鸡蛋清中提取溶菌酶方法的研究
蛋清溶菌酶提取实验报告
一、实验目的1. 了解溶菌酶的生物学特性及其在食品、医药等领域的应用价值。
2. 掌握从鸡蛋清中提取溶菌酶的方法和操作步骤。
3. 学习蛋白质分离纯化的基本原理和实验技术。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种能够水解细菌细胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1,4糖苷键的碱性酶。
它主要存在于鸟类和家禽的蛋清中，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
本实验采用盐析法从鸡蛋清中提取溶菌酶，通过改变溶液的离子强度，使溶菌酶从溶液中析出。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜鸡蛋、去离子水、硫酸铵、盐酸、pH试纸、玻璃棒、滤纸、烧杯、漏斗、电子天平、移液管、离心机、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计等。
2. 实验试剂：硫酸铵、盐酸、去离子水等。
四、实验步骤1. 鸡蛋清制备：将4-5个新鲜鸡蛋打破，分离出鸡蛋清，加入两倍体积的去离子水，搅拌拌匀，过滤杂质。
2. 盐析：向鸡蛋清溶液中加入适量硫酸铵，搅拌溶解，使硫酸铵浓度达到60%左右。
将溶液静置一段时间，使溶菌酶析出。
3. 沉淀分离：用滤纸过滤析出的沉淀，收集滤液。
4. 洗涤：向沉淀中加入少量去离子水，搅拌洗涤，去除杂质。
重复洗涤2-3次。
5. 离心：将洗涤后的沉淀转移到离心管中，以3000r/min离心10分钟，收集上清液。
6. 蛋白质浓度测定：采用紫外可见分光光度计测定上清液中蛋白质浓度。
7. 溶菌酶活性测定：采用溶菌酶活力测定试剂盒测定溶菌酶活性。
五、实验结果与分析1. 蛋白质浓度测定：上清液中蛋白质浓度为1.5mg/mL。
2. 溶菌酶活性测定：溶菌酶活性为200U/mL。
根据实验结果，从鸡蛋清中提取的溶菌酶蛋白质浓度为1.5mg/mL，活性为200U/mL，说明本实验提取的溶菌酶纯度和活性较高。
六、实验讨论1. 盐析法是一种简单、有效的蛋白质分离纯化方法，适用于溶菌酶的提取。
2. 在实验过程中，要注意控制硫酸铵的加入量，以免影响溶菌酶的活性。
蛋清溶菌酶提取技术的研究共3篇
蛋清溶菌酶提取技术的研究共3篇蛋清溶菌酶提取技术的研究1蛋清溶菌酶提取技术的研究概述在医学、食品、制药等行业中，蛋清溶菌酶（ovomucin）是一种重要的蛋白质，在不同领域中有不同的应用价值。
目前，提取蛋清溶菌酶的方法有多种，根据对目标产物的要求，选择合适的提取工艺是提高提取效率、降低成本，同时保证产品品质的关键。
传统的蛋清溶菌酶提取方法包括酸碱处理、物理打碎等方法，虽然能得到目标产物，但这种方法存在不少问题，例如操作复杂，产物纯度不高等。
近年来，一些新技术如超声波提取、微波提取等逐渐被应用到蛋清溶菌酶提取中，为蛋清溶菌酶提取研究带来了新思路和新突破。
酸碱处理法酸碱处理法是传统的蛋清溶菌酶提取方法，主要是通过对蛋清的酸碱性调节使得蛋清溶菌酶在溶液中释放。
酸碱处理法操作简单，但是由于酸碱处理对蛋清溶菌酶的结构影响较大，使其产物的纯度较低。
物理打碎法物理打碎法是另一种常用的蛋清溶菌酶提取方法，主要是通过机械力的作用使蛋清溶菌酶从细胞中释放。
其优点是成本低，但存在操作复杂、易受外界因素影响，同时产物纯度低的缺陷。
超声波提取法超声波提取法是一种新兴的蛋清溶菌酶提取技术，该方法通过超声波的力量使细胞壁破裂，从而使蛋清溶菌酶易于释放。
相比传统的提取方法，该方法具有操作简单，提取效率高，提取速度快，产物纯度优等明显优点。
微波提取法微波提取法是另一种新兴的提取技术，该方法主要是通过微波辐射使蛋清细胞壁被加热；随着温度升高，蛋清溶菌酶会逐渐释放。
该方法具有提取速度快、提取效率高等优点，但是同时由于微波剩余辐射等原因，该方法的应用还存在一些安全隐患。
总结综上所述，提取蛋清溶菌酶是目前相关行业中的重要问题之一，选择适合的提取方法具有重要的实际应用价值。
传统的方法虽然操作简单，但存在许多问题，因此越来越多的新技术被应用到该领域。
超声波提取、微波提取是比较新兴的技术，在提取效率，产物纯度等方面都具有很大的优势。
我们需要深入研究新技术在蛋清溶菌酶提取中的应用，不断探索新的提取方案，为相关行业的发展贡献力量提取蛋清溶菌酶是一个重要的问题，不仅在生命科学研究中有广泛应用，而且在食品工业、医药等领域也有着重要的应用价值。
如何从蛋清中提取溶菌酶
常用方法
• 盐析法 • 实验原理：高浓度的中性 盐溶液中存在着大量的带 电荷的盐离子，它们能中 和生物分子表面的电荷， 使之得以稳定的双电层受 损，从而破坏分子外围的 水化层；另外，大量盐离 子自身的水合作用降低了 自由水的浓度，从另一方 面压缩了水化层的浓度， 降低了它的亲水性，从而 沉淀析出。 • 离子交换法 • 实验原理：离子交换剂与 溶液中离子或离子化合物 的反应主要以离子交换方 式进行，或者借助离子交 换剂上电荷基团对溶液中 离子或离子化合物的吸附 作用进行，离子交换剂由 基质、电荷基团(或功能基 团)和反离子构成。
从蛋清中提取溶菌酶的方法
溶菌酶作用机制
• 溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶。 • 它作用于N一乙酰氨基葡萄糖胺和N一乙酰胞壁酸 之间的B一1，4糖苷键，能使某些细菌细胞中粘 多糖成分分解。因而具有溶菌能力。 • 溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，处理革 兰氏阳性细菌可得到原生质体。溶菌酶是一种无 毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用， 因此可用作食品烧杯中，边搅拌边加入蛋白质5％的 食盐粉末，促使氯化钠细粉及时溶解，以避免局部浓度过 高或沉淀于容器底部，否则会引起蛋白质的变性而产生大 量的白色沉淀．溶解后再用0．1mol／L的NaOH溶液调节 pH9．5-pH10.0。置于4℃环境中，数天后即有溶菌酶结 晶出现，将酶晶体过滤，收集结晶沉淀粉，用丙酮脱水， 真空干燥即为粗产品。将制得的粗品用pH4．6的醋酸溶 解，然后让酶液静置24小时，接着过滤除去不溶物，收集 滤液并量出体积，按每100毫升液体加5毫克NaCl的比例 加入，然后用0．1mol／L的NaOH溶液缓慢地将其pH值 调节到10．8后，低温下静置结晶。为加速结晶过程可向 酶液中加入溶菌酶晶种，待结晶完全后再倾去上清液，用 布氏漏过滤可得溶菌酶结晶。如纯度不高，可重复操作提 纯，直至达到所需的纯度为止，结晶于30—40℃得溶菌酶 产品。
鸡蛋清溶菌酶提取实验具体步骤
从鸡蛋中提取溶菌酶的步骤1.鸡蛋清样品制备及粗分离将4～5 个（为一个小组，同时两个小组共同进行试验）新鲜鸡蛋打入烧杯然后用矿泉水瓶子吸出蛋黄，分离得鸡蛋清（鸡蛋清pH 值不得小于8.0），量其体积（量筒50ml），加入两倍蛋清体积的（可用双蒸水替代）去离子水，边加边缓慢搅拌，拌匀后用两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等，然后用1 mol ／L 的HCl 溶液调pH 值至7.0 左右，再用脱脂棉过滤收集滤液。
2. 724 弱酸性阳离子交换树脂的再生及层析1.吸附：将处理好的蛋清约200 mL，加入32 g再生的724 树脂中，缓慢搅拌吸附6 h。
2.洗涤、洗脱：待分层后，将蛋清液倒去，用去离子水反复冲洗，以去除杂蛋白，滤干树脂，用等体积的0.15mol ／L pH 值为6．5 的磷酸缓冲液洗涤，加入等量的10％（NH4）2SO4溶液搅拌洗脱30 min，使溶菌酶从树脂上洗脱下来，收集洗脱液，4℃冰箱静置过夜。
第二天，有白色沉淀析出，离心（15 min，10 000r ／min）收集沉淀，沉淀物为溶菌酶粗产品浓缩1·透析除盐、去碱性蛋白：4℃条件下，用去离子水透析24 h 左右（1天）直到透析完全（用BaCl2与透析液发生反应直到没有浑浊产生为止）。
离心去除透析袋中沉淀，向透析清液中慢慢加入1 mol ／L 氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH 值上升至8．0～9．0，如有白色沉淀，即离心去除；（碱性蛋白在此pH条件下会到等电点然后就会沉淀）2·聚乙二醇浓缩：盐析物用1 倍去离子水溶解成稀糊状，装入透析袋，在装有聚乙二醇的试管中吸水浓缩，收集浓缩液；3·冷冻干燥：用3 mol ／L 盐酸调pH值至5．0，冷冻干燥，即得白色片状溶菌酶。
溶菌酶纯度检测SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法①凝胶板的制备：用30％分离胶贮液、pH 值为8.9 分离胶缓冲液、10％浓缩胶贮液、pH 值为6.7浓缩胶缓冲液、10％SDS、1％TEMED、重蒸馏水、10％APS 溶液配制而成；②溶菌酶的处理：用磷酸缓冲液制成50 μg ／mL 的溶液，取10~80 μL 点样于凝胶板上③电泳：电流为10 mA，时间4 h；④固定、染色和脱色：电泳完毕，将胶板从玻璃板上取下，分别在固定液与染色液中浸泡10～30 min，用水漂洗干净，再用脱色液脱色。
鸡蛋溶菌酶提取实验报告
一、实验目的1. 掌握鸡蛋溶菌酶的提取方法。
2. 了解溶菌酶的性质和功能。
3. 培养实验操作技能，提高实验分析能力。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种广泛存在于生物体内的碱性蛋白质，主要来源于鸟类的蛋清、哺乳动物的泪液、唾液等。
溶菌酶具有水解细菌细胞壁的作用，能够有效抑制细菌生长，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
本实验采用鸡蛋清作为溶菌酶的提取原料，通过酶解、离心、透析等步骤提取溶菌酶。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜鸡蛋、NaCl、NaOH、丙酮、硫酸铵、蒸馏水等。
2. 实验仪器：高速离心机、恒温水浴锅、玻璃棒、烧杯、漏斗、滤纸、透析袋等。
四、实验步骤1. 酶解：将新鲜鸡蛋打破，取出蛋清，加入适量的NaCl溶液（浓度为0.5mol/L），搅拌均匀，置于恒温水浴锅中，温度控制在37℃，酶解1小时。
2. 离心分离：将酶解后的溶液以3000r/min的速度离心10分钟，收集上清液。
3. 盐析：在上清液中加入适量的硫酸铵固体，搅拌溶解，使蛋白质沉淀。
静置2小时，收集沉淀。
4. 透析：将沉淀用蒸馏水洗涤，去除杂质，然后将其放入透析袋中，置于蒸馏水中，透析24小时，去除小分子物质。
5. 浓缩：将透析后的溶液在50℃下减压浓缩，使蛋白质浓度提高。
6. 纯化：将浓缩后的溶液加入适量的丙酮，使蛋白质沉淀。
静置2小时，收集沉淀。
7. 干燥：将沉淀在50℃下真空干燥，得到溶菌酶粉末。
五、实验结果与分析1. 酶解过程中，蛋清逐渐变得透明，表明溶菌酶开始释放。
2. 离心分离后，上清液中溶菌酶浓度较高，下清液中含有其他杂质。
3. 盐析过程中，蛋白质沉淀较多，表明溶菌酶在硫酸铵溶液中具有较好的溶解性。
4. 透析过程中，透析袋中的溶液逐渐变得清澈，表明小分子物质已被去除。
5. 浓缩过程中，蛋白质浓度逐渐提高，有利于后续的纯化。
6. 纯化过程中，丙酮沉淀的蛋白质较多，表明溶菌酶在丙酮中具有较好的溶解性。
7. 干燥后，得到白色粉末，表明溶菌酶已被成功提取。
鸡蛋清中溶菌酶的分离提取
鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定
进口溶菌酶，存在着价格较高，进口环节复杂等诸 多方面的限制。
国产溶菌酶工业刚刚起步，生产规模小，工业水平 落后，产品的质量与国际标准差距较大。存在提取 率低，处理量小和产品比活低等缺点。
我国是世界上最大的产蛋国家，原料来源丰富，目 前鲜蛋基本作为初级食品食用，深加工不足。而发 达国家的鲜蛋加工业可以加工较高，得到的溶菌酶纯度高，还能分离纯化经化学修饰 而失活的溶菌酶以及具活性的溶菌酶，亦能用于检测酶与底物相结合的 氨基酸残基。对于浓缩与精制微量的溶菌酶，区分天然溶菌酶和修饰酶， 或探索与底物结合的酶分子氨基酸残基状况等问题，这是很有效的方法。 缺点： 由于亲和吸附剂的制作较为复杂，成本高，而且操作难度大，限制了它 在工业上的大规模利用。
目前美国、加拿大、荷兰、法国、德国、丹麦、意 大利、日本等国家均生产溶菌酶，其产量与日俱增。 近年来，溶菌酶被用作天然防腐剂，极大的促进了 其市场需求，每年以10%的速率增长，现在市场规模 约为700吨。
我国的食品工业、精细化工业、医药工业对溶菌酶 具有较大的需求。我国于上世纪70年代采用离子交 换法生产溶菌酶。
（2）非酶学测定法： 电泳法使用历史较长，测定的溶菌酶含量包括有活 性及失去活性的溶菌酶总量。
免疫法技术的发展而产生的。此类方法灵敏度高， 为定性也较好。但是这类方法需要制备抗体，实验 条件较酶学法复杂，因此大大限制了该类方法的应 用。
盐析法
1878年Hammarster首次使用，是粗分离蛋白质的重 要方法之一。
价廉易得，分段效果比其他盐好，性质温和，即使浓 度很高时也不会影响蛋白质的生物学活性。
实际工作中将饱和硫酸铵溶液的饱和度定为100%或1。 盐析某种蛋白质成分所需的硫酸铵数量折算成100%或 1饱和度的百分之几，即称为为该蛋白盐析的饱和度。
蛋清溶菌酶分离实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握溶菌酶的提取、分离纯化技术。
2. 掌握电渗析/超滤内在耦合（EDUF）技术在分离蛋白中的应用。
3. 分析实验过程中影响分离效果的因素，优化实验条件。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种天然碱性蛋白质，具有抗菌、消炎和抗病毒等功能。
溶菌酶广泛存在于鸡蛋清中，含量丰富。
本实验采用EDUF技术，利用溶菌酶与卵白蛋白（OVA）在特定pH条件下的荷电性及分子量差异，从鸡蛋清中分离提取溶菌酶。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：鸡蛋清、PVDF100超滤膜、氯化钠、磷酸缓冲液、溶菌酶标准品等。
2. 实验仪器：电渗析/超滤装置、电子天平、pH计、分光光度计、离心机、恒温水浴锅等。
四、实验步骤1. 预处理：将鸡蛋清用4层纱布过滤，去除杂质。
2. 调节pH值：将过滤后的鸡蛋清用1 mol/L的HCl溶液调节pH值至7.0。
3. 电渗析/超滤：将调节pH值后的鸡蛋清加入EDUF装置中，设置操作电压为5.0V，原料室和回收室料液流量均为50mL/min，进行电渗析/超滤。
4. 收集溶菌酶：将电渗析/超滤后的溶液用离心机离心，收集沉淀。
5. 纯化：将沉淀用磷酸缓冲液（pH值为8.0）溶解，通过离子交换树脂纯化溶菌酶。
6. 活性测定：采用分光光度法测定溶菌酶的活性。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶回收率：在操作电压为5.0V，采用PVDF100超滤膜，原料室和回收室料液流量均为50mL/min的条件下，溶菌酶的回收率可达21.05%。
2. 溶菌酶纯度：经纯化处理后，溶菌酶的纯度可达100%。
3. 溶菌酶活性：通过分光光度法测定，溶菌酶的活性为2.30U/mg。
4. 影响分离效果的因素分析：（1）pH值：溶菌酶在pH值为8.0时活性最高，因此在纯化过程中将pH值调节至8.0。
（2）操作电压：操作电压越高，溶菌酶的回收率越高，但电压过高会导致溶菌酶变性，因此选择5.0V为最佳操作电压。
（3）超滤膜材料：PVDF100超滤膜对溶菌酶的截留效果较好，因此选择该膜材料。
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第7卷第3期大连民族学院学报V ol.7 No.3 2005年5月 JOURNAL OF DALIAN NATIONALITIES UNIVERSITY May 2005
鸡蛋清中提取溶菌酶方法的研究
大连民族学院生命科学学院2001级高威孙纯义
溶菌酶是一种有效的抗菌剂，全称为1,4-β-N-溶菌酶. 因其对人体细胞没有毒性作用，故在医学、食品科学等领域广泛应用. 蛋清中溶菌酶的含量约2‰，但杂蛋白的含量很高，使得在制取高纯度溶菌酶时操作比较复杂，成本较高. 本文介绍的方法操作简便，成本低，收率高.
1 实验材料与方法
1.1 实验材料
实验原料：新鲜的鸡蛋清.
试剂：冰醋酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、考马斯亮蓝G-250、磷酸、95%乙醇（以上试剂均为国产分析纯级），CM Sepharose FF（Parmacia公司生产）.
仪器：TDL—50B低速台式大容量离心机、752紫外可见分光光度计、TA2104H电子天平、恒温水浴锅等.
1.2 实验方法[1]
取100mL纯净水，用醋酸调pH值为3.5，水浴加热到85℃. 加入50mL新鲜蛋清，搅拌加热5min.将所得液体3000r/min离心10min，收集上清液. 将上清液加入处理好的CM Sepharose FF层析柱中，控制流速在200mL/h 左右. 吸附完毕用纯净水冲洗吸附柱，以除去杂蛋白. 用100mL 0.1mol/L的氯化钠溶液洗脱溶菌酶，流速200mL/h. 收集洗脱液，检测酶活力.
1.3 检测方法[2]
溶菌酶活力测定：将处理好的黄色小球菌用生理盐水稀释，使其在波长450nm处，吸光度在0.3~0.8之间. 用生理盐水做空白相，在比色皿中加入20μL洗脱液，然后加入3mL稀释好的菌液，于波长在λ450处，测量1min 内的吸光度下降值.
酶活力单位定义：每分钟引起ΔOD450下降0.001为一个酶活力单位. 溶菌酶活力=ΔOD450/0.001×W（W为加入溶菌酶质量）.
蛋白浓度的测定：采用考马斯亮蓝染色法. 以溶菌酶标准品为标准蛋白.
2 结果与分析
2.1 溶菌酶的提取及初步纯化
溶菌酶属于碱性蛋白酶，化学性质非常稳定，pH在3.0~7.0时其结构几乎不变，仍保持原酶活性. 在中性介质的条件下，溶菌酶能与鸡蛋清中其他蛋白质形成络合物，大大提高了其稳定性. 在这种情况下，溶菌酶的析出被抑制，但如果在该体系加入酸，降低体系pH值，就可破坏上述络合物的形成，使得溶菌酶与酸作用生成相应的盐，这样溶菌酶就可很好地被水提取. 同时，由于大多数的蛋白质分子的等电点都处在酸性或弱酸性范围内，所以也可去除部分杂蛋白，达到初步纯化的目的.
溶菌酶具有较好的热稳定性，当温度不是很高时，短时间的热处理，酶活力不会有明显的变化，而一般的杂蛋白分子会在较低的温度下变性沉淀. 将体系温度升高到85℃时，鸡蛋清中大量的其他蛋白质凝聚，而溶菌酶由于其耐热性较高则不会凝聚，仍在上清液中，这样也可以促进溶菌酶与其他蛋白质分开.
这样通过调节体系的pH值及温度，可达到从蛋清中较好地提取溶菌酶的目的.
2.2 用CM Sepharose FF高度纯化
CM Sepharose FF是弱酸性阳离子交换树脂，对溶菌酶有较高的吸附能力，与传统离子交换剂相比具有吸附速度快,能够快速洗脱的特点. 可使溶菌酶比活力由吸附前874U/mg上升到18 830U/mg，蛋白活力提高了22倍，且收率较高.
3 结论
查溶菌酶标准曲线可得洗脱液中溶菌酶的含量为1.05mg/mL，总得率为0.19%. 以黄色小球菌测定，酶活力为18 830U/mg. 所得酶活力与传统提取工艺相比纯度有较大的提高，同时具有操作简便、成本较低、收率较高、生产周期短等优点.
参考文献：
[1] 张文会，王艳辉. 离子交换法提取鸡蛋清溶菌酶[J]. 食品工业科
技，2003（6）24：57-59.
[2] 林亲录，马美湖. 鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯化[J]. 食品科学，
2002（2）23：43-46.。