装在色谱仪上，用流动相进行冲洗，去除色谱柱中的杂质。
4. 上样：将配制好的样品溶液注入色谱仪，通过高压泵送入色谱柱。
5. 分离：在流动相的作用下，样品中的各组分在色谱柱中依次流出。
6. 检测：利用检测器对流出物进行检测，记录色谱图。
7. 数据分析：利用数据工作站对色谱图进行分析，计算各组分的含量。
五、实验结果与分析1. 样品分离：实验中，样品中的各组分在色谱柱中得到了有效分离，分离效果良好。
2. 定量分析：根据标准曲线，计算各组分的含量，结果如下：| 组分名称 | 含量（%） || -------- | -------- || 组分1 | 2.5 || 组分2 | 1.8 || 组分3 | 0.9 || 组分4 | 0.5 |3. 误差分析：实验过程中，可能存在以下误差：- 仪器误差：色谱仪、检测器等仪器本身的精度和稳定性对实验结果有一定影响。
- 试剂误差：试剂的纯度和浓度对实验结果有一定影响。
- 操作误差：实验操作不规范、样品处理不当等因素可能导致误差。
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2、最好使用进祥阀进样，以防止注 射器进样时、注射隔膜碎屑堵塞柱子入 口。
3、对硅胶基键合相填科，水溶液流动 相的PH值不得超出2—8．5的范围，使温 度不宜过高。柱子在酸性或碱性条件下 使用之后，。应依次用水、甲醇清洗， 对暂时不用而需要较长时间保存的柱子， 要用纯甲清洗，柱子两端用金属螺帽封 闭，保存于干净的有机溶剂中。
4、凝胶Байду номын сангаас谱
凝胶色谱分离方法是 利用分子振动效应， 根据样品分子的大小 而进行分离。所以又 称为排斥色谱
充填剂多采用：一定 孔径的多孔性聚合物
二、LC在环保方面的应用
1、农药残留量分析 ：含氯农药 、有机 磷农药 、除虫菊
2、致癌物质 ：霉素 、亚硝胺(香烟中的 亚硝胺) 、苯并芘
3、水质分析
实验前准备工作
1．流动相溶剂的处理 2．试样溶液的制备
流动相溶剂的处理
(1) 水 将一般的蒸馏水，加入少许高锰 酸钾，在pH9—10的条件蒸馏，可用于常 规洗脱。用于梯度洗脱的水，应进行二 次蒸馏。
(2) 有机溶剂的提纯 通常用蒸馏法可除掉大 部分有紫外吸收的杂质。将溶剂通过氧化铝 或硅胶柱可除去极性化合物。氯仿中含有的 少量甲醇，可先经水洗再经蒸馏提纯。试剂 级的四氢呋喃由于含抗氧剂丁基甲苯酚而强 烈吸收紫外线，可经蒸馏除去难挥发的丁基 甲苯酚。为了防止爆炸，蒸馏终止时，在蒸 馏瓶中必须剩余一定量的液体。
1．溶剂萃取 溶剂萃取适用于待测组件为 非极性物质。在试样中加入缓冲溶液调节 pH，然后用乙醚或氯仿萃取待测组分。但 如果待测组分和蛋白质结合，在大多数情 况下；难以用萃取操作来进行分离。
2．吸附 将吸附剂直接加到试样中，或将吸 附剂填充于柱内进行吸附。亲水性物质用硅 胶吸附，而疏水性物质可用聚苯乙烯—二乙 烯基苯等类树脂吸附。
1、吸附色谱
根据填充剂吸附活性 点对样品的吸收系数 不同而分离
充填剂：硅胶
2、分配色谱
根据固定相与流动相的极性不同而分为 正相分配色谱和反相分配色谱 两者的区别如下图所示：
固定相
流动相
正相分配
极性
非极性
反相分配
非极性
极性
分配色谱
充填剂：多孔聚合物
３、离子交换色谱
是根据固定相的离子交换基和样品成分中的 离子性基进行交换来分离的
3．除蛋白质 向试样中加入三氯醋酸或丙 酮、乙腈、甲醇，蛋白质被沉淀下来，然 后经超速离心，吸取上层清液供分离测定 用。
4．超过滤 用孔径为l0×10-10一500×l0-10m 的多孔膜过滤，可除去蛋白质等高分子物 质。
HPLC的介绍及应用
一、HPLC的分离方式
1、吸附色谱 2、分配色谱 3、离子交换色谱 4、凝胶色谱
4、要防止色谱柱被振动或撞击，否 则柱内填料床层产生裂缝和空隙，会使 色谱峰出现“驼峰”或“对峰”。
5、要防止流动相逆向流动，否则将 使固定相层位移，柱效下降。
6、使用保护柱。连续注射含有未被洗 脱样品时，会使柱效下降，保留值改变。 为了延长柱寿命，在进样阀和分析柱间加 上保护柱，其长度一般为3—5cm，填充与 分析柱性质相似的表面多孔型固定相，因 此可干法填装。而且价廉、更换容易。实 验表明，使用保护柱后，除了使扩为零的 组分的塔板数减少外，其柱效下降很少。
色谱柱的再生
一般情况下，硅胶和ODS等化学键合 固定相再生是困难的。有时，采用下 述方法可能提高校效。
1、由于杂质微粒等因素，使柱上端固 定相变色，柱效下降。这时，可仔细地将 变色部分除去(约3mm左右)，再补充新的 固定香。
2、当色谱柱吸附未被洗脱成分时，柱 效将明显下降，可选择合适的溶剂进行洗 净。
高效液相色谱实验技术
一、色谱柱的保养 二、色谱柱的再生 三、实验前准备工作 四、样品处理技术
色谱柱的保养
在正常情况下，色谱柱至少可以使用 3—6个月，能完成数百次以上的分离。但 是，若操作不慎，将使色谱柱很易损坏而 不能使用。因此为了保持柱效、柱容量及 渗透性，必须对色谱柱进行仔细地保养。
1、色谱柱极易被微小的颗粒杂质培塞， 使操作压力速升高而无法使用，因此必须 将流动相仔细地蒸馏或用0.45μm孔径的滤 膜过滤。在流动相组贮槽与色谱柱间，安 装0.45μm孔径的过滤器。在柱子上端接头 处装上多孔过滤片，以防止固体颗粒进入 色谱柱中。在水溶液流动相中，细菌容易 生长，可能堵塞筛板加入0.01％NoHa能防 止能防止细菌生长。
三、LC在生化方面的应用
1、蛋白质分析 2、肽类的分析 3、核酸 4、氨基酸
四、LC在药物方面的应用
1、药品的预处理：片剂，油膏，水剂等 2、体液：血、尿、脊椎液、唾液等 3、抗菌素 ：青霉素 、甾族(激素)
(3) 溶剂的过滤和脱气 流动相溶剂在使用 前必须先用0.45ym孔径的滤膜过滤，以除 去微小颗粒，防止色谱柱堵塞。同时要进 行脱气处理，因为溶解在溶剂中的气体会 在管道、输液泵或检测池中以气泡形式逸 出，影响正常操作的进行。
样品处理技术
在某些试样中，常含有多量的蛋白质、 脂肪及糖类等物质。它们的存在，将影响组 分的分离测定，同时容易堵塞和污染色谱柱， 使柱效降低，所以常需对试样预处理。样品 的预处理方法很多，如溶剂萃取、吸附、超 速离心及超过滤等。
3 、 对 离 子 交 换 树 脂 柱 ， 先 经 1 mol／L HCI 相 1 mol NaOH 溶 液 洗 净 ， 再 以 1 — 2mol/L NaCl水溶液平衡，以超声波发生器 进行清洗，通常可获良好的效果。
4、当采用梯度洗脱时，柱在重复使用 前，用泵把几倍于柱体积的起始溶剂压经 柱子，以重新建立起始的平衡来得到再生。